Dissertations / Theses on the topic 'Vaccins antiviraux'

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus qui circule dans la population humaine depuis plus de70 ans et a été isolé pour la première fois en 2001. Il est la troisième cause mondiale en lien avec les hospitalisations d’enfants pour maladies aigües des voies respiratoires supérieures et inférieures. Il est responsable d’une multitude de complications chez les jeunes enfants, les personnes âgées ainsi que les personnes immunosupprimées. À ce jour, il n’existe aucun vaccin commercial contre le hMPV. Dans les récentes années, la protéine de fusion F, qui est le principal antigène viral, a fait l’objet d’une multitude d’essais principalement pré-cliniques en vaccination. La découverte que, chez le virus respiratoire syncytial (VRS), la protéine F stabilisée en forme pré-fusion est plus immunogène a fourni de nouvelles pistes pour le développement vaccinal. Pour ces raisons, l’objectif de ma maîtrise est le développement d’un vaccin sous-unitaire à base de protéine F-hMPV stabilisée en pré-fusion et son test chez le modèle de la souris BALB/C pour vérifier son potentiel protecteur. Nos études ont démontré qu’il n’y a pas de différence significative, en termes d’immunogénicité, entre la forme pré- et post-fusion de la protéine F chez le hMPV. Les essais d’immunogénicité ont également démontré la nécessité de l’ajout de l’adjuvant alum pour élucider une réponse immunitaire chez la souris BALB/C. Les immunisations par les protéines adjuvantées ont démontré le développement d’anticorps neutralisants. Suite à l’infection, la réplication virale pulmonaire a été diminuée sous le seuil de détection des techniques utilisées, mais l’inflammation pulmonaire a persisté. Les vaccins adjuvantés n’ont pas influencé la perte de poids chez la souris, mais ont amélioré les autres symptômes cliniques tels l’activité physique et le poil ébouriffé. Les vaccins F-hMPV sans alum présentent certaines caractéristiques de réponse immune exagérée (titres en anticorps neutralisants nuls; état physique détérioré) et devront être analysés davantage. Les vaccins F-hMPV avec alum n’ont pas démontré des signes de réponse immune exagérée, suite à l’infection par le hMPV, malgré une réponse immune de type Th2 plus forte. Globalement, malgré une réduction des titres viraux à un seuil indétectable, aucun des vaccins n’a protégé complètement le modèle murin contre l’infection par le hMPV. Les vaccins développés au cours de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies d’immunisation, de nouveaux essais de vaccination en combinaison avec d’autres adjuvants et peuvent servir de base pour le développement d’un vaccin efficace contre le hMPV
The human metapneumovirus has been first isolated in 2001 despite its circulation in the human population for more than 70 years. HMPV is the third leading cause of children hospitalisations associated with acute respiratory tract infections. Complications occur commonly in young children, the elderly and the immunocompromised. To this day, no vaccine has been licensed for use against hMPV. In recent years, the F protein, considered the most immunodominant antigen, has been the target of many pre-clinical vaccine trials. The discovery, for RSV, that a prefusion bound F protein is more immunogenic than post-fusion has encouraged new vaccination approaches. Based on this discovery, the aim of this project is the development of a prefusion bound F-hMPV subunit vaccine and testing its potency to protect the BALB/C model. Following challenge, no significant difference between potentially prefusion bound proteins and wild type protein was observed. Immunisation trials revealed the necessity of adding an adjuvant, alum in this case, to elicit an immune response in mice. Neutralizing antibodies were observed with F-hMPV vaccines containing the alum adjuvant. Post-immunisation challenge trials revealed reduction of lung viral replication below detection levels and persisting inflammation. Weight loss was not affected by vaccination, but animals immunised with adjuvanted F-hMPV proteins exhibited better physical condition and no signs of disease such as diminished activity and ruffed fur. F-hMPV vaccines without alum exhibited some characteristics of enhanced disease (no neutralizing antibodies; affected physical condition) and require further analysis. Enhanced disease was not observed in the F-hMPV adjuvanted groups despite higher Th2/Th1 ratios with adjuvanted proteins . None of the vaccines tested were able to fully protect the mouse model upon challenge. Vaccines developed in this study will be useful in future trials and could be tested with other adjuvants or vaccination strategies.

Les virus influenza sont des pathogènes respiratoires responsables d’épidémies saisonnières touchant 10 à 20% de la population mondiale chaque année, constituant donc un problème majeur de santé publique. La vaccination annuelle réduit l’impact des épidémies grippales; cependant, un mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes peut parfois survenir et résulter en un échec de protection de la population. Dans ces cas, il est important d’avoir un traitement adéquat afin de traiter l’infection virale. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) constituent la principale classe d’antiviraux recommandée pour la prévention et le traitement des infections grippales. Les INAs lient de façon compétitive le site actif de la neuraminidase (NA), ce qui bloque la libération des virions des cellules hôtes inhibant de la sorte la dissémination du virus dans le tractus respiratoire. L’émergence sporadique de virus résistants à l’oseltamivir et/ou au zanamivir avec de faibles taux de transmission a été identifiée lors de traitements des souches saisonnières de l’influenza. Le développement de nouveaux antiviraux devient donc un sujet important d’investigation. Le peramivir, un nouvel INA disponible depuis peu en Amérique du Nord, exerce une activité sur des virus influenza A et B et son efficacité contre des mutants résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir n’a pas encore été complètement caractérisée. À cause des différences dans la liaison des INAs avec l’enzyme cible, la nature des mutations de résistance peut varier d’un INA à l’autre bien que certaines mutations pourraient engendrer une résistance croisée à plusieurs INAs. Nous avons démontré que le peramivir s’avère très actif contre les différents sous-types de grippe saisonnière, quoique certains variants aient présentés des phénotypes de multi-résistance à l’oseltamivir, au zanamivir ainsi qu’au peramivir. À cet égard, un nouveau mécanisme de résistance d’un variant menant à la résistance croisée aux INAs a été décrit (I427T/Q313R) dans le cadre de ce mémoire et a permis de comprendre comment des substitutions retrouvées hors du site actif de la NA peuvent affecter la capacité de réplication du virus et sa résistance aux antiviraux.
Influenza viruses are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics affecting 10 to 20% of the world's population every year, thus constituting a major public health impact. Annual vaccination reduces the impact of influenza epidemics; however, a mismatch between the vaccine strain and the circulating strain can sometimes occur and result in an unsuccessful attempt in protecting the population. In such cases, it is important to have adequate treatment to treat influenza infections. Neuraminidase inhibitors (NAIs) are the primary class of antiviral agents recommended for the prevention and treatment of influenza infections. NAIs competitively bind the neuraminidase (NA) active site, blocking the release of virions from host cells and thereby inhibiting the spread of the virus into the respiratory tract. The sporadic emergence of oseltamivir- and/or zanamivir-resistant viruses with low transmission rates was identified in seasonal influenza strains. The development of new antivirals thus became an important subject of investigation. Peramivir, a new NAI recently available in North America, exerts its activity against influenza A and B viruses, but its effectiveness against mutations conferring resistance to oseltamivir or zanamivir has not yet been fully characterized. Due to differences in the binding of NAIs to the target enzyme, the nature of the resistance mutations may vary from one NAI to another, although some mutations could induce global NAI cross-resistance. We have demonstrated that peramivir is highly active against the different seasonal influenza subtypes, although some variants have shown multi-resistance phenotypes to oseltamivir, zanamivir as well as peramivir. In this regard, a new resistance mechanism by which a NA variant leads to NAI cross-resistance (I427T/Q313R) has been described in this thesis and has helped to understand how substitutions found outside the NA active site can affect the replication kinetics of the virus and its resistance to antivirals.

Le poliovirus (PV), un Enterovirus de la famille des Picornaviridae, est l’agent étiologique de la Poliomyélite Paralytique Aiguë (PPA). La PPA se caractérise par des paralysies flasques dues à la destruction des neurones moteurs par apoptose suite à la réplication du PV. Nous avons montré notamment qu’un transfert de calcium du réticulum endoplasmique vers les mitochondries contribue à l’apoptose induite par le PV (Brisac C. Et al. , 2010). De plus, l’exécution du processus apoptotique complet implique la réplication et la synthèse des protéines virales non-structurales (NS). Nous avons identifié deux interacteurs cellulaires de la protéine NS 3A du PV : ACBD3 (Acyl-Coenzyme A binding domain containing 3) et CREB3 (cyclic AMP response element-binding protein). Nous avons montré qu’ACBD3 pouvait moduler la réplication du PV (Téoulé F. Et al. , en révision) tandis que CREB3 pourrait être impliquée dans la régulation de la signalisation calcique et l’apoptose au cours de l’infection
Poliovirus (PV), an Enterovirus of the Picornaviridae family, is the causal agent of acute paralytic poliomyelitis (APP). APP is characterised by flaccid paralysis due to the destruction of motor neurons by apoptosis following PV replication. We have shown, in particular, that the transfer of calcium from the endoplasmic reticulum to the mitochondria contributes to the apoptosis induced by PV (Brisac et al. , 2010). This apoptotic process also involves the replication and synthesis of viral non-structural (NS) proteins. We have identified two cellular proteins interacting with the NS 3A protein of PV: ACBD3 (acyl-coenzyme A binding domain-containing 3) and CREB3 (cyclic AMP response element-binding protein). We have shown that ACBD3 modulates the rate of PV replication (Téoulé et al. , in revision), whereas CREB3 may be involved in regulating cell signalling and apoptosis during infection

Les relations existantes entre l'immunité et le développement de la rage chez les ruminants domestiques ont été explorées soit après l'infection par le virus rabique, soit après la vaccination contre cette injection. Après une revue bibliographique des différents aspects de la rage chez les animaux et notamment chez les ruminants, une étude expérimentale a été conduite chez 99 ovins et 15 bovins. Cette étude à d'abord consisté à comparer la résistance naturelle des ovins aux trois virus de la rage auxquels sont principalement exposés les ruminants dans le monde : ceux du Renard, de la Chauve-souris et du Chien. Cette résistance n'apparait pas significativement différente

Ce travail avait pour objectif d'utiliser le mécanisme de l'interférence ARN pour le contrôle in vitro de la réplication de virus à ARN (Morbillivirus) et à ADN (Asfivirus). Par une approche bioinformatique et biologique par mesure de l'inhibition de la réplication de ces virus en culture cellulaire, des gènes cibles et des siARN actifs ont été mis en évidence. Le genre Morbillivirus inclus d'importants pathogènes de l'homme et de l'animal, comme le virus de la rougeole, de la peste des petits ruminants et celui de la peste bovine. La nucléoprotéine (N) joue un rôle central dans la transcription et la réplication des Morbillivirus, aussi, nous avons définis des siARN dirigés contre les séquences conservées déterminées par alignement multiple du gène N de ces virus. Dans le cas du virus à ADN étudié, le virus de la peste porcine africaine, l'objectif consistait à déterminer le rôle dans la réplication virale, de quatre gènes présents dans une région devant être délétée pour l'atténuation raisonnée du virus. Pour les pays confrontés à ces maladies virales extrêmement contagieuse, le développement de vaccins thérapeutiques reposant sur l'interférence ARN est un progrès majeur en santé animale, spécialement pour la peste porcine africaine contre laquelle il n'y a pas encore de vaccin et pouvant déboucher sur de nouvelles stratégies de lutte
This work aimed at using the mechanism of RNA interference for the in vitro control of the replication of RNA (Morbillivirus) and DNA viruses (Asfivirus). By bioinformatics and in vitro biological approaches measuring the inhibition of the replication of these viruses in cell culture, target genes and active siRNA were identified. Morbillivirus genus includes important pathogens of human and animals. They include measles virus, peste des petits ruminants virus and rinderpest virus. Nucleoprotein (N) plays an essential role in transcription and replication of Morbilliviruses, therefore we defined siRNA targeting the conserved sequences as defined by multiple alignment of the N gene of these viruses. In the case of the DNA virus studied, African swine fever virus, the objective was determining the role in the viral replication, of four genes present in an area having to be deleted for the carefully thought out attenuation of the virus. . For countries facing these extremely contagious viral diseases, the development of therapeutic vaccines based on siRNA interference is a major progress for animal health, especially for African swine fever against which there is not yet vaccine and having the potential to open the door on new control strategies

La difficulté à induire des anticorps capables de neutraliser (anticorps neutralisants, AcN) la très grande diversité des isolats circulants du VIH-1 reste à l’heure actuelle un obstacle majeur au développement d'un vaccin préventif contre le VIH-1. L’objectif du projet a été de déterminer quels étaient les épitopes neutralisants les plus conservés au sein des 4 groupes M, N, O et P de VIH-1 puis de concevoir un immunogène qui serait capable d’induire la production d’AcN anti-VIH-1. Nous avons montré que l’épitope N160-glycane dépendant de la région V1/V2 de l’enveloppe virale est le plus conservé au sein des 4 groupes du VIH-1 (Morgand et al., JAIDS 2016). Nous avons ensuite montré la faisabilité d’obtenir, en système d’expression transitoire, des particules chimères constituées de la protéine d’enveloppe HBs du virus de l’hépatite B exprimant à leur surface les glycoprotéines d’enveloppe de différents groupes et sous-type du VIH-1. Malgré la présence de certains épitopes neutralisants (supersite N332-V3, site de liaison au CD4, région MPER- membrane proximal external region-), les épitopes d’intérêt de la région V1/V2 ne sont pas exposés sur ces particules chimères
The difficulty to induce antibodies able to neutralize (neutralizing antibodies, NAb) the large diversity of HIV- 1 isolates remains a major hurdle toward the development of an anti-HIV-1 vaccine. The aim of our study was first, to identify which epitopes are the most conserved within the 4 HIV-1 groups (M, N, O, P) and then, to design an immunogen that would be able to induce NAb against HIV-1. We showed that the V1/V2 N160- glycan epitope is the most conserved within the 4 HIV-1 groups (Morgand et al., JAIDS 2016). Subsequently, we showed the feasibility to generate chimeric particles based on the HBs envelope protein exposing the envelope glycoproteins of different groups and subtypes of HIV-1 at their surface. Although we demonstrated the presence of several neutralizing epitopes on these chimeric particles (N332-V3 supersite, CD4 binding site, membrane proximal external region), none of them exposed the V1/V2 epitopes of interest

La maladie de Marek due à l’a-herpesvirus GaHV-2 (Gallid herpes virus) est un lymphome T du poulet contrôlable par vaccination. Nous avons recherché si l’activité télomérase et la transcription des gènes viraux étaient associées à la protection vaccinale. L’activité télomérase peut être considérée comme un marqueur de lymphomagenèse, corrélant avec la virulence des souches GaHV-2 parmi lesquelles le vaccin CVI988 induit une faible activité. Ce défaut d’activation ne semble pas lié à la mutation de la boîte H de vTR, présente uniquement dans deux lots de vaccins. La virulence des souches GaHV-2 a également un effet sur le taux de transcription des gènes viraux. La vaccination des poulets par la souche homologue Rispens CVI988 ou hétérologue HVT isolée du dindon provoque une réduction de l’activité télomérase et de la transcription des gènes viraux, après épreuve par une souche hypervirulente vvRB- 1B. Enfin, le vaccin CVI988 exerce, sur la transcription de vvRB-1B, un effet plus intense que celui d’HVT. L’activité télomérase et la transcription des gènes viraux peuvent ainsi être considérés comme de nouveaux critères de protection vaccinale
Marek’s disease is a chicken T lymphoma induced by the gallid herpesvirus type 2 (GaHV-2), an alphaherpesvirus. The disease is controlled through vaccination. In this work, we investigated whether telomerase activity and viral gene transcription were associated with protection against the GaHV-2 RB-1B strain in chickens vaccinated with Rispens CVI988 or the herpes virus of turkey (HVT). Telomerase activity seemed to be an appropriate marker of lymphoma and levels of viral transcription were correlated with the virulence of strains, the attenuated CVI988 strain inducing a low level of telomerase activity. We showed that the mutation in the H box of CVI988 vTR which was not shared by all CVI988 isolates could not account for this poor activation. Vaccinated birds had lower levels of telomerase activity and RB-1B viral transcription than unvaccinated chickens infected with RB-1B. The decrease in RB-1B viral transcription was more marked in chickens vaccinated with CVI988 than in those vaccinated with HVT. In conclusion, telomerase activity and gene transcription in challenge MDV strains are potential new reliable criteria of protection in vaccinated chickens

Le coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) émergea à la fin de l'année 2002 et fut responsable d'une épidémie de pneumopathie atypique chez l'homme. Nous décrivons dans ce mémoire trois approches vaccinales contre le SRAS permettant l'induction d'anticorps neutralisants contre la glycoprotéine S, qui représentent les principaux effecteurs de la réponse immune protectrice. Nous avons montré que l'expression du gène S en cellules de mammifères nécessitait des vecteurs optimisés munis d'un intron et d'éléments de régulation post-transcriptionnelle comme WPRE ou CTE. Dans le modèle souris, seule l'association d'un intron et de WPRE permet d'augmenter l'immunogénicité d'un vaccin ADN contre le SRAS de telle sorte qu'il soit efficace à une dose faible d'ADN (2 μ g). Nous avons établi des lignées cellulaires sécrétant l'ectodomaine soluble de la protéine S (Ssol). L'immunogénicité du polypeptide Ssol purifié a été étudiée dans les modèles souris et hamster. Deux injections de Ssol adjuvé par de l'Alum permettent l'induction d'une réponse immune Th2 comprenant des titres élevés d'anticorps neutralisants, et protègent les animaux contre une infection d'épreuve par le SRAS-CoV. Nous avons également montré que l'utilisation d'adjuvants développés par GlaxoSmithkline Biologicals permettait une amélioration importante des réponses induites par la protéine Ssol et l'induction d'une réponse Thl. Parallèlement, nous avons montré chez le hamster qu'une seule injection de vecteurs lentiviraux permettant l'expression de la protéine S membranaire permet l'induction d'une réponse humorale neutralisante comparable à celle induite par deux injections de la protéine Ssol
Severe acute respiratory syndrome associated coronavirus (SARS-CoV) emerged in late 2002 and caused an epidemic of atypic pneumonia in humans. Here, we describe three vaccine candidates designed to induce neutralizing antibodies against the viral S glycoprotein, which are the main effectors of the protective immune response. We demonstrated that efficient expression of S gene in mammalian cell lines required the use of optimized vectors containing an intron and post-transcriptional regulatory elements such as WPRE and CTE. Upon immunization of mice with low doses of naked DNA, only intron and WPRE-containing vectors were able to provide protection against challenge with SARS-CoV. We also established stable cell lines constitutively secreting a soluble form of the S protein (Ssol). The immunogenicity of purified Ssol was studied in mouse and hamster models. Two injections of the Ssol polypeptide adjuvanted with Alum induced a strong and long-lasting Th2 immune response comprising high levels of SARS-CoV-neutralizing antibodies. Upon intranasal challenge with SARS-CoV, virus replication was strongly reduced in the lungs of immunized animals and hamsters were protected from the occurrence of lesions in the respiratory tract. Moreover, the use of two new adjuvants developed by GlaxoSmithKline Biologicals further increased the anti-S humoral response and the Thl component of the immune response. Concurrently, we developed HIV-based lentiviral vectors expressing the full-length S protein as an alternate SARS vaccine candidate. In the hamster model, a single injection of these vectors induced a neutralizing antibody response similar to that induced by two injections of Ssol

La transmission interhumaine des virus grippaux aviaires H5N1 hautement pathogènes émergeant en Asie du Sud-Est reste actuellement très peu efficace. Toutefois, leur dissémination géographique récente à travers le monde et la multiplication des cas humains sporadiques fait craindre la survenue d'une pandémie à l'image de la dévastatrice grippe espagnole de 1918. Le développement de candidats vaccins contre les virus influenza H5N1 reste ainsi une priorité mondiale en santé publique. Celui-ci est rendu particulièrement complexe du fait de l'évolution des virus H5N1 en plusieurs clades et sous-clades phylogénétiques : leur diversité antigénique implique de concevoir une stratégie vaccinale à même d'induire une réponse protectrice contre l'ensemble des souches susceptibles d'émerger. Une approche reposerait sur l'élaboration d'un vaccin bivalent composé de H5 et de NI, qui ciblerait deux fonctions essentielles à la propagation du virus, la fixation de la particule virale à son récepteur (portée par la HA) et l'activité sialidase impliquée dans la production de néoparticules (portée par la NA). Dans leur ensemble, nos données démontrent l'intérêt d'une approche vaccinale reposant sur l'induction d'une immunité anti-Nl, pour l'élargissement du spectre d'efficacité d'un vaccin (pré)pandémique à un nombre important de clades ou sous-clades phylogénétiques de virus H5N1 hautement pathogènes. Elles soulignent également les limites des approches vaccinales reposant sur la seule induction d'une immunité anti-H5, et proposent de mettre l'accent sur une stratégie bivalente, ciblant les deux fonctions essentielles du virus grippal portées par la H5 et par la NI
Human transmission of avian, highly pathogenic, H5N1 influenza viruses is currently inefficient. However, the recent geographic spread throughout the world and the increasing number of sporadic human cases increase the likelihood of virus adaptation to humans and the risk of a pandemic episode. The development of vaccines candidate against H5N1 influenza virus remains a global public health priority. This is made particularly complex because of the evolution of H5N1 viruses within multiple phylogenetic clades and subclades. Thus, the core challenge of developing a pre-pandemic H5N1 vaccine resides in defining an immunogenic composition able to induce a cross-protective immunity against ail avian strains, which are susceptible to emerge in humans. An approach based on the development of a bivalent vaccine composed of H5 and NI, which would target two essential functions in the virus, the binding of the virus to its receptor (driven by the HA) and sialidase activity involved in the production of new particles (driven by NA). Taken together, our data demonstrate the value of a vaccine approach based on the induction of anti-Nl immunity, for the broadening of the vaccine effïcacy spectrum against a large number of highly pathogenic H5N1 viruses' clades or sub-clades. They also highlight the limitations of vaccine approaches based solely on the induction of anti-H5 immunity, and propose to focus on a bivalent strategy, targeting two essential functions of the influenza virus carried by the H5 and the NI

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d'infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5 ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd'hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n'y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s'est articulé autour de deux axes principaux : (i) L'étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l'entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d'induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d'être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l'objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l'identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L'atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l'infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux
Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since 2001, this virus and its pathogenesis still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Liveattenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated

Le poliovirus (PV) est un des prototypes de la grande famille des virus à brin positif d'ARN, les Picornaviridae, et il est l'agent étiologique de la poliomyélite paralytique. Bien qu'il soit le premier virus à avoir été cultivé, en 1949, et étudié in vitro, les connaissances de virologie fondamentale sur le PV sont encore lacunaires et incomplètes. Les campagnes de vaccinations mondiale, très efficaces, ont permis d'éradiquer la polio dans la plupart des grandes régions du monde, et la maladie ne reste aujourd'hui endémique que dans trois pays en Afrique et Asie. Si le PV n'est donc plus considéré comme une menace de santé publique en Europe et son étude n'est plus considérée comme prioritaire, il reste un modèle très captivant. En particulier, depuis l'introduction du vaccin oral antipoliomyélitique, la circulation et la dérive génétique de ces souches atténuées ont entrainé l'émergence de poliovirus dérivés du vaccin qui sont neuro-pathogènes. Ces souches sont le plus souvent recombinantes avec des virus co-circulants appartenant à la même famille que le PV, ce qui suggère que la recombinaison contribue au mécanisme d'émergence. Un des partenaires préférentiels de ces recombinaisons semble être le Coxsackievirus A17 (CV-A17). Mon projet de thèse vise à approfondir les connaissances actuelles du PV dans le cadre de son interaction avec la cellule hôte, avec notamment trois objectifs : Améliorer notre compréhension de la sélection des souches recombinantes dérivées du vaccin. Caractériser de nouveaux modules de signalisation cellulaire interagissant avec le PV. Identifier de nouvelles cibles pour le développement de thérapies antivirales qui seront nécessaires pendant la période de post-éradication. Une analyse du profil d'interaction virus-hôte de la protéine non-structurale 3A du PV nous a permis d'identifier deux nouveaux partenaires cellulaires :-ACBD3, une protéine qui joue un rôle dans le maintien de la structure de l'appareil de Golgi -CREB3, un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE) Pour ACBD3, nous avons montré que cette protéine module la réplication du PV et que son effet dépend de la nature de la protéine 3A. En effet, l'acquisition d'une 3A de CV-A17 confère au recombinant un avantage en termes de réplication, avantage dû à une moindre sensibilité à l'effet inhibiteur de ACBD3 sur la réplication (Téoulé F. Et al, Journal of virology 2013). Concernant le facteur de transcription CREB3, nous nous sommes intéressés à une de ses cibles : la protéine Herp, impliquée dans l'homéostasie calcique du RE, compromise pendant l'infection par le PV. Nous avons montré que le module de signalisation CREB3/Herp, activé par le PV aux temps précoces post-infection, limite l'augmentation du calcium cytosolique et l'induction de l'apoptose. Même si le rôle de l'interaction directe entre 3A et CREB3 n'a pas été élucidé, nous avons mis en évidence pour la première fois que le PV active une réponse cellulaire au stress RE. Toutefois, le PV modifie son aboutissement (notamment l'apoptose cellulaire), vraisemblablement pour permettre la réplication virale et éventuellement limiter l'étendue des lésions dans le système nerveux central. De plus, l'étude de CREB3 nous a amenés à identifier une cible cellulaire intéressante pour le développement de nouveaux antiviraux anti-PV : le RIP (module de protéolyse intra-membranaire régulé). Nous avons testé un médicament couramment utilisé comme inhibiteur de protéase dans le traitement de l'infection par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1), le Nelfirlavir. Nous avons montré que celui-ci inhibe la réplication et la production de plusieurs PV d'origine vaccinale ou sauvage, et d'autres membres de la famille des Picornaviridae. Tous ces résultats confirment l'intérêt d'étudier les interactions virus-cellule infectée pour à la fois approfondir les connaissances de virologie fondamentale et pathogénèse du virus d'intérêt, étudier des mécanismes de sélection de souches mutées ou recombinées et éventuellement identifier des nouvelles stratégies antivirales
Poliovirus (PV) is a prototype member of the giant family of RNA+ single stranded virus, Picornaviridae, and it is the etiologic agent of poliomyelitis. Although PV has been studied sine 1949, the molecular virology of this virus has not been fully elucidated. The global vaccination campaign led to the complete eradication of PV in Europe and America and the virus remains endemic only in Nigeria, Afghanistan and Pakistan. Therefore, PV does not constitute a heath burden and a research priority anymore, but it still remains a captivating model of study. In addition, the externe plasticity of this virus together with sub-optimal vaccine coverage in some regions of the world permitted the emergence of new PV-derived pathogenic neurovirulent strains (VDPVs). In particular, these strains originate from the genetic drift of the attenuated oral poliovaccine (OPV) and episodes of genetic recombination with co-circulating enteroviruses (EV) of species C, in particular with the Coxsackievirus A17 (CV-A17). My thesis project focuses on the study of viral-host interaction during PV infection in order to : Propose mechanisms of emergence and selection of recombinant VDPVs Characterize new signaling modules interacting with PV Identify new cellular targets for the development of new PV antivirals, necessary during the post-eradication period The, analysis of the interaction maps of the non-structural protein 3A allowed us to identify new cellular partners: -ACBD3 Golgi-resident protein maintaining the structure of the Golgi organelle -CREB3 transcription factor involved in endoplasmic reticulum (ER) stress In this study, we showed that ACBD3 restricts viral replication and its effect depends on the nature of viral protein 3A. Indeed, the acquisition of a 3A derived from CV-A17 is beneficial for the replication of the recombinant virus, which is less sensitive to the inhibitory effect of ACBD3 (Téoulé F. Et al, Journal of virology 2013). CREB3 is an ER-stress induced transcription factor. One of its targets is the Herp protein, involved in ER calcium (Ca2±) homeostasis via the degradation of the ER-resident Ca2+ channels. During PV infection, a Ca2+ flux from the ER has been reported at late times post infection. In this study, we showed that the signaling module CREB3/Herp, activated at early times post infection, limits Ca2+ flux and PV-induced apoptosis. We provided evidences that PV activates an ER-stress response but modifies its outcome (cell apoptosis) to assist viral replication. Moreover, the anti-apoptotic pathway CREB3/Herp could limit viral-induced damages of the central nervous system. In addition, the study of CREB3 allowed us to identify a target for antiviral therapy: the regulated intramembrane proteolysis (RIP) pathway. We tested an inhibitor of the RIP, originally developed for HIV-1 as a protease inhibitor, Nelfinavir (NFV). Here, we reported the antiviral activity of NFV in vitro against PV and a panel of enteoviruses. Altogether, these results support the interest in studying viral-host interactions to deepen the fundamental knowledge on the molecular virology and pathogenesis of the virus, study new mechanisms of viral emergence and eventually identify new strategies to combat viral infections

La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie virale infectieuse, contagieuse et souvent fatale, qui affecte les animaux domestiques et la faune sauvage de l'Afrique subsaharienne, du Moyen-Orient et de l'Asie du sud-ouest. Cette maladie est due à un virus à ARN négatif monocaténaire non segmenté, de la famille des Paramyxoviridae, genre Morbillivirus et sa réplication est placée sous la dépendance de trois protéines : N, P et L. Le vaccin actuel est une souche virulente atténuée par passages successifs sur cellules VERO. Ce vaccin confère une bonne immunité. N'étant pas un vaccin DIVA, il ne permet de faire, par diagnostic sérologique, la distinction entre les animaux vaccinés-animaux infectés. Le développement, par génétique inverse, d'un clone vaccinal infectieux marqué (vaccin DIVA) est l'objectif principal de ce travail de recherche, associé la mise au point d'outils de diagnostic différentiel. La mise en place de la génétique inverse adaptée au virus de la peste des petits ruminants a été notre premier travail. Elle a été réalisée à l'aide d'un minigénome eGFP, dont le gène ne peut être fonctionnel que dans le contexte d'une expression de type virus PPR. La seconde partie du travail a consisté à assembler, cloner et vérifier l'ADNc du génome complet de la souche virale vaccinale PPRV 75/1. La génération, par génétique inverse, du premier clone infectieux PPR a ensuite été mise en œuvre et est toujours en cours. Les résultats obtenus à ce jour ne permettent pas de conclure à la présence d'un clone infectieux. En parallèle, plusieurs stratégies de marquage du vaccin ont été évaluées : délétion d'un segment de la séquence du génome de la souche vaccinale PPRV 75/1, insertion d'une cassette d'expression d'un gène étranger ou substitution d'une partie d'un gène par une séquence homologue dérivée d'un autre morbillivirus ou d'un peptide commercial. Les marques les plus prometteuses ont été ensuite utilisées pour mettre au point des tests diagnostics ELISA
Peste des Petits Ruminants (PPR) is an infectious, contagious and fatal viral disease of goats, sheep and wildlife in sub-Saharan African countries, Middle-East and South-West of Asia. It is caused by a single strand negative RNA virus belonging to the Morbillivirus genus among the Paramyxoviridae family. Current vaccines consist of viral strains attenuated by several passages on cell cultures. These vaccines protect animals against PPR but they are not DIVA vaccines and thus do not permit the distinction between vaccinated and infected animals. However, the manipulation of negative RNA strand by reverse genetics allows the generation of an infectious and marked clone of PPR vaccine strain. Therefore, the aim of this work was to develop both a PPR marked vaccine using reverse genetics technology and the associated diagnosis tools. The first task was to adapt the reverse genetics to the PPR virus using the eGFP minigenome model. Then the full genome of PPR vaccine strain 75/1 was assembled in a plasmid after translation of genomic negative RNA in cDNA. Attempts to generate the first recombinant PPRV are ongoing but up to now, we cannot conclude on the presence of an infectious rescued virus. In parallel, different strategies for vaccine marks were also evaluated: deletion of a region of PPRV genome, insertion of foreign genes or substitution by homologous sequence derived from another morbillivirus or a commercial peptide. In the same time, ELISA assays corresponding to the most promising markers were developed

Les anticorps monoclonaux (AcM) sont désormais considérés comme une alternative thérapeutique crédible pour traiter les infections virales graves. Comprendre leurs multiples mécanismes d’action est donc crucial pour améliorer leur effet thérapeutique. En utilisant un modèle d’infection virale chez la souris (leucémie induite par le rétrovirus FrCasE), l’équipe a montré qu’une immunothérapie courte par un AcM neutralisant induisait une immunité antivirale protectrice sur le long-terme (effets « vaccinaux ») qui est dépendante du fragment Fc de l’AcM. Ainsi, des immuns complexes (IC) formés à partir de l’AcM thérapeutique et de déterminants viraux, induisent l’activation de cellules immunitaires, notamment les cellules dendritiques (DCs), via leur interaction avec les FcRs exprimés à la surface des cellules. Cependant, ces interactions IC-FcR peuvent également concerner d’autres cellules du système immunitaire outre que les DCs, telles que les macrophages, monocytes ou bien encore les neutrophiles, qui expriment elles aussi les FcRs à leur surface et ce de façon différentielle. Dans ce contexte, il est important d’identifier quels FcRs et quelles cellules les exprimant sont essentiels à l’induction des effets vaccinaux par les AcM. C’est pourquoi mes travaux thèse se sont focalisés sur l’étude du rôle des neutrophiles et des FcγRs dans la modulation de la réponse immune par les AcM. Cette étude repose sur le caractère Fc-dépendant de l’induction d’une réponse immune protectrice par les AcM ainsi que sur les propriétés immunomodulatrices des neutrophiles, qui ont été décrites dans différents contextes pathologiques mais jamais étudiées dans le cadre d’une immunothérapie antivirale par AcM. Pour cela, j’ai utilisé différentes approches in vitro, ex vivo et in vivo.En utilisant le modèle d’infection par FrCasE, il a été montré que les neutrophiles ainsi que le FcγRIV ont un rôle crucial dans l’induction des effets vaccinaux par les AcM, notamment via l’induction d’une réponse humorale antivirale endogène protectrice à très long-terme. De plus lors d’expériences in vitro, il a également été souligné que les neutrophiles sont plus efficacement activés par les IC comparé au virus seul et que différentes cytokines pro-inflammatoires et/ou immunomodulatrices (telles que le TNF et les intérferons de type I et II) potentialisent l’activation des neutrophiles induite par les IC. Mes travaux ont aussi mis en évidence que l’infection virale et l’immunothérapie modulent l’expression des FcRs, et notamment induisent la surexpression du FcRIV sur deux populations distinctes de neutrophiles (différentiées par le niveau d’expression du marqueur de surface Ly6G: Ly6Ghi et Ly6Gint) et sur les monocytes inflammatoires. Enfin, mes travaux montrent que l’immunothérapie par AcM module les profils de sécrétion chimiokinique et cytokinique de ces 3 types cellulaires surexprimant le FcRIV, bien que la nature des profils de sécrétion varie en fonction du type cellulaire et évolue au cours du temps. Ces résultats suggèrent que l’effet immunomodulateur des AcM repose sur l’activation de différents acteurs de la réponse immunitaire précoce, en induisant la sécrétion de chimiokines et de cytokines nécessaires à l’orchestration de la réponse immune. Ils suggèrent aussi une coopération entre ces différents acteurs dans la mise en place d’une immunité protectrice.Pour finir l’ensemble de mes travaux ont mis en évidence un rôle immunomodulateur clé du FcyRIV, ainsi que des différentes cellules l’exprimant, dans l’induction d’une réponse immune protectrice induite par des AcM antiviraux. Ces révélations pourraient avoir des conséquences importantes dans l'amélioration des immunothérapies à base d'AcM
Monoclonal antibodies (mAbs) are now considered as a true therapeutic alternative for treating severe viral infections. Figure out their multiple mechanisms of action is therefore crucial to improve their therapeutic effect. Using a mouse model of viral infection (the FrCasE retrovirus-induced leukemia), the team showed that a short immunotherapy with a neutralizing mAb induces long-term protective antiviral immunity ("vaccine" effects) which is Fc-dependent. Notably, immune complexes (IC) formed with therapeutic mAbs and viral determinants induce the activation of immune cells, especially dendritic cells (DCs) via their interaction with FcγRs expressed on the cell’s surface. However, IC-FcγR interactions can involve different cells of the immune system in addition to DCs, such as macrophages, monocytes or neutrophils, which differentially express FcγRs. In this context, it is important to identify which FcγRs and which FcγR-expressing cells are crucial in the induction of vaccine effects induced by mAbs. It’s the reason why my thesis work has focused on the study of the role of neutrophils and FcγRs in the modulation of immune response by mAbs. This study is based on the Fc-dependent nature of the induction of a protective immune response by mAbs and the immunomodulatory properties of neutrophils, described in different pathological situations but never studied in an mAbs antiviral immunotherapy context. To this end, I used different approaches in vitro, ex vivo and in vivo.By using the FrCasE infection model, it has been shown that neutrophils as well as FcγRIV have a crucial role in the induction of vaccine effects by mAbs, notably via the induction of a long-term protective antiviral humoral response. Moreover the in vitro experiments, highlighted that neutrophils are more effectively activated by IC compared to virus alone and that different pro-inflammatory and/or immunomodulating cytokines (i.e.TNFα and type I and type II interferons) potentiate the activation of neutrophils induced by IC. My work also revealed that viral infection and immunotherapy modulate the expression of different FcγRs, and notably they induce the overexpression of FcγRIV on two distinct populations of neutrophils (differentiated by their expression levels of the Ly6G surface marker: Ly6Ghi and Ly6Gint) and inflammatory monocytes. Finally, my work shows that immunotherapy with Mab modulates the chemokinic and cytokinic secretion profiles of these 3 FcγRIV-over-expressing cell, although the nature of the secretion profiles differs according to the cell type and evolves over time. These results suggest that the immunomodulatory effect of mAbs is based on the activation of different actors of the early immune response by inducing the secretion of chemokines and cytokines necessary for the orchestration of the immune response. They also suggest a potential cooperation between these different actors in the establishment of protective immunity.Altogether, these results show a key immunomodulator role of FcγRIV as well as of different cells expressing it in the induction of a protective immune response by antiviral mAb. They might have important consequences for the improvement of Mab-based immunotherapies

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016
Cette étude visait à caractériser la croissance, la capacité photosynthétique, la concentration en azote et protéines totales solubles, la production de protéines recombinantes (HA) ainsi que la quantité de lumière interceptée à différents stades de développement de plants de Nicotiana benthamiana afin d’optimiser la production de vaccins. L’évolution des réponses physiologiques étudiées fut similaire chez toutes les feuilles primaires, suggérant que le processus de sénescence s’initie et progresse de façon semblable indépendamment de leur ordre d’initiation. Toutefois, la superposition des patrons temporels de sénescence et de croissance foliaire a mené à un rendement HA maximal se situant invariablement dans la partie médiane du plant lorsqu’exprimé sur une base foliaire. À l’échelle du plant entier, nos résultats suggèrent qu’il est possible d’augmenter la production de vaccins en récoltant les plants à un stade de développement plus tardif, ou en augmentant la densité de culture et en récoltant ces plants plus tôt.
Nicotiana benthamiana is a wild relative of tobacco increasingly used as a plant protein expression platform to produce recombinant vaccine antigens against the influenza virus. Investigation on the physiological determinants of this production is essential to optimize and regulate vaccines production following a new flu outbreak. We examined the photosynthetic photon flux density, growth, light-saturated photosynthesis, total soluble protein, nitrogen content and recombinant protein production at different phenological stages. The similar evolution of the studied physiological responses suggested that the senescence process is initiated and progresses in a similar way in all primary leaves, regardless of the order of initiation. In contrast, the superposition of the time pattern of senescence with that of leaf growth shows that maximal HA yield expressed on a leaf basis is invariably located in the middle part of the plant. At the whole plant scale, our results suggest that it is possible to increase the production of antigens by harvesting plants at a later developmental stage, or by increasing plant density and harvesting these plants earlier.

Les connaissances actuelles indiquent la nécessité d’induire une réponse immunitaire à large spectre et notamment des anticorps multifonctionnels pour protéger de l’infection par le VIH. Les approches vaccinales traditionnelles n’étant pas capables d’induire d’anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) suffisamment puissants contre le VIH-1, des stratégies alternatives sont étudiées afin d’induire ces bnAbs. Les avancées majeures concernent le développement de (i) glycoprotéines d’enveloppe optimisées comme immunogène, (ii) vecteurs transportant et présentant l’immunogène de manière efficace et (iii) la forme galénique permettant d’augmenter la durabilité de la réponse protectrice. Dans ce contexte, l’objectif de ce doctorat est d’évaluer les réponses immunitaires induites par des nanoparticules biodégradables fonctionnalisées avec des glycoprotéines d’enveloppe du VIH et d’optimiser la libération prolongée in vivo de l’immunogène. Dans un premier temps, nous avons comparé plusieurs glycoprotéines et sélectionné une glycoprotéine d’isolat primaire optimisée (SOSIP BG505) pour ses capacités à s’adsorber de manière stable à la surface des nanoparticules biodégradables, tout en exposant les épitopes de neutralisation, et capable d’induire in vivo une réponse immunitaire systémique. Nous avons ensuite conçu un hydrogel thermosensible à base de poloxamers capable d’incorporer ces nanoparticules tout en gardant leur stabilité colloïdale et analysé leur biodistribution par imagerie corps entier chez la souris. L’injection par voie sous cutanée de cet hydrogel permet d’induire une réponse immunitaire humorale forte, stable et des IgGs de forte affinité. Cette nouvelle formulation, innovante et simple à mettre en place, apparait comme une nouvelle stratégie de vaccination applicable à de nombreuses pathologies virales nécessitant l’induction d’anticorps neutralisant de forte affinité et à large spectre
Current knowledge indicates the need to induce a broad-spectrum immune response including multifunctional antibodies to protect against HIV infection. As traditional vaccine approaches are not capable of inducing potent broad-spectrum neutralizing antibodies (bNAbs) against HIV-1, alternative strategies are being investigated to induce these bnAbs. Major advances include the development of (i) optimized envelope glycoproteins as immunogens, (ii) efficiently carrying and immunogenic carriers, and (iii) the dosage form that would increase the durability of the protective response. In this context, the objective of this PhD is to evaluate the immune responses induced by biodegradable nanoparticles functionalized with HIV envelope glycoproteins and to optimize the in vivo sustained release of the immunogen.First, we compared several glycoproteins and selected an optimized primary isolate glycoprotein (SOSIP BG505) for its ability to be adsorbed to the surface of biodegradable nanoparticles, while exposing neutralization epitopes, and capable of inducing a systemic immune response in vivo. We then designed a thermosensitive, poloxamers-based hydrogel, capable of incorporating these nanoparticles while maintaining their colloidal stability and we have analyzed their biodistribution by whole-body imaging in mice. The subcutaneous injection of this hydrogel makes it possible to induce a strong, stable humoral immune response with high affinity IgGs. This new formulation, innovative and easy to implement, appears as a new vaccination strategy applicable to many viral diseases requiring the induction of high affinity neutralizing antibodies and broad spectrum

Le HTLV-I est associé à deux pathologies graves chez l'homme, la leucémie à cellule T de l'adulte (ATL) et la paraparésie spastique tropicale (TSP). La glycoprotéine de surface de ce rétrovirus (gp46) est directement impliquée dans la reconnaissance du récepteur cellulaire et doit jouer un rôle dans la pathogenèse. Cette protéine, très immunogène, est un candidat de choix en tant que molécule vaccinale. Pour étudier l'influence de la séquence de la gp46 sur le développement d'une pathologie et sur son antigénicité, nous avons déterminé la séquence nucléotidique de la partie du gène encodant pour la gp46 des virus HTLV-I infectant 26 patients originaires de Martinique et de Guyane, incluant les membres de quatre familles différentes (12 patients martiniquais). La séquence en acides aminés de la gp46 de ces virus a été déduite de la qéquence nucléotidique. L'analyse de ces séquences n'a pas permis de mettre en évidence des mutations associées à l'état clinique des patients (TSP, ATL ou asymptomatique). Nous avons comparé l'ensemble de ces séquences à celles de la littérature et avons défini différents groupes de virus caractérisés par l'association de plusieurs mutations. Certaines de ces substitutions d'acides aminés pourraient modifier considérablement l'antigénicité de la gp46. Nous avons étudié l'incidence de l'une d'entre elles (P vers S en position 192) sur la reconnaissance, par les sérums HTLV-I positifs, de peptides synthétiques correspondant aux régions 186-195 et 190-199 et présentant une proline ou une sérine en position 192. Nous avons ainsi montré que cette mutation modifie effectivement l'antigénicité d'une région immunodominante et neutralisable (190-199). Lors de la mise au point du vaccin, il conviendra de prendre en considération l'existence de tels variants antigéniques du HTLV-I
HTLV-I is associated with two severe pathologies, affecting mankind : Adult T-cell Leukemia (ATL) and Tropical Spastic Paraparesis (TSP). The retrovirus surface glycoprotein (gp46) is involved in cellular receptor binding and could play a role in pathogenesis. This immunogenic protein is a first choice candidate as a vaccin-matter. To investigate the inference of sequence of this glycoprotein on the development of a pathology and on its antigenicity, we have determined the sequence of the env gene encoding gp46 of HTLV-I viruses infecting 26 patients from Martinique and French Guyana. Twelve of them were from four distinct martinican families. Clinical status associated mutations were not observed. These sequences were compared to the ones from literature. Several virus groups were defined, which were caracterised by patterns of associated mutations. Some amino acid substitutions could change the gp46 antigenicity. We studied the incidence of one of these on synthetic peptides recognition by HTLV-I positive sera. Peptides corresponding to 186-195 and 190-199 regions, with a proline or a serine in 192 position, were used. We demonstrated that this mutation modifies the antigenicity of an immunodominant and neutralisable region of the gp46 (190-199). Such antigenic variants of HTLV-I should be considered for the setting of a vaccinal strategy

Le ré-encodage aléatoire des codons à grande échelle est une nouvelle méthode d'atténuation virale qui consiste en l'insertion d'un grand nombre de mutations synonymes, individuellement peu délétères, de façon aléatoire dans une ou plusieurs régions codantes d'un virus. Cette approche permet de diminuer de façon significative et modulable le fitness réplicatif des virus in cellulo et in vivo, ainsi que la pathogénicité du virus chez la souris, tout en induisant une protection immunitaire spécifique et efficace lors d'une nouvelle infection par le virus sauvage. Les virus ré-encodés présentent également une grande stabilité et une absence de réversion ce qui en font des candidats vaccins très prometteurs en termes d'efficacité et de fiabilité pour la conception de candidats vaccins vivants atténués contre une grande variété de virus à ARN. La combinaison du ré-encodage aléatoire et d'une nouvelle méthode de génétique inverse permettant de générer de nouveaux virus en quelques jours: ISA (Amplicon Subgenomique Infectieux), est une approche prometteuse qui pourrait aider au développement de vaccins vivants atténués de nouvelle génération en un temps record
Large-scale random codon re-encoding is a new method of viral attenuation consisting in the insertion of a high number of slightly deleterious synonymous mutations, randomly, in one or several coding regions of a virus. This approach significantly reduces the replicative fitness of re-encoded viruses in cellulo and in vivo, as viral pathogenicity, while inducing a specific and effective immune response in mice against a new infection with wild-type viruses. Re-encoded viruses also present a high stability and an absence of reversion, making them promising vaccine candidates in term of reliability and efficiency for the conception of new vaccine candidates against a wide variety of RNA viruses. Combination of random re-encoding with a new method of revers genetics allowing to generate new viruses in days : ISA (Infectious Subgenomic Amplicons) would be very helpful to develop new-generation vaccine candidates

Le virus respiratoire syncitial (rs), appartenant a la famille des paramyxoviridae, est un agent etiologique qui infecte couramment le nourrisson et l'enfant. Les recherches actuelles confirment que les proteines immunologiquement importantes sont les glycoproteines de l'enveloppe virale : la proteine de fusion f et la proteine d'attachement g sur laquelle est trouvee des differences antigeniques majeures entre le sous groupe a et le sous groupe b du virus rs. Trudel et coll. Ont definis des epitopes protecteurs des proteines f et g a l'aide de peptides de synthese : f#2#2#1#-#2#3#4, f#2#7#5#-#2#8#8, f#3#8#5#-#3#9#6 et g#1#7#4#-#1#8#7. Les genes codant des epitopes f et g ont ete assembles, polymerises et combines par deux methodes : l'une est basee sur une enzyme de restriction bspm1 permettant la polymerisation de l'epitope en tete a queue, l'autre est basee sur les billes magnetiques couplees a la streptavidine. Dans escherichia coli, deux vecteurs d'expression sont bases sur le domaine de fixation de l'igg (zz) de la proteine a du staphylocoque et sur le domaine de fixation de l'albumine (bb) de la proteine g du streptocoque. Les produits issus de genes zz-epitope sont secretes dans le milieu de culture de e. Coli, purifies en une seule etape par affinite sur igg sepharose et sur albumine sepharose respectivement. Le sproteines de fusion ont ete admistrees chez les souris ; seules zz-f#2#7#5#-#2#8#8 et zz-g(#1#7#4#-#1#8#7)3 ont confere une legere protection lors du challenge avec le virus rs. L'epitope g(#1#7#4#-#1#8#7)3 a ete fusionne a un recepteur d'albumine (bb) et clone dans un vecteur navette e. Coli-staphylococci. Les analyses par immunofluorescence et par immunogold ont montre que la proteine de fusion bbg(#1#7#4#-#1#8#7)3 est bien exposee a la surface membranaire des cellules recombinantes de staphylococcus xylosus, a l'aide des anticorps lapin specifique, de type humorale, a ete induite apres l'immunisation par voie orale des souris avec les s. Xylosus recombinants, suggere que ce type de bacterie gram positive pourrait etre un vecteur potentiel pour la vaccination par voie orale.

Le Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsable de lymphomes T du poulet, est contrôlé par le vaccin CVI988/Rispens. Mes travaux de thèse ont montré que le vaccin était composé, au contraire des souches virulentes, d’une population dynamique de variants viraux majoritairement délétés de la région promotrice et d’une partie variable de l’extrémité 5’ du gène LAT codant des microARN et associé à la latence virale. Dans une approche vaccinale, un virus recombinant correspondant à l’un des variants majoritaires du vaccin CVI988/Rispens a été généré à partir d’une souche GaHV-2 hypervirulente, clonée en bacmide. Nous avons montré que ce recombinant, présentant une perte de pathogénicité presque totale, était capable de protéger significativement les poulets lors d’une épreuve avec des souches GaHV-2 hypervirulentes. Ces travaux posent les bases du développement de nouveaux vaccins à partir de souches hypervirulentes émergentes
Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsible for T-cell lymphomas chicken, is controlled by the vaccine CVI988/Rispens. My work has shown that the vaccine contains, unlike virulent strain, a viral variants population mostly deleted from the promoter region and a variable portion of the 5' end of the gene LAT encoding microRNA and associated with viral latency. In a vaccine approach, a recombinant virus corresponding to a majority variant of the CVI988/Rispens vaccine was generated from a hypervirulent strain GaHV-2, cloned as bacmid. We showed that recombinant, with an almost total loss of pathogenicity, was able to significantly protect chickens against challenge with virulent strains GaHV-2. This work lays the basis for the development of new vaccines from emerging virulent strains

Le rhinovirus (RV) est connu pour être l'étiologie de plus de la moitié des rhumes bénins. Ces virus ont également été associés à des pathologies respiratoires beaucoup plus graves (asthme, bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et mucoviscidose). Le développement d'inhibiteurs de décapsidation du virus, appelés agents « capsid-binders », est ainsi devenu une priorité pour de nombreux laboratoires de recherche. Dans ce contexte, une classe d’inhibiteurs se liant au sein de la poche hydrophobe de la protéine capsidaire VP1 a été développée par notre équipe au travers d’une stratégie radicalaire médiée par le TDAE (Tétrakis(DiméthylAmino)Ethylène). Dans le but de poursuivre les investigations sur le hit LPCRW_0005, un travail de pharmacochimie a été entrepris selon deux approches. Dans un premier temps, une optimisation de la taille du LPCRW_0005 a été envisagée par un allongement du squelette chimique. La conception de ces molécules a été guidée par l’utilisation de modélisation moléculaire via la réalisation de docking rigide ligand/protéine. La synthèse de nombreux composés et leur évaluation in vitro, ont permis de mieux apprécier le potentiel biologique de ce type de dérivés. L’identification de la configuration active du centre stéréogène porté par le linker alcool a été rendue possible par la séparation énantiosélective de certains inhibiteurs suivie d’une caractérisation basée sur un protocole de Mosher. Dans un second temps, une étude comparative des séquences primaires protéiques, nous ont conduits à concevoir de nouveaux composés afin de développer des « capsid-binders » à plus large spectre d'action
Rhinovirus (RV), virus of Picornaviridae family, is known to be the aetiology of more than half of the common cold. Through advances in molecular biology, the rhinoviruses have been associated with much more serious respiratory pathologies (asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and cystic fibrosis). So, the development of viral attachment and/or uncoating inhibitors named « capsid-binders » molecules has become a priority for many research laboratories. In this context, a class of inhibitors binding into a hydrophobic pocket of the VP1 capsid protein has been identified by our team through a TDAE strategy. In order to follow the investigations on the LPCRW_0005 hit, a pharmacochemistry work was begun according to two approaches. Initially, an optimisation of the LPCRW_0005 size was envisaged by an extension of the scaffold via various pallado-catalyzed cross-coupling reactions. The design of these molecules was guided by the use of molecular modeling via a rigid ligand/protein docking. The synthesis of many compounds and their in vitro biological evaluation on HeLa cells infected with the rhinovirus 14 (RV-B14), refined our knowledge about the biological potential of such a scaffold. The enantioselective separation of some inhibitors followed by a Mosher’s protocol allowed us to identify the active configuration of the alcohol linker. Finally, a comparative study of protein primary sequences as well as drug design, led us to design and develop more potent broad-spectrum capsid-binders

The emergence of viruses with zoonotic potential, i.e. with the potential ability to cross species barriers to infect unnatural hosts, poses a huge threat to humans. It is therefore essential to develop new methodologies to rapidly and efficiently generate attenuated virus vaccine candidates to attempt to control the threat. Viruses need to be able to at least partially inhibit the host’s innate defence mechanism, known as the interferon (IFN) system, to replicate efficiently in vivo and establish a productive infection. It has been previously reported that viruses that have lost their ability to circumvent the host’s IFN response, or IFN-sensitive viruses, are promising candidates for live attenuated virus vaccines. Here we report on the development of a cell-based method to attempt to rapidly select IFN-sensitive viruses that can not block IFN signalling, from wild-type virus populations. Lentivirus vectors containing selection markers (HSV-tk – Herpes Simplex virus thymidine kinase gene and pac – puromycin resistance gene) under the control of a tight IFN-inducible promoter (the murine Mx1 promoter) were generated and used to specifically engineer HEp2 cell lines, termed Mx GIPSE and Mx TIPSE, for this purpose. The developed methodology relies on the engineered cell lines and a selection procedure using exogenous IFN-α and puromycin: if a cell is infected with IFN-resistant virus, it will die in the presence of IFN-α and puromycin because IFN signalling will be blocked, thereby blocking the activation of the Mx1 promoter and consequent expression of pac; if a cell is infected with an IFN-sensitive virus, it will survive in the presence of IFN-α and puromycin because the Mx1 promoter will become activated through the IFN signalling pathway, leading to the expression of pac. IFN-sensitive viruses can then be rescued from the surviving cells, and amplified using IFN-permissive cell lines expressing viral IFN antagonist proteins (proteins that block the host’s IFN response). When tested on PIV5 strains CPI- (an IFN-sensitive virus) and CPI+ (an IFN-resistant virus), the developed method allowed the survival and amplification of cells infected with CPI-, whilst cell death was observed for cells infected with CPI+. Whilst the developed methodology seems promising, further developments of the system are required. The possibilities of using the developed methodology in combination with other techniques, such as FACS sorting and immune selection, to rapidly select IFN-sensitive mutant viruses from wild-type and mutagenised virus populations are discussed. The potential to use Mx TIPSE cells to select IFN-resistant revertant viruses from IFN-sensitive virus populations is also discussed. In addition, a high throughput screening assay has been developed using the engineered Mx GIPSE and Mx TIPSE cell lines to search for compounds that block IFN signalling or that block the action of viral IFN antagonist proteins. Compounds that block IFN signalling would potentially be useful as anti-inflammatory drugs whilst compounds that block the action of viral IFN antagonist proteins would be valuable as antiviral drugs.

La génétique inverse est la manipulation génétique des virus à ARN pour créer un virus de type sauvage ou modifié. Les techniques de génétique inverse conduit à bien comprendre les fonctions des gènes viraux et leur pathogénicité dans les cellules d’hôte ou de vecteur. Les virus à ARN comme les arbovirus ceux qui ont comme vecteurs les arthropodes représente une vraie menace pour la santé humaine mondiale. Les techniques de génétique inverse sont un moyen adéquat pour protéger l’homme contre les virus par la création des vaccins at par bloquer leur transmission par les vecteurs comme les moustiques. De nos jours, la plupart des systèmes de génétique inverse se concentraient exclusivement sur l’étude d’interaction entre les virus et les cellules de mammifères. Cependant, la transmission de l'arbovirus se situe entre un hôte mammifère et un vecteur d'invertébré.Nous présentons ici ISA (Infectious-Subgenomic-Amplicons) comme une méthode universelle de génétique inverse qui a prouvé son applicabilité sur les cellules de mammifères et de moustiques pour générer des virus infections ARN simple brin de polarité positive.Ainsi, ISA est une méthode adéquate pour étudier le cycle de vie de l'arbovirus chez le moustique vecteur et l'hôte mammifère at ainsi avoir une idée générale de la circulation de l’arbovirus pour créer d’autre outils de blocage
Reverse genetics, the genetic manipulation of RNA viruses to create a wild-type or modified virus, has led to important advances in our understanding of viral gene function and interaction with host cells. Since arboviruses the most threatening viruses to human and animal are RNA viruses, thus reverse genetics is an extremely powerful technique with important application for the protection from these viruses and to control their spread.Hitherto, most reverse genetics systems focused exclusively on mammalian cells. However, arbovirus transmission is between a mammalian host and invertebrate vector.Herein, we present ISA (Infectious-Subgenomic-Amplicons) as a universal reverse genetic method that proved it applicability to rescue infectious single stranded positive RNA viruses on mammalian and mosquito cells.Thereby, ISA is an adequate method to study the arbovirus life cycle in mosquito vector and mammalian host. Thus, providing information about the global arbovirus circulation to provide further technique that protect mammalian from their infection and inhibit vector to transmit the virus

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas
African swine fever (ASF) is an infectious disease of domestic pigs and wild boars with mortality rates reaching up to 100% and is endemic in most of the Sub-Saharan countries. In 2007 it was introduced in Georgia and spread to neighbouring countries, reaching the Russian Federation, several European countries and, more recently, China and Vietnam (February 2019). Currently, there is neither a vaccine nor a treatment against ASF and the control of the disease depends strictly on sanitary measures, including stamping out and trade bans of animals and pork products leading to devastating socio-economic losses to affected countries. The etiologic agent of the disease is African swine fever virus (ASFV), a large (approx. 190 nm) double-stranded DNA (170 to 193 kbp) enveloped virus. ASFV genome encloses more than 150 open reading frames (ORFs) and to this date most of them lack any known or predictable function. ASFV is quite independent from cellular machinery encoding enzymes required for replication, transcription and virion assembly, including the putative I215L E2 Ubiquitin-conjugating enzyme, QP509L, Q706L RNA Helicases and the P1192R type II topoisomerase. The E2 ubiquitin-conjugating enzymes are part of the essential cellular post-transcriptional regulation ubiquitin-proteasome pathway. In this study, the pI215L binding activity was characterized as being mono and poly-ubiquitinated in the Cys85 at different temperatures and pH values. Moreover, I215L gene is transcribed from 2 hours post infection (hpi), and immunoblot analysis confirmed that pI215L is expressed from 4 hpi being detected all over the cell specially in the viral factories from 8 hpi. Downregulation assays by siRNA suggested that pI215L plays a critical role in the transcription of late viral genes and in viral DNA replication. RNA helicases are described as essential for infections, modulating RNA-RNA and RNA-protein interactions, gene expression, viral egress and host antiviral responses. In the present work, we found that QP509L, Q706L are conserved between ASFV virulent and non-virulent isolates. Furthermore, ASFV-QP509L and Q706L are actively transcribed from 2 hours post infection, and both proteins are localized in the viral factories at 12 hours post infection. However, QP509L was also detected in the cell nucleus. Transcript downregulation uncovered the essential role of these proteins during viral cycle progression, in particular for the late transcription. Type II topoisomerases are involved in resolving DNA tangles and supercoils by cutting the duplex and allowing the DNA replication to proceed. In this study, we report that P1192R is actively transcribed throughout infection, being detected from 2 hpi and reaching a maximum concentration around 16 hpi. P1192R knockdown experiments revealed its critical role for viral infection, given by a reduction in viral transcripts, cytopathic effect, the number of viral factories per cell, and virus yields. We also demonstrated that enrofloxacin exposure during the late phase of infection induces viral genomes fragmentation, whereas, when added at early phase of infection completely abolishes replication. The data obtained from I215L, QP509L. Q706L and P1192R characterization studies opens new venues to the rational design of a mutant virus lacking these genes, and also points new pathways to be targeted by antiviral drugs.
RESUMO - Caracterização funcional de proteínas do vírus da peste suína Africana putativamente envolvidas na transcrição e replicação com o intuito de desenvolvimento de uma vacina. - