Dissertations / Theses on the topic 'Tumeur des cellules de la granulosa'

Les gamètes féminines se composent d'un ovocyte, entouré par les cellules de la granulosa. Ces dernières peuvent former des Tumeurs des Cellules de la Granulosa Ovarienne (GCTs). Deux types de tumeurs sont décrits : la forme adulte (95% des cas, AGCT) ou juvénile (JGCT). Les AGCTs se caractérisent par une mutation de FOXL2 p. C134W, retrouvée dans 95% des cas ; aucun marqueur génétique n'est défini pour les JGCTs. Mes travaux de thèse se sont répartis en deux axes, fonction des deux types de tumeurs. Le premier consistait en la recherche d'un marqueur génétique commun aux JGCTs. Nous avons utilisé une approche globale de caractérisation des tumeurs et une approche par gènes candidats, orientée vers la voie PI3K/AKT/mTOR. Nous avons identifié des duplications en phase dans la protéine AKT1 dans plus de 60% de nos échantillons. Puis nous avons caractérisé les protéines mutantes d'AKT1 : elles sont enrichies à la membrane, sous forme hyper-phosphorylée et hyper-active et donnent aux cellules un phénotype membranaire hirsute. Nous avons également découvert des mutations ponctuelles, différentes d'une tumeur à l'autre. L'activité de ces mutations reste à caractériser, ainsi qu'il reste à comprendre pourquoi les duplications trouvées sont spécifiques des JGCTs. Le deuxième axe des travaux visait à mieux comprendre les mécanismes d'action de la mutation C134W de FOXL2. Nous avons créé un outil cellulaire contenant une copie de notre gène d'intérêt sous forme sauvage ou mutée, à un locus précis et invariable. L'objectif est de déterminer si la mutation C134W influe sur la liaison de la protéine à l'ADN ou si elle affecte l'interaction avec des partenaires
Female gametes consist of an oocyte surrounded by granulosa cells. These can form ovarial granulosa cells tumors (GCT). Two types of tumors are described: the adult form (95% of cases AGCT) or juvenile (JGCT). The AGCTs feature a FOXL2 mutation p. C134W, found in 95% o cases; no genetic marker is set for JGCTs. My PhD work was divided into two areas, according to the two types of tumors. The first was th search for a common genetic marker to JGCTs. We used a global approach to characterize th tumors and candidate genes approach, oriented towards the PI3K / AKT / mTOR pathway. W identified duplications in phase in the AKT1 protein in 60% of our samples. We they characterized the mutant proteins of AKT1: they are enriched in the membrane, under hyper phosphorylated and hyper-active form and give cells a shaggy membrane phenotype. We have also found point mutations, different from one tumor to another. The activity of these mutation remains to be characterized, as it is unclear why the found duplications are specific JGCTs. The second focus of the work was to better understand the mechanisms of action of the C134V mutation FOXL2. We have created a cell- tool containing a copy of our gene of interest unde wild or mutated form, at a specific and unchanging locus. The objective is to determine if tht mutation C134W influences the binding of the protein to DNA or affect the interaction witl partners

L'hormone anti-Müllérienne (AMH) est impliquée dans la différenciation sexuelle foetale des Mammifères : produite exclusivement par les gonades mâles, elle induit la régression des canaux de Müller, ébauches de l'utérus. L'AMH, dont le gène a été identifié chez plusieurs espèces, est une glycoprotéine de la superfamille des TGFβ. Elle est produite exclusivement par les cellules de Sertoli des testicules chez les mâles prépubères et, plus faiblement, par les cellules de Sertoli testiculaires et les cellules de la granulosa ovarienne chez les individus pubères et adultes. Chez la souris mâle, nous avons trouvé que le taux sérique d' AMH chute parallèlement au taux de ses ARNm, au début de la puberté. En utilisant des souris mutantes insensibles aux androgènes ou dépourvues de cellules germinales méïotiques, nous avons pu suggérer une répression par les androgènes et par la méïose et une stimulation par la FSH de la sécrétion d'AMH chez le mâle postnatal. Par ailleurs, nous avons généré des souris transgéniques pour 3,6 kb 5'-flanquantes du gène de l'AMH humaine, couplées soit à l'oncogène du virus SV40 (souris AT), soit à un minigène de l' AMH humaine. L'analyse de l'expression de ces transgènes suggère que ces 3,6 kb contiennent des régions régulatrices transcriptionnelles activées dans les cellules de Sertoli immatures et dans les cellules de la granulosa de l'adulte. Les souris AT adultes développent des tumeurs testiculaires de Sertoli et des tumeurs ovariennes de la granulosa et nous avons établi des lignées cellulaires à partir de gonades de ces souris. Par northern blot des ARN totaux, de nombreux ARNm caractéristiques des cellules de Sertoli sont détectables dans toutes les lignées testiculaires, alors que ceux de l'AMH ne le sont que dans les lignées prépubères (prétumorales). L'une d'elles (SMATl) a été clonée, a un profil d'expression génique en accord avec un état immature des cellules de Sertoli et, jusqu'à plus de 30 repiquages, sécrète de l'AMH et exprime ses ARNm. Etant le premier modèle cellulaire exprimant stablement le gène endogène de l'AMH en culture in vitro, elle devrait être utile pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des régulations de l'expression de cette hormone. Une lignée cellulaire dérivée de tumeurs ovariennes devra être caractérisée davantage pour confirmer sa différenciation de type granulosa. Nos lignées cellulaires gonadiques exprimant les ARNm du récepteur de l'AMH (AMHR-II), elles devraient être utiles pour étudier sa signalisation et les effets autocrines de l'AMH. Nos lignées cellulaires gonadiques et les souris AT servent aussi de modèles pour étudier l'intérêt de l'AMH et de l'AMHR-II comme marqueurs moléculaires des tumeurs de la granulosa de l'ovaire, qui représentent 6 à 10% des tumeurs malignes de l'ovaire chez la femme.

Ce mémoire porte sur l’analyse de la croissance folliculaire dans l’ovaire chez la vache et l’humain. La transcription des gènes dans les cellules folliculaires indique quels mécanismes moléculaires sont modulés dans le follicule. Le premier volet de ce projet, chez le bovin, avait pour but de déterminer le profil transcriptomique des follicules de taille moyenne, entre 6 et 9 mm, appartenant à la phase de développement portant les ovocytes les plus compétents. Dans le deuxième volet, réalisé avec des tissus humains, l’impact de l’administration de hCG, une hormone pré-ovulatoire, a été évalué au niveau transcriptomique dans un cycle stimulé. Pour la première fois, des indicateurs géniques sont associés spécifiquement à trois phases clés du développement folliculaire, mais plus particulièrement à la phase plateau, ou atrésie précoce, correspondant à une compétence accrue des ovocytes à produire un embryon. Ces résultats apportent une contribution importante dans la définition des mécanismes moléculaires agissant dans le développement folliculaire.
This master’s thesis focused on the analysis of follicle growth in the ovary of both cows and humans. Genes’ transcription in follicular granulosa cells indicates which molecular mechanisms are modulated in the follicle. The first part of this project, in bovine, aimed to determine the transcriptomic profile of medium-sized follicles, between 6-9 mm, belonging to the follicular phase containing the most competent oocytes. In the human facet, the impact of hCG administration, a pre-ovulatory hormone, was evaluated at the transcriptomic level in a stimulated cycle. For the first time, genic indicators are specifically associated to three key phases of follicular development, especially the plateau phase, or early atresia, which correspond to an enhanced competence of the oocyte to produce an embryo. These results are an important step towards further defining the molecular mechanisms at work during follicular development, or folliculome.

A partir de cellules de la granulosa humaine en culture, nous avons montre par une approche ultrastructurale la presence de jonctions membranaires et annulaires de type gap. Une etude basee sur le transfert de colorant fluorescent (technique de frap) a montre que les cellules sont fonctionnellement couplees et que la diffusion intercellulaire du colorant est abolie en presence d'heptanol, un bloqueur specifique des jonctions de type gap. De plus, la permeabilite des jonctions est significativement augmentee apres addition de 8-br-amp cyclique. Enfin, les cellules montrent une immunoreactivite positive pour la connexine 43, proteine constitutive des jonctions de type gap. Nous avons par la suite evalue l'importance de la voie de transduction de l'amp cyclique dans ces cellules. Pour cela, nous avons utilise une technique mise au point chez la ratte par lawrence et collaborateurs (j cell biol, 1979, 80:21). Ces auteurs ont montre que le pourcentage de cellules arrondies sous l'effet de differents agents ou hormones reflete leur capacite a augmenter l'amp cyclique intracellulaire. Nos resultats indiquent que des agents connus pour mimer l'effet de l'amp cyclique ou augmenter sa concentration intracellulaire entrainent un arrondissement cellulaire. Ces effets sont reproduits par les hormones connues pour augmenter la concentration en amp cyclique (fsh, hcg, vip), mais pas par celles agissant classiquement sur des voies de transduction independantes de l'amp cyclique (gnrh, endothelines, angiotensine ii, pgf#2#). Par ailleurs, la capacite de la fsh a arrondir les cellules est totalement abolie en presence de gnrh, de triptoreline (un agoniste du gnrh) ou d'endothelines, indiquant le role antigonadotropique de ces facteurs. Enfin, des phosphodiesterases de type iv (specifiques de la degradation de l'amp cyclique) sont presentes et fonctionnelles dans ces cellules. La regulation de la fonction ovarienne montrant une importante specificite d'espece, les cellules de la granulosa humaine constituent un excellent modele experimental pour l'etude de la physiologie et des dysfonctionnements de l'ovulation chez la femme

La regulation de l'expression du gene de l'aromatase, enzyme qui transforme les androgenes en oestrogenes, est un domaine de recherche tres actuel en physiologie ovarienne car l'oestradiol exerce d'importantes fonctions regulatrices endocrines et paracrines. En vue d'evaluer ulterieurement l'action de regulateurs potentiels de l'expression du gene de l'aromatase dans l'ovaire de lapine, nous avons mis au point une methode de mesure ultrasensible par rt-pcr de ses arn messagers. Le gene de l'aromatase de lapin n'etant pas clone, son adnc a ete prealablement etudie par une methode race pcr : deux adnc de l'aromatase ont ainsi ete mis en evidence et sequences. Le premier, d'une longueur de 2,9 kb, code pour une proteine dont la structure primaire est plus proche de celle de l'aromatase humaine que celles qui avaient ete etudiees precedemment (nous l'appelons adnc actif). Le deuxieme, d'une longueur de 1,5 kb, code pour une proteine incapable d'aromatiser les androgenes (adnc inactif) car elle ne possede pas l'indispensable zone de fixation de l'heme remplacee par une sequence intronique. Le messager actif est exprime dans des cellules de granulosa, le placenta, le tissu adipeux et l'endometre mais il est absent de l'intestin et des surrenales ; cette distribution est semblable a celle decrite chez l'homme. L'etude de l'extremite 5' de l'adnc placentaire et ovarien a montre que le lapin, comme l'homme, utilise des promoteurs tissu specifique. Une methode de mesure par rt-pcr competitif des messagers de l'aromatase a ensuite ete validee au plan analytique et applique a ces cellules de granulosa en culture : nous avons pu montrer que le messager inactif y est present en meme quantite que le messager actif. Fsh induit une augmentation tres importante et parallele du taux des messagers actifs et inactifs. En revanche, l'androstenedione induit l'augmentation moderee mais exclusive du messager actif montrant l'existence possible de regulateurs specifiques. Le lapin semble etre un animal de laboratoire de choix pour analyser la regulation de l'expression du gene de l'aromatase : la presence d'un messager inactif permet d'envisager l'etude de son role exact. La grande similitude de sequence nucleique avec l'espece humaine permet d'esperer que les mecanismes de regulation du gene puissent etre similaires dans les deux especes.

Nous avons mis au point un modele de culture de cellules de la granulosa humaines en milieu chimiquement defini. La steroidogenese a ete evaluee a partir de precurseurs radiomarques. Ceci permet d'obtenir des secretions d'estrogenes et de progestagenes proches de celles observees in vivo, ainsi qu'une bonne reponse aux stimuli gonadotropes, fsh et lh. Nous avons pu montrer que le liquide folliculaire, tres riche en progesterone, contenait des lipoproteines exclusivement de lcasse hdl mais que les cellules de la granulosa en culture utilisaient indifferemment le cholesterol hdl ou ldl comme precurseur des progestagenes. Toutefois, ces lipoproteines sont utilisees de facon differente: cholesterol libre pour les hdl, cholesterol libre et esterifie pour les ldl. Notremodele a ete ensuite utilise pour evaluer l'impact ovarien de certains medicaments. Lors d'un essai therapeutique randomise nous avbons montre que lorsqu'on stimule la croissance folliculaire avec du citrate de clomiphene (cc) on obtient des follicules plus gros et un taux d'estradolemie plus eleve que lorsqu'on utilise seulement des hmg. De plus, dans notre modele, le cc, a des concentrations proches de celles obtenues dans le plasma lors de son utilisation therapeutique, stimule de facon significative la synthese d'estradiol. Le ru486, utilise comme contragestif pour son effet anti-progesterone sur l'endometre, inhibe, dans notre modele, l'effet stimulateur de la lh sur la secretion des progestagenes. L'evaluation, par un essai therapeutique randomise, de l'interet des analogues de la lhrh dans les stimulations ovariennes en vue de fiv a montre que l'utilisation d'analogues de la lhrh permet d'obtenir de meilleurs resultats. Dans notre modele de culture cellulaire, seuls les analogues substitues en position 10 (quelle que soit la substitution en position 6) stimulent significativement la steroidogenese. Cet effet est obtenu pour des concentrations equivalentes a celles mesurees dans le plasma lors de l'utilisation therapeutique de ces molecules

Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle central dans le système immunitaire. Notre travail a consisté à utiliser ces DC pour tenter de reproduire in vitro les conditions optimales d'une réponse immunitaire antitumorale. Nous avons recherché comment apprêter les DC avec les multiples antigènes associés aux cellules de la lignée de mélanome M74 pour stimuler des lymphocytes. Différentes procédures ont été évaluées : le traitement des M74 par irradiation, par induction d'apoptose, par induction de nécrose; le traitement par le TNF alpha ou l'IFN gamma; l'opsonisation par des Immunoglobulines; la fusion entre les M74 et les DC. Ces traitements ont permis d'amplifier la prolifération des lymphocytes, et d'augmenter leur capacité cytotoxique contre les cellules M74. Des différences sont apparues dans la capacité des lymphocytes à sécréter de l'IFN gamma ainsi que dans leur spécificité vis-à-vis de l’antigène MelanA. L'induction de la nécrose des cellules M74 par le peroxyde d'hydrogène a permis d'obtenir les meilleurs résultats.

La stérilité affecte à l’heure actuelle près de 15-20 % des couples et sa prévalence est en progression depuis quatre à cinq décennies. Cette progression évolue parallèlement à la prévalence de l’épidémie d’obésité et de syndrome métabolique dans le monde. De multiples arguments physiologiques et épidémiologiques chez l’Homme soutiennent l’hypothèse de l’influence de l’homéostasie des lipides sur la fonction gonadique. En particulier, le cholestérol est un facteur clef dans la régulation de la stéroïdogenèse et de la gamétogenèse. Bien que les atteintes gonadiques semblent multifactorielles, les mécanismes moléculaires restent méconnus dans la majorité des cas. Les Liver X receptors (LXRα et β) sont des récepteurs nucléaires activés par les oxystérols. Ce sont classiquement des régulateurs du métabolisme lipidique. Plusieurs études ont démontré l’importance de ces récepteurs dans la physiologie des gonades. Ce travail identifie les rôles multiples des LXRs dans le maintien de la fertilité masculine et féminine, et décrit l’effet de l’homéostasie du cholestérol sur la maturation des cellules germinales dans le testicule et l’ovaire. Ce travail se concentre sur l’analyse comparative d’une lignée de souris ré-exprimant LXRβ (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) sous contrôle de promoteur d’AMH humain (expression spécifique dans les cellules de Sertoli dans le testicule et les cellules de granulosa dans l’ovaire) sur un fond génétique de souris Lxrαϐ-/-. L’absence d’un isoforme d LXR aboutit à des défauts spécifiques dans un type cellulaire du testicule. Néanmoins, le dysfonctionnement d’un type cellulaire est compensé. En effet, de multiples défauts sont nécessaires pour aboutir à la stérilité. LXR dans les cellules de granulosa est critique pour la maturation et la survie des ovocytes, l’ovulation, et par conséquence pour la fertilité. Ainsi, LXRβ est une cible potentielle pour réguler la fertilité féminine et la prévention de syndrome d’hyperstimulation ovarienne. Nos résultats ouvrent des perspectives pour des nouvelles cibles diagnostiques et pronostiques dans la fertilité
Sterility affects 15 % of French population and its prevalence is propagating since four or five decades. Many human physiological and epidemiological arguments support the impact of lipid homeostasis on the gonads; indeed, cholesterol is a key regulator of steroidogenesis and gametogenesis. Nevertheless, the molecular mechanisms remain hidden. Liver X receptors alpha and beta (LXRα and β) belong to the superfamily of nuclear receptors and are activated upon binding to oxysterols. LXRs are mainly implicated in cholesterol homeostasis. Increasing bulk of literature identified these non-steroid nuclear receptors as major regulators of the gonad physiology. This work uncovers previously unidentified putative roles of LXRs and ability of cholecterol excess to alter male and female germ cell maturation. Herein, we analyse a new mouse strain (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) re-expressing LXRβ under control of AMH promoter (specific to Sertoli in testis and granulosa cells in ovary) in a background of Lxrαϐ-/- mouse. Our results identify LXRs as primordial to maintain male and female fertility. They have pleotropic « non-classical » roles ranging from lipid homeostasis to the regulation of germ cell maturation and bi-directional control of steroid synthesis. If the cellular defects in the absence of LXRs within the testis are significant, they are generally compensated and consequently, single cell compartment is tolerated. Unlike the testis, LXRβ in the granulosa cells is « the regulator » of multiple mechanisms essential for follicle maturation, ovocyte survival and for controlled ovulation. LXRβ is therefore a potnetial target to regulate female fertility and to prevent ovarian hyperstimulation syndrome. Our results open the perspectives for the identification of new diagnostic and/or prognostic markers in both male and female fertility

The concept of immunosurveillance suggests that the innate and adaptative immune system eliminate developing tumors. However, tumor development is associated with important modifications of the stroma which, by multiple mechanisms, restrain the immune response notably by affecting dendritic cells (DC) recruitment and functions. My thesis project aims at deciphering how the tumor environment alters the mechanisms and pathways of DC recruitment and impairs their functions. First, we determine if the site of tumor transplantation affects tumor immunogenicity. We show that tumors transplanted in the dermis (i.d.), an environment containing multiple DC subsets, induce a protective anti-tumoral immune response and tumor rejection. By contrast, the same tumor implanted in the subcutaneous tissue (s.c), mainly containing monocytes, is not rejected. Rejection of i.d. tumor is associated with a rapid (within 2 days) recruitment of DC within the tumor and rapid migration of DC towards tumor draining lymph nodes (dLN) where they present the tumor antigens (TAA) to CD4 and CD8 T lymphocyte. These events also occur for s.c. tumors but with a delayed kinetic. Thus the kinetic of DC mobilisation is decisive for tumor immunogenicity. Analysis of the DC subpopulations (TIDC) infiltrating the i.d. or s.c. tumors at 4 days (D4) and 8 days (D8) post-tumor transplantation, revealed that the different DC subpopulations are present at similar frequencies. Based on these findings, we proposed that i.d. tumor are rapidly infiltrated by dermal DC (DDC), whereas in s.c. tumor, the absence of inflammatory signals would limit DDC recruitment. In this latter case, DC would mainly come from local differentiation of blood-born precursors of DC (pre-cDC). Local differentiation of pre-cDC within the immunosuppressor tumor environment may affect their differentiation program and functions. We found that pre-cDC infiltrate i.d. and s.c. tumors starting at D4 and their frequency increases at D8. To determine the DC origin in tumors, we use CD11c-DTR-GFP mice in which CD11c+ cells express a fusion protein constituted by the diphtheria toxin receptor (DTR) and GFP. To track DDC trafficking within tumors, we injected anti-MHCII antibody before tumor implantation and analysed MHCII+ CD11c+ DDC infiltration in tumor by biphotonic microscopy. At D3 post-tumor transplantation, the DDC infiltration was higher in i.d. than s.c. tumors. To analyse the impact of this early DDC recruitment on anti-tumor immunity, we inhibit early recruitment of DC by injection of pertussis toxin (PTX), a chemokine receptor protein G inhibitor, during the three first days of tumor development. For i.d. tumors, PTX treatment induced 60% reduction of DC recruitment starting at D4. In s.c. tumor, while this effect was observable at D3 (60% reduction) and increased to 80% at D4. These results suggest that early recruitment of DDC to i.d. tumors may be be chemokine independent. PTX treatment, which inhibits DDC migration from tumors to dLN inhibits the early TAA presentation to CD4 and CD8 T cells but did not impaired i.d. tumor rejection. Collectively, these results suggest that a first wave of DDC may infiltrate i.d. tumor. The initial wave of DDC may rapidly activate the adaptive immune system and induce protective anti-tumoral immune response. For s.c. tumor, this first wave in delayed or limited. Tumor neoangioenesis would permit an input of pre-cDC which would differentiate locally into cDC1 and cDC2. To consolidate this model we are developing new protocols to efficiently inhibit early recruitment of DDC in i.d. tumor. Moreover, to determine the DC origin and pathways of DC recruitment in tumors, we exploit several experimental approaches to directly analyse DDC migration toward i.d. and s.c. tumor
Le concept d’immunosurveillance postule que le système immunitaire inné et adaptatif élimine les tumeurs naissantes. Cependant, le développement de tumeurs est associé à des modifications importantes du stroma qui, par des mécanismes multiples, inhibent la réponse immunitaire en affectant notamment le recrutement et la fonction des cellules dendritiques (DC). Mon projet de thèse vise à préciser comment l’environnement tumoral affecte les mécanismes et les voies de recrutement des DC dans les tumeurs et leurs fonctions. Tout d’abord, nous avons déterminé si la composition en DC du tissu d’implantation affecte l’immunogénicité tumorale. Nous avons montré que les tumeurs implantées dans le derme (i.d.), un environnement riche en DC dermales (DDC), induisent une réponse anti-tumorale protectrice. En revanche, une même tumeur transplantée dans le tissu sous-cutané (s.c.), contenant principalement des monocytes, n’est pas rejetée. Le rejet des tumeurs i.d. est associé à un recrutement précoce et rapide des DC dans la tumeur (dès 2 jours post-injection) et une migration, dans les ganglions drainants (dLN), de DC qui présentent les antigènes tumoraux (TAA) aux lymphocytes T (LT) CD4+ et CD8+. Dans les tumeurs s.c. ces événements sont présents mais retardés. Ceci indique que la cinétique de mobilisation des DC est déterminante pour l’immunogénicité tumorale

Thèse (Ph.D.)--Université de Montréal, 2006.
Titre de l'écran-titre (visionné le 4 oct. 2007). "Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.) en Sciences vétérinaires (option Reproduction)" Paraît aussi en version papier et en version microforme.

La sérotonine (5-HT) est présente au niveau du fluide folliculaire humain (Bodis J 1992), et stimule la production de progestérone des cellules lutéales de la granulosa humaine ou CLGH (Bodis J 1993) par un mécanisme inconnu. Ce projet m'a été attribué afin decaractériser l'action de 5-HT sur les CLGH. Les résultats du séquençage attestent de la présence au niveau des CLGH de l'intégralité messager spécifique du récepteur h5-HT7. L'analyse par la technique de Northem blo révèle une transcription du récepteur h5-HT7 avec un taux inversement proportionnelle à la durée de culture des CLGH. La présence homogène des trois variants d'épissage, h5-HT7a, h5-HT7b et h5-HT7d a pu être démontrée au niveau des CLGH, en utilisant les techniques de RT­ PCR et de Southem blot. Le test de l'adénylate cyclase sur préparation membranaire des CLGH indique une stimulation enzymatique obtenue avec les agonistes classés ci-dessous par ordre d'affinité décroissante : 5-CT (pEC5o = 9,49 ± 0,20) > 5-MT (pEC5o = 8,09 ± 0,50 ≥ 5-HT (pEC5o = 7,97 ± 0,18) et une inhibition de la stimulation enzymatique par 5-HT avec la miansérine, la clozapine, l'amoxapine, le butaclamol et la loxapine. Ces résultats, confirmés par le test de l'AMPc directement sur les cellules, démontrent la présence fonctionnelle de récepteurs h5-HT7 au niveau des CLGH. Une régulation négative de 5-HT sur la stimulation par hCG de la production d'AMPc a été démontré au niveau des CLGH. De plus, j'ai démontré une forte concentration (Bmax = 3,41 pmol mg- 1) de sites de liaisons de 5-HT sur la membrane des CLGH, avec un pK1 = 9,49 et un pK0 = 9,48 similaires aux constantes du récepteur hS-HT7. Un synergisme avec l'ANP sur la stimulation par 5-HT de la production de progestérone des CLGH a aussi été observé. En conclusion, cette étude démontre la présence, au niveau des CLGH, des récepteurs h5- HT7a, h5-HT7b eth5-HT7d, qui, une fois activés, déclenchent la stimulation de l'adenylate cyclase, la production d'AMPc et la sécrétion de progestérone par les CLGH en culture. Ce résultat assigne pour la première fois un rôle du récepteur 5-HT7 dans la stéroïdogénèse ovarienne
The serotonin (5-HT) is present in the human follicular fluid (Bodis J 1992) and stimulates the production of progesterone from the human granulosa lutein cells or HGLC (Bodis J 1993) by an unknown mechanism. The project attributed to me consisted of characterizing the action of 5-HT on HGLC. Sequence data revealed the presence by HGLC of the entire mRNA specifie of the h5-HT7 receptor. Northem analysis confirmed a transcription ofh5-HT7 receptor from HGLC, with a rate inversely proportional to the duration of culture. I could also demonstrated the presence of the three splice variants h5-HT7a, h5-HT7b and h5-HT7ct using RT-PCR and Southem blotting. The adenylate cyclase assay on HGLC membrane preparation revealed an enzymatic stimulation obtained with agonists classified below in a rank order of affinity : 5-CT (pECso = 9,49 ± 0,20) > 5-MT (pEC5o = 8,09 ± 0,50);::: 5-HT (pEC50 = 7,97 ± 0,18) and an inhibition of 5-HT-stimulation with mianserin, clozapine, amoxapine, butaclamol and loxapine. This data, confirmed by cAMP assay directly on cells, demonstrates the functional presence of h5-HT7 receptor on hGLC. A negative regulation of 5-HT on hCG­ stimulated cAMP production could be demonstrated on the HGLC. Further, I demonstrated a high concentration of 5-HT-binding sites (Bmax = 3,41 pmol mg-1) on membrane from hGLC with pK0 = 9,48 and pK1 = 9,49 similar to the constant of the h5-HT7 receptor. A synergism with the ANP on 5-HT-stimulated progesterone production from HGLC was also observed. In conclusion, I have demonstrated within the HGLC, the presence of the h5-HT7 a, h5-HT7b and h5-HT7d , receptors that, once activated, trigger off the adenylate cyclase stimulation, cAMP production and progesterone production by cultured hGLC. This results assign for the first time an ovarian steroidogenic role to the 5- HT7 receptor

FOXL2 est un facteur de transcription central dans la différenciation et la fonction des cellules d< la granulosa. Plusieurs études transcriptomiques montrent qu'il régule un grand nombre de gènes impliqués dans des processus cellulaires variés, et une mutation somatique spécifique de FOXL2 (p. C134W) est retrouvée dans la quasi-totalité des tumeurs à cellules de la granulosa de type adulte. Nous avons montré que FOXL2 est régulé par le biais de modifications post-traductionnelles, et que son recrutement dans des corps nucléaires à PML, modulé par son état de SUMOylation, était nécessaire à sa fonction. Nous avons identifié 11 nouvelles protéines interagissant avec FOXL2 et nous avons observé que FOXL2 et certains de ses partenaires pouvaient activer l'apoptose en synergie, alors que le mutant pro-oncogénique de FOXL2 en était incapable. De nombreux partenaires de FOXL2 appartiennent à la famille des récepteurs nucléaires. Nous avons donc voulu vérifier si FOXL2 pouvait jouer un rôle général dans la détermination des cibles régulées par les récepteurs nucléaires, notamment les récepteurs aux œstrogènes et aux androgènes. Nous avons observé que FOXL2 était nécessaire à la régulation par NR2C1, ESR1, ESR2 et AR de plus de la moitié de leurs cibles transcriptionnelles, alors qu'il a peu d'influence sur les cibles régulées par NR5A1. De plus, nous avons observé que FOXL2 était nécessaire à l'induction de nombreux gènes par les oestrogènes, et que FOXL2 et ESR1 reconnaissaient une proportion importante de cibles génomiques communes. En résumé, FOXL2 apparaît comme un régulateur majeur de la réponse aux signaux pro-apoptotiques et aux stéroïdes dans les cellules de la granulosa
FOXL2 is a central transcription factor in granulosa cells differenciation and function. Several transcriptomic studies have shown that it regulates a great number of genes involved in various cellular processes, and a single specific somatic mutation of FOXL2 (p. C134W) is found in virtually ail adult-type granulosa cell tumors of the ovary. We have found that FOXL2 is highly regulated through post-translational modification and that its SUMOylation-dependent recruitment to PML Nuclear Bodies is required for its function. We identified 11 new proteins interacting with FOXL2, and we observed that FOXL2 and some of its partners could synergistically induce apoptosis. The pro-oncogenic mutation of FOXL2, however, induces a loss of FOXL2 ability to synergize with pro-apoptotic partners. A large part of FOXL2 partners are proteins belonging to the nuclear receptor family of transcription factors. We therefore tried to determine whether FOXL2 could play a general role in determining nuclear receptor transcriptional targets. We observed that FOXL2 was required for NR2C1, ESR1, ESR2 and AR regulation of more than half of their targets, whereas it was rather unnecessary for NR5A1 to regulate its targets. We observed in addition that FOXL2 was necessary for the induction by estrogen of many genes, and that FOXL2 and ESR1 were co-recruited to a number of genomic sites. In total, FOXL2 appears as a major regulator of steroid signaling as well as pro-apoptotic signaling in granulosa cells

Le cancer bronchique représente le cancer le plus fréquent dans le monde. Le tabagisme en est la principale cause. Le développement des cellules tumorales provoque une réaction stromale tissulaire contenant des cellules inflammatoires dont la majorité sont des lymphocytes infiltrant la tumeur. Dans cette étude, quatre approches ont été utilisées afin d'étudier la modulation tumeur-dépendante du système immunitaire : l'immunophénotypage du répertoire Vβ du TCR par cytométrie de flux et l'électrophorèse en gel de gradient dénaturant (DGGE/TTGE) des segments VJγ du TCR, l'exploration phénotypique des tissus sains, tumoraux et ganglionnaires en immunofluorescence sur coupes à la congélation, et l'amplification par RT-PCR de l'ARN de diverses cytokines. Les résultats obtenus montrent qu'il existe une oligoclonalité des lymphocytes T dans les tissus sains, tumoraux et ganglionnaires. Un clone Vβ13. 1 et un clone gamma semblent spécifiques des carcinomes épidermoïdes alors que deux clones gamma semblent spécifiques des adénocarcinomes. De plus, l'expression de CD3/TCR est significativement diminuée dans les tumeurs. De même, les molécules β2 microglobuline, HLA-DR et -DQ sont fortement exprimées par les pneumocytes sains mais sont peu présentes sur les cellules tumorales. Diverses cytokines ayant des effets antagonistes sont produites dans les tumeurs en particulier le TGFβ et l'IL-10 favorisant la croissance tumorale et le TNFalpha et l'IFNγ potentialisant la réponse immune anti-tumorale. En conclusion, les clones détectés dans les tissus sains pourraient être spécifiques de lésions très précoces prétumorales liées au tabac. Il semble exister des clones spécifiques des tumeurs et des types tumoraux. Cependant, la surveillance immune a été mise en échec par un certain nombre de mécanismes et en particulier la diminution d'expression des molécules impliquées dans la synapse immunologique ainsi que la sécrétion de diverses cytokines ayant des effets antagonistes
Lung cancer is the most frequent type of cancer in the world. Smoking is clearly the major cause of this pathology. The proliferation of tumor cells induces an inflammatory stromal reaction comprising numerous tumor-infiltrating lymphocytes. In this study, four complementary approaches have been used to study the tumor-dependent modulation of the immune system : TCR Vβ repertoire usage in flow cytometry, TCRγ gene clonal rearrangements in denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE/TTGE), tumor and healthy lung tissue infiltration as well as lymph nodes characteristics in immunohistology and cytokine production by RNA RT-PCR. The results obtained have demonstrated the oligoclonality of T-cells in the three types of tissues tested. A Vβ13. 1 clone and a gamma clone appeared to be specifics of epidermoid carcinoma. Similarly, two TCRγ clones appeared to be restricted to adenocarcinoma. Moreover, the CD3/TCR complex was clearly down regulated in tumors compared to healthy tissue or lymph nodes. Similarly, HLA-DR, HLA-DQ and β2 microglobuline, strongly expressed on healthy pneumocytes were nearly absent from tumor cells. Several cytokines with antagonistic effects were detected within tumoral tissue, especially TGFβ and IL-10, which favour tumor growth and TNFalpha and IFNγ which potentialize the anti-tumoral immune response. In conclusion, the clones identified in healthy lung tissue could be specific of early pre-tumoral lesions induced by tobacco smoke, and some of the clones appear to be tumor-specific. However, the immune system has been defeated by several mechanisms, including a decrease of the expression of partners of the immunological synapse and the production of antagonistic cytokines

Le pic de LH induit l’ovulation et la lutéinisation en modifiant l’expression de nombreux gènes dont le gène de l’aromatase (cyp19). La chute des trancrits de cyp19 observée in vivo chez le Lapin suite au pic de LH suggère que celui-ci pourrait moduler l’activité du promoteur ovarien (PII) de cyp19 via l’AMPc. Par transfection et mutagenèse dirigée, nous montrons, dans les cellules de granulosa et les cellules lutéales, que l’activation du PII se fait via le site majeur « cAMP responsive element like sequence » (CLS) et via des sites additionnels qui semblent moduler l’action de CLS. Cependant, dans les cellules lutéales, la réponse du PII à l’AMPc est 50% plus faible que dans les cellules de granulosa. L’expression du facteur CREB et sa liaison au site CLS ont été démontrées par western blot et EMSA dans les deux types cellulaires. En revanche, les sites NREA et NREB de fixation pour les facteurs SF-1 et LRH-1 ne sont fonctionnels ni dans les cellules de granulosa, ni dans les cellules lutéales malgré l’expression des facteurs SF-1 et LRH-1. En conséquence CLS, NREA et NREB ne semblent pas impliqués dans la chute de l’aromatase consécutive au pic de LH mais une perte de la fonctionnalité des sites additionnels pourrait être à l’origine de cette chute d’expression. Enfin, nous montrons qu’un deuxième mécanisme d’inhibition de la transcription mettant en jeu l’estradiol, réverse l’action de l’AMPc dans les cellules lutéales via probablement le récepteur β à l’estradiol. Notre étude permet donc d’ébaucher un schéma de régulation du gène de l’aromatase dans les cellules de granulosa comparativement aux cellules lutéales
The LH surge induces ovulation and luteinization by a modification of the transcritpion rate of several genes of which aromatase gene (cyp19). The decrease of cyp19 trancrit level that is observed in vivo in Rabbit after the LH surge suggests that this gonadotropin could modulate the activity of the ovarian promoter (PII) of cyp19 through cAMP. We showed with transfection and directed mutagenesis experiments that « cAMP responsive element like sequence » (CLS) is the major functional site in granulosa cells. However, the cAMP dependent PII activity depends also on the complementary action of CLS with other unknown sites. A comparison of PII activities in granulosa and small luteal cells underlines a 50 % decrease consecutive to the LH surge. We demonstrated by western-blot that the factor CREB is expressed in granulosa cells as well as in luteal cells. By EMSA we also showed that CREB is able to bind to CLS in both cell types. On the other hand, the SF-1/LRH-1 binding sites NREA and NREB are not functional in follicular cells whereas SF-1 and LRH-1 proteins are expressed. The preservation of CLS functionality in luteal cells suggests that the additional sites play an important role during the post-LH surge down regulation of cyp19 transcription. Lastly, we show that a second mechanism of inhibition of the transcription could imply estradiol. Indeed, estradiol counterbalances the cAMP effect in luteal cells. Western-blot experiments suggest that the steroid probably acts via the β receptor. Our study describes mechanisms that control cyp19 expression in granulosa cells compared to luteal cells

Une étape cruciale de la transformation maligne est la perte de voie suppresseur de tumeur qui contrôle la sénescence cellulaire. La protéine tyrosine kinase cytoplasmique syk (spleen tyrosine kinase) a été récemment décrite comme un suppresseur de tumeur des mélanomes, un cancer issu de la transformation maligne des mélanocytes, cellules produisant les pigments mélaniques. Le mécanisme par lequel syk diminue la croissance des mélanomes reste à déterminer. Tout d’abord, nous avons observe que l’expression de syk est perdue dans la plupart des lignées de mélanome. L’inactivation de syk est épigénétique due a une hyperméthylation d’îlots cpg de son promoteur. Le traitement avec l’agent déméthylant 5-aza-2-desoxycytidine restaure son expression. Nous avons constate que la réintroduction de syk dans les cellules de mélanome réduit de façon spectaculaire leur croissance en deux et trois dimensions, leur capacité migratoire et invasive. La réexpression de syk favorise la senescence des cellules de mélanomes caracterisée par une diminution de la prolifération, une morphologie large et aplatie, une activité bêta galactosidase associe a la senescence et des foci d’hétérochromatine. De plus, syk induit une hypophosphorylation de rb et active la voie suppresseur de tumeur p53, regule positivement l’expression de p21 dépendamment de p53. Nous avons également identifie les protéines nck1 et nck2 comme de nouveaux partenaires de syk. Nos résultats démontrent que syk est un nouveau candidat suppresseur de la croissance des mélanomes et suggèrent que l’inactivation de syk dans ces tumeurs participe a la levéee de la sénescence qui conduit a la progression maligne des cellules
Loss of tumor suppressive pathways that control cellular senescence is a crucial step in malignant transformation. Spleen tyrosine kinase (syk) is a cytoplasmic tyrosine kinase that has been recently implicated in tumor suppression of melanoma, a deadly skin cancer deriving from pigments-producing melanocytes. However, the mechanism by which syk suppresses melanoma growth remains unclear. Here we report that re-expression of syk in melanoma cells induces a p53-dependent expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 and a senescence program. We first observed that syk expression is lost in a subset of melanoma cell lines, primarily by dna methylation mediated gene silencing and restored after treatment with the demethylating agent 5-aza-2-deoxycytidine. We analysed the significance of epigenetic inactivation of syk and found that reintroduction of syk in melanoma cells dramatically reduces clonogenic survival and three-dimensional tumor spheroid growth and invasion. Remarkably, melanoma cells re-expressing syk display hallmarks of senescent cells, including reduction of proliferative activity and dna synthesis, large and flattened morphology, senescence-associated beta galactosidase activity and heterochromatic foci. This phenotype is accompanied with hypophosphorylated retinoblastoma protein and accumulation of p21, which depends on functional p53. Futhermore, we showned that the proteins nck 1/2 are new effectors of syk in melanoma cells. Our results highlight a new role for syk tyrosine kinase in regulating cellular senescence and identify syk-mediated senescence as a novel tumor suppressor pathway whose inactivation may contribute to melanoma tumorigenicity

La sex hormone-binding globulin (SHBG), glycoprotéine hépatique, est classiquement considérée comme une protéine de liaison, assurant le transport des stéroïdes sexuels dans le sang et régulant leur biodisponibilité. Cependant, d'autres sites d'expression, ainsi que des récepteurs membranaires spécifiques ont été découverts dans certains tissus. L'interaction de la SHBG avec ces récepteurs déclenche la production d'un second messager et l'apparition d'un effet biologique. Le présent travail a pour but d'étudier l'expression de la SHBG dans les cellules de la granulosa humaines. D'abord, la présence de la protéine a été détectée par immunohistochimie (IHC) dans la granulosa in situ, sur des coupes d'ovaires adultes et fœtaux, et des transcrits de SHBG ont été mis en évidence par RT-PCR dans des extraits d'ovaires. Ensuite, des cellules de la granulosa ont été isolées à partir de liquides folliculaires, obtenus chez des patientes candidates à une fécondation in vitro. A partir de cultures primaires de ces cellules nous avons démontré l'expression de la SHBG in vitro, par IHC et RT-PCR, ainsi que la sécrétion de la protéine dans le milieu de culture, par Western blot. Par cette approche semi- quantitative, certains facteurs régulateurs de l'expression de la SHBG dans ces cellules ont été identifiés, notamment la tri-iodothyronine et l'insuline. Enfin, un effet de la SHBG, en combinaison avec l'œstradiol, sur la production d'adénosine monophosphate cyclique intracellulaire et la sécrétion de progestérone par les cellules de la granulosa a été mis en évidence. Ces résultats suggèrent que la SHBG produite localement joue un rôle dans le fonctionnement folliculaire.

In vivo dans les follicules ovariens de brebis, la laminine (LN) est localisée au niveau de la lame basale et l'intégrine α6β1 dans les cellules de granulosa (CG). In vitro, des cultures de CG sur LN améliorent la survie, stimulent la prolifération, diminuent la sécrétion d'oestradiol (E2) et augmentent celle de progestérone (P4). L'intégrine α6β1 serait le médiateur essentiel des actions de la LN. L'ajout d'anticorps (Ac) anti-α6 dans ces cultures modifie la forme des CG, réduit la prolifération et la survie, augmente la sécrétion d'E2 et diminue celle de P4. L'arrondissement des CG par la cytochalasine D reproduit les effets de l'Ac anti-α6. Des cultures de CG sur mélange LN/peptides RGD avec l'Ac anti-α6 montrent que la prolifération et la survie sont liées à la forme des CG alors qu'il semble y avoir un découplage entre forme cellulaire et stéroi͏̈dogénèse. L'action de la LN sur les CG, via α6β1, met en jeu différentes voies de signalisation dont celle, entre autres, du cytosquelette.

Les tumeurs de la granulosa sont rares et agressives. Des récurrences peuvent apparaître plus de 10 ans après l'ablation de la tumeur primaire, provoquant le décès de 80% des patientes. Cette maladie s'accompagne d'une hyperoestrogénie dans 70% des cas. La première partie de ma thèse met en évidence que l'E2 limiterait l'essaimage des métastases des tumeurs de la granulosa. En effet, les études in vitro réalisées sur des lignées cellulaires, issues d'une tumeur primaire de la granulosa humaine (C0V434) ou de métastases (KGN), montrent que l'E2 n'affecte pas leur prolifération, mais diminue significativement la capacité migratoire et invasive des cellules KGN. Cet effet est provoqué par un mécanisme rapide non génomique, qui inhibe l'activité de ERK1/2 via le récepteur GPER (François et al. , 2015). La "mini-puberté", présente chez les mammifères après la naissance, est caractérisée par des quantités très élevées de gonadotropines (LH et FSH) et d'E2. Cette activation précoce de l'axe gonadotrope se produit au moment où l'ovaire possède des follicules en croissance. La seconde partie de ma thèse montre que les niveaux élevés de FSH dans la période infantile sont indispensables pour optimiser la production d'E2 par les follicules tout en bloquant leur croissance, les protégeant ainsi d'une maturation trop précoce. En effet, les études in vivo et ex vivo révèlent que les concentrations élevées de FSH assurent une production significative d'E2 en augmentant l'expression de l'aromatase, mais qu'elles n'ont plus d'action sur l'induction de l'expression de la cycline D2, un facteur essentiel pour la prolifération des cellules de la granulosa (François et al. , en préparation)
The granulosa cell tumors are rare and aggressive. Recurrences may appear more than 10 years after the removal of the primary tumor, causing the death of 80% of patients. This disease is accompanied by hyperestrogenism in 70% of cases. The first part of my thesis shows that E2 limit spreading of metastases from granulosa cell tumors. Indeed, in vitro studies on cell lines-derived from a primary tumor of human granulosa (C0V434) or from metastases (KGN) highlight that E2 did not affect their proliferation, but significantly reduces the capacity of migration and invasion of KGN cells. This effect is caused by a rapid non-genomic mechanism that inhibits the activity of ERK1 / 2 via the GPER receptor (François et al. , 2015). The "mini-puberty", present in mammals after birth, is characterized by very high amounts of gonadotropins (LH and FSH) and E2. This early activation of the hypothalamic—pituitary—gonadal axis occurs at a time when the ovary contains growing follicles. The second part of my thesis shows that high levels of FSH in infantile period are essential to optimize the production of E2 by the follicles white blocking their growth and protecting them from premature maturation. Indeed, in vivo and ex vivo studies highlight that high concentrations of FSH provide significant production of E2 by increasing the expression of aromatase, but that they have no more action on the induction of the expression of cyclin D2, a key factor in the proliferation of granulosa cells (François et al. , in preparation)

Il existe une forte corrélation entre perte de polarité des cellules épithéliales et carcinome. Toutefois, la relation de cause à effet reste à découvrir. Dans les cellules souches, la perte de polarité cellulaire et les anomalies de division asymétrique qui en découlent pourraient entraîner des défauts de différenciation cellulaire. Ces anomalies seraient capables d'empêcher la descendance des cellules souches de répondre aux mécanismes qui contrôlent normalement la prolifération cellulaire. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré dans la larve de Drosophile des neuroblastes portant des mutations dans différents gènes qui contrôlent la division asymétrique de ces cellules. Nous avons testé le potentiel prolifératif de ces neuroblastes en les transplantant dans des hôtes adultes. Nos résultats montrent que des morceaux de cerveaux de larve comportant des neuroblastes dont les gènes pins, mira, numb ou pros sont mutés peuvent grossir plus de cent fois dans l'hôte. Ces tumeurs envahissent les organes de l'hôte, le tuant en moins de trois semaines. Ces tumeurs deviennent immortelles et peuvent être retransplantées pendant des années. L'instabilité génomique et l'altération des centrosomes, deux caractéristiques fréquentes des carcinomes, n'existent pas dans la phase d'initiation de ces tumeurs. Pourtant, six semaines après la première transplantation, ces deux traits particuliers des carcinomes affectent plus de 10% des cellules tumorales. De nombreux travaux suggèrent que certains cancers pourraient provenir de cellules souches malignes. Nos résultats montrent que la perte de fonction d'un seul gène parmi plusieurs gènes qui contrôlent la différenciation de la descendance des cellules souches peut entraîner une prolifération incontrôlée de ces lignées cellulaires, déclenchant une chaîne d'événements qui dérèglent l'homéostasie cellulaire au sens large et peut conduire au cancer
Loss of cell polarity and cancer are tightly correlated, but a causative relationship has remained elusive. In stem cells, polarity loss and the resulting impairment of asymmetric cell division could bring about cell-fate alterations that could render one or the two daughters unable to respond to the mechanisms that control proliferation in the wild-type lineage. To test this hypothesis we have generated Drosophila larval neuroblasts that are mutant for different genes that control the asymmetric cell-division machinery and assayed their proliferative potential upon transplantation into adult hosts. We have found that pieces of larval brains carrying pins, mira, numb or pros mutant neuroblasts can grow over a hundred-fold the size of the implant, invading other tissues, and killing the hosts in less than three weeks. These tumors become immortal and can be re-transplanted into new hosts for years. Genome instability and centrosome alterations, two frequent traits of malignant carcinomas, are kept at wild-type levels during the initial stages of development in these tumors. However, six weeks after the first transplantation they affect at least 10% of the cells in all tumor lines. Growing evidence strongly suggests that the origin of some tumors may be a cancerogenic stem cell. Our results show that loss of function of any single one of several genes that control the cell-fate asymmetry of stem-cells daughters may result in over-proliferation of this lineage, triggering a chain of events that subverts cell homeostasis in a very general sense, and leads to cancer

La voie Fas-FasL est la voie majeure d'apoptose dont le rôle est indispensable pour l'homéostasie des cellules hématopoïétiques et la tolérance périphérique. Mon projet de thèse consiste à étudier le rôle de FasL dans la réponse anti tumorale, notamment le rôle de son expression sur les cellules myéloïdes, en l'occurrence les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives.Les souris Fasl KO sont caractérisées par une accumulation des différentes populations de cellules hématopoïétiques dans les organes lymphoïdes périphériques. Cependant, elles ne développent pas de tumeurs spontanées. De façon intéressante, nos résultats montrent que lors qu'elles sont transplantées par les cellules tumorales, leur survie est significativement diminuée par rapport aux souris contrôles (Fasl fl/fl), ce qui suggère un rôle de FasL dans la réponse anti-tumorale. Une caractérisation fine de la répartition des cellules myéloïdes chez les souris Fasl KO porteuses de tumeur, montre une répartition différentielle des cellules Gr1+, par une accumulation des M-MDSC, dans la rate de ces souris. En plus, un enrichissement de l'infiltrat tumoral par les macrophages TAM chez les souris Fasl KO a été observé. Ces macrophages, indépendamment de génotype exècrent une forte activité d'arginase et iNOS et une inhibition de la prolifération des cellules T in vitro. Ainsi, la mortalité plus importante chez les souris Fasl KO pourrait, en partie, être associée à cet enrichissement des TAM dans l'infiltrat des souris déficientes en FasL.Afin de déterminer si cette accumulation des cellules myéloïdes immunosuppressives déficientes en FasL est spécifique d'un environnement tumoral ou le reflet d'un état inflammatoire, nous avons examiné le phénotype des macrophages dans un modèle d'inflammation induite par le thioglycollate. Les résultats montrent que les macrophages CD11b+F480+, recrutés sur le site de l'inflammation, lorsqu'elles sont déficientes en FasL, sur-expriment les gènes anti-inflammatoires comme IL-10, Arg1, CCL17. La caractérisation plus fine de cette population de macrophages a montré que la population responsable de ce phénotype suppressive est F480+CD115+IL-4R+. Chez les souris Fasl KO, le pourcentage des macrophages F480+CD115+IL-4R+ est significativement augmenté en comparaison avec les souris contrôles. L'analyse fonctionnelle de cette population CD115+ a montré que ces cellules, inhibent la prolifération et la production d'IFN- des cellules T activées. Ces caractéristiques fonctionnelles sont en faveur d'un phénotype anti-inflammatoire de ces macrophages, qui lorsqu'ils sont déficients en FasL, leur recrutement sur le site de l'inflammation est plus important.L'ensemble de ces résultats suggère que l'expression de FasL sur les cellules myéloïdes pourrait jouer un rôle dans leur polarisation vers un phénotype pro inflammatoire. Ainsi, ce travail pourrait apporter de nouvelles approches de levée de l'immunosuppression pour une immunothérapie efficace.

Au cours des dernières décennies, les stratégies de reproduction chez la vache ont été progressivement améliorées grâce au développement des techniques de reproduction assistées. L’intégration de la sélection génomique à la stimulation ovarienne et du transfert d’embryons a considérablement amplifié le taux de reproduction des animaux et le gain génétique chez la vache laitière. L’utilisation de jeunes donneuses d’ovocytes dans les programmes de sélection génomique est aussi une méthode efficace afin d’accélérer les gains génétiques en diminuant le temps entre les générations. Même si les techniques de reproduction assistées utilisées chez les vaches adultes sont possibles chez les génisses prépubères sans aucun effet néfaste, la compétence au développement des ovocytes est significativement plus faible. De plus, la variabilité individuelle chez les donneuses en réponse au traitement hormonal demeure élevée. L’hypothèse de cette thèse stipule que le patron d’expression des gènes des cellules de la granulosa est associé avec les performances reproductives et le statut de différenciation du follicule chez les vaches ayant suivi une stimulation ovarienne. Des génisses et vaches laitières âgées de 5 mois jusqu’à 9 ans ont suivi un protocole de stimulation ovarienne avec une période de coasting de 19, 30, 44 ou 54 h dans un environnement commercial contrôlé. Les ovocytes collectés ont été fécondés in vitro et les cellules de la granulosa aspirées lors de la récolte ont été purifiées et congelées à -80 °C avant l’extraction de l’ARN pour chaque animal individuel. Au cours de nos travaux, nous avons identifié l’âge (5 à 10 mois) à laquelle les ovocytes des génisses sont significativement moins compétents que les vaches sexuellement matures. Nous avons aussi observé une grande variabilité dans la compétence développementale des ovocytes chez les vaches à la suite de la stimulation ovarienne et du coasting. Les analyses de l’expression des gènes des cellules de la granulosa ont été faites avec des micropuces à ADN en utilisant différents contrastes dans le but d’explorer les voies géniques associées avec les bonnes et les mauvaises donneuses d’ovocytes ou en fonction de l’âge des donneuses d’ovocytes. Tout d’abord, la variabilité interindividuelle au traitement ovarien semble être principalement associée au degré de maturité ou de différenciation du follicule lors de la récolte des ovocytes, ce qui explique les différences de compétence au développement des ovocytes de chacun des animaux étudiés. De plus, nous avons observé des signes de déficience nutritionnelle chez les animaux grâce au niveau de l’expression des gènes dans les cellules de la granulosa des donneuses d’ovocytes incompétents ce qui peut associer en partie la variabilité interindividuelle et l’alimentation des animaux. Grâce à l’utilisation de la méta-analyse, nous avons créé un plan de l’expression des gènes des cellules de la granulosa suivant le déclin ou le retrait de FSH. De plus, nous avons identifié des biomarqueurs spécifiques afin d’évaluer le degré de différenciation des follicules lors de la stimulation ovarienne. Finalement, nos recherches ont permis de démontrer une expression aberrante des gènes associés avec une concentration basale de l’hormone lutéinisante (LH) chez les donneuses d’ovocyte prépubères. De plus, nous avons démontré une plus grande expression de biomarqueurs de l’atrésie folliculaire chez les jeunes donneuses, ce qui suggère que les follicules entrent en atrésie plus rapidement chez les génisses lors du coasting, probablement due à une insuffisance du niveau de LH basale. Pour conclure, nos résultats vont fournir à l’industrie un outil diagnostique qui va permettre d’évaluer le statut folliculaire lors de la récolte des ovocytes dans le but d’ajuster la prochaine stimulation ovarienne. Nous présentons un nouveau concept, la capacitation du follicule, qui fait référence à la période après le déclin ou de retrait de la FSH dans laquelle le follicule prépare sa machinerie moléculaire pour le pic de LH et l’ovulation. Les résultats de cette thèse améliorent nos connaissances fondamentales de l’expression des gènes des cellules de la granulosa lors de la période d’acquisition de la compétence développementale de l’ovocyte chez le bovin
Au cours des dernières décennies, les stratégies de reproduction chez la vache ont été progressivement améliorées grâce au développement des techniques de reproduction assistées. L’intégration de la sélection génomique à la stimulation ovarienne et du transfert d’embryons a considérablement amplifié le taux de reproduction des animaux et le gain génétique chez la vache laitière. L’utilisation de jeunes donneuses d’ovocytes dans les programmes de sélection génomique est aussi une méthode efficace afin d’accélérer les gains génétiques en diminuant le temps entre les générations. Même si les techniques de reproduction assistées utilisées chez les vaches adultes sont possibles chez les génisses prépubères sans aucun effet néfaste, la compétence au développement des ovocytes est significativement plus faible. De plus, la variabilité individuelle chez les donneuses en réponse au traitement hormonal demeure élevée. L’hypothèse de cette thèse stipule que le patron d’expression des gènes des cellules de la granulosa est associé avec les performances reproductives et le statut de différenciation du follicule chez les vaches ayant suivi une stimulation ovarienne. Des génisses et vaches laitières âgées de 5 mois jusqu’à 9 ans ont suivi un protocole de stimulation ovarienne avec une période de coasting de 19, 30, 44 ou 54 h dans un environnement commercial contrôlé. Les ovocytes collectés ont été fécondés in vitro et les cellules de la granulosa aspirées lors de la récolte ont été purifiées et congelées à -80 °C avant l’extraction de l’ARN pour chaque animal individuel. Au cours de nos travaux, nous avons identifié l’âge (5 à 10 mois) à laquelle les ovocytes des génisses sont significativement moins compétents que les vaches sexuellement matures. Nous avons aussi observé une grande variabilité dans la compétence développementale des ovocytes chez les vaches à la suite de la stimulation ovarienne et du coasting. Les analyses de l’expression des gènes des cellules de la granulosa ont été faites avec des micropuces à ADN en utilisant différents contrastes dans le but d’explorer les voies géniques associées avec les bonnes et les mauvaises donneuses d’ovocytes ou en fonction de l’âge des donneuses d’ovocytes. Tout d’abord, la variabilité interindividuelle au traitement ovarien semble être principalement associée au degré de maturité ou de différenciation du follicule lors de la récolte des ovocytes, ce qui explique les différences de compétence au développement des ovocytes de chacun des animaux étudiés. De plus, nous avons observé des signes de déficience nutritionnelle chez les animaux grâce au niveau de l’expression des gènes dans les cellules de la granulosa des donneuses d’ovocytes incompétents ce qui peut associer en partie la variabilité interindividuelle et l’alimentation des animaux. Grâce à l’utilisation de la méta-analyse, nous avons créé un plan de l’expression des gènes des cellules de la granulosa suivant le déclin ou le retrait de FSH. De plus, nous avons identifié des biomarqueurs spécifiques afin d’évaluer le degré de différenciation des follicules lors de la stimulation ovarienne. Finalement, nos recherches ont permis de démontrer une expression aberrante des gènes associés avec une concentration basale de l’hormone lutéinisante (LH) chez les donneuses d’ovocyte prépubères. De plus, nous avons démontré une plus grande expression de biomarqueurs de l’atrésie folliculaire chez les jeunes donneuses, ce qui suggère que les follicules entrent en atrésie plus rapidement chez les génisses lors du coasting, probablement due à une insuffisance du niveau de LH basale. Pour conclure, nos résultats vont fournir à l’industrie un outil diagnostique qui va permettre d’évaluer le statut folliculaire lors de la récolte des ovocytes dans le but d’ajuster la prochaine stimulation ovarienne. Nous présentons un nouveau concept, la capacitation du follicule, qui fait référence à la période après le déclin ou de retrait de la FSH dans laquelle le follicule prépare sa machinerie moléculaire pour le pic de LH et l’ovulation. Les résultats de cette thèse améliorent nos connaissances fondamentales de l’expression des gènes des cellules de la granulosa lors de la période d’acquisition de la compétence développementale de l’ovocyte chez le bovin
In the past few decades, the reproductive strategies in bovine have been drastically improved by the development of assisted reproductive technologies. The incorporation of embryo transfer and ovarian stimulation to genomic selection has considerably increased the reproduction rate of high genetic merit animals and the genetic gain in dairy cattle. The use of oocytes from younger donors in such programs is a great opportunity to accelerate the genetic gain by compressing the time between generations. Although the use of the same assisted reproductive technologies applied to sexually mature cows is possible in prepubertal heifers without any detrimental effect on subsequent reproductive performance, their oocyte developmental competence is significantly lower. Moreover, the variability associated to the ovarian treatment remains high in both pre- and post-pubertal animals. In this thesis we hypothesize that the gene expression patterns in granulosa cell is associated with subsequent reproductive performance after ovarian stimulation in cattle and provide information about the follicle differentiation status. A large number of Holstein heifers and cows aged from 5 months to 9 years of age underwent ovarian stimulation followed by a coasting period of 19, 30, 44 or 54h in a controlled commercial environment. Collected oocytes were fertilized in vitro and granulosa cells from the aspiration media were collected, purified and keep at -80 oC before RNA extraction for each animal. In this thesis we identified that oocytes from animal aged between 5 and 10 months of age yielded fewer blastocysts compared to sexually mature animals. We also reported a high variability in oocyte developmental competence associated to the animal following ovarian stimulation and coasting. The transcriptomes of granulosa cells recovered with the oocytes were analyzed using microarrays in different contrasts to explore the gene expression associated with donors of low oocyte competence compared to the donors of good oocyte competence or with donors from different ages. To begin with, inter-individual variability is mainly associated to the difference in follicle maturity at the time of oocyte collection and could explain differences in oocyte developmental competence in individual animals. Moreover, the nutritional deficiency signs have been shown in granulosa cells from donors of incompetent oocytes and from younger donors. By using meta-analysis, we were able to create a blueprint of the follicle gene expression following FSH decline in granulosa cells and to identify specific biomarkers to assess the follicle status and to create the tools in order to identify the degree of differentiation in follicle following ovarian stimulation and coasting. Finally, we discovered the multiple traits associated with basal concentration of luteinising hormone are more apparent in prepubertal donors. We also showed a higher expression of biomarkers of follicle atresia in younger donors, suggesting that follicle atresia occur more rapidly during coasting, resulting in lower oocyte developmental due to a possible insufficiency in basal LH in prepubertal donors. In conclusion, this thesis has provided important information to assess a follicle differentiation diagnosis in order to adjust the next ovarian stimulation and coasting. We defined the unique period following FSH decline and withdrawal as ‘follicle capacitation’ which refers to the functional changes occurring within the follicle to prepare its molecular machinery for the LH surge and ovulation. The results from this thesis will improve our understanding of the granulosa cells gene expression during the period of oocyte developmental competence acquisition in bovine
In the past few decades, the reproductive strategies in bovine have been drastically improved by the development of assisted reproductive technologies. The incorporation of embryo transfer and ovarian stimulation to genomic selection has considerably increased the reproduction rate of high genetic merit animals and the genetic gain in dairy cattle. The use of oocytes from younger donors in such programs is a great opportunity to accelerate the genetic gain by compressing the time between generations. Although the use of the same assisted reproductive technologies applied to sexually mature cows is possible in prepubertal heifers without any detrimental effect on subsequent reproductive performance, their oocyte developmental competence is significantly lower. Moreover, the variability associated to the ovarian treatment remains high in both pre- and post-pubertal animals. In this thesis we hypothesize that the gene expression patterns in granulosa cell is associated with subsequent reproductive performance after ovarian stimulation in cattle and provide information about the follicle differentiation status. A large number of Holstein heifers and cows aged from 5 months to 9 years of age underwent ovarian stimulation followed by a coasting period of 19, 30, 44 or 54h in a controlled commercial environment. Collected oocytes were fertilized in vitro and granulosa cells from the aspiration media were collected, purified and keep at -80 oC before RNA extraction for each animal. In this thesis we identified that oocytes from animal aged between 5 and 10 months of age yielded fewer blastocysts compared to sexually mature animals. We also reported a high variability in oocyte developmental competence associated to the animal following ovarian stimulation and coasting. The transcriptomes of granulosa cells recovered with the oocytes were analyzed using microarrays in different contrasts to explore the gene expression associated with donors of low oocyte competence compared to the donors of good oocyte competence or with donors from different ages. To begin with, inter-individual variability is mainly associated to the difference in follicle maturity at the time of oocyte collection and could explain differences in oocyte developmental competence in individual animals. Moreover, the nutritional deficiency signs have been shown in granulosa cells from donors of incompetent oocytes and from younger donors. By using meta-analysis, we were able to create a blueprint of the follicle gene expression following FSH decline in granulosa cells and to identify specific biomarkers to assess the follicle status and to create the tools in order to identify the degree of differentiation in follicle following ovarian stimulation and coasting. Finally, we discovered the multiple traits associated with basal concentration of luteinising hormone are more apparent in prepubertal donors. We also showed a higher expression of biomarkers of follicle atresia in younger donors, suggesting that follicle atresia occur more rapidly during coasting, resulting in lower oocyte developmental due to a possible insufficiency in basal LH in prepubertal donors. In conclusion, this thesis has provided important information to assess a follicle differentiation diagnosis in order to adjust the next ovarian stimulation and coasting. We defined the unique period following FSH decline and withdrawal as ‘follicle capacitation’ which refers to the functional changes occurring within the follicle to prepare its molecular machinery for the LH surge and ovulation. The results from this thesis will improve our understanding of the granulosa cells gene expression during the period of oocyte developmental competence acquisition in bovine

La differenciation des cellules de la granulosa ovarienne de rat en culture est induite par l'hormone folliculostimulante fsh et met en jeu le systeme ampc/proteine kinase a (pka). Plusieurs facteurs de croissance sont capables de moduler l'action de la fsh. L'etude presentee porte sur l'action du facteur de croissance des fibroblastes basique (fgfb) dont le role sur la differenciation de ces cellules n'etait pas etabli. Le fgfb exerce un effet inhibiteur tant sur la production d'ampc induite par la fsh que sur l'expression des recepteurs de l'hormone luteinisante lh. Suivant les doses utilisees, le fgfb stimule ou inhibe la production de progesterone. Un site d'action post-ampc du fgfb est mis en evidence: le facteur de croissance inhibe fortement l'expression de la sous-unite regulatrice r de la pka de type 2 induite par la fsh alors qu'il ne reduit que tres partiellement l'activite catalytique de l'enzyme. Le facteur de croissance transformant-beta (tgf-beta) qui regule positivement la differenciation des cellules de la granulosa s'oppose a l'action inhibitrice du fgfb tant sur la production d'ampc que sur l'expression des recepteurs a la lh et l'expression de r. A l'instar du fgfb, le 12-o-tetradecanoylphorbol 13-acetate (tpa), activateur de la proteine kinase c (pkc), inhibe l'expression de r. Le fgfb stimule la production de diacylglycerol mais n'affecte pas de facon similaire la formation d'inisitols phosphates. Le fgfb augmente l'activite pkc tant au niveau cytosolique que particulaire et induit la phosphorylation d'une proteine substrat de la pkc de poids moleculaire apparent 80000 et de points isoelectrique 4,7. Le fgfb reduit la capacite de liaison du facteur de croissance de l'epiderme (egf) a son recepteur. Ces resultats suggerent que le fgfb pourrait exercer son action sur l'expression de r et la differenciation des cellules de la granulosa par l'intermediaire d'une activation de la pkc

Ce travail de thèse s'inscrit dans le cadre de l'étude des mécanismes physiologiques de contrôle de la fonction ovarienne et en particulier, du nombre d'ovulations. La mise en évidence de deux gènes, bmpr-1b et bmp-15, dont des mutations sont responsables des phénotypes hyper-prolifiques des brebis Booroola et Inverdale respectivement, a permis de désigner la voie de signalisation des bone Morphogenetic proteins (BMPs) comme essentielle dans le contrôle de la fonction ovarienne. Le but de cette thèse était de décrire d'une part, la nature et la localisation ovarienne des molécules BMPs et de leur récepteurs et d'autre part, de mettre en évidence leurs rôles et leurs mécanismes d'action au sein de l'ovaire, en utilisant des cultures de cellules de granulosa de brebis et de rate comme modèles expérimentaux. Nous avons mis ainsi en évidence une action inhibitrice des BMPs sur la secrétion de progestérone et stimulatrice sur la prolifération de ces cellules. Les BMPs agiraient comme un "frein" de la différenciation terminale des cellules de granulosa
From recent accumulating in vivo and in vitro evidence, it appears that members of the Bone Morphogenetic Proteins (BMP) family of cytokines and their receptors are strongly implicated in ovarian function, controlling folliculogenesis and ovulation rate. To evaluate the role of the BMP pathway on folliculogenesis, the action of ligands was studied on primary cultures of rate and ovine GCs in vitro. We observed that BMPs strongly inhibited progesterone secretion and stimulated proliferation by GCs. Then we have investigated the mechanism of action by which BMP-4 exerted an inhibitory action on basal as well as FSH-induced progesterone secretion. We purpose that BMP-4 modulates progesterone by inhibiting the steroidogenic factor-1 (SF-1) transcriptional activity on steroidogenic gene promoters. In FSH-induced condition, this mechanism is reinforced by an inhibition of adenylate cyclase activity. BMP factors regulate GCs differentiation, particularly in delaying the luteinization process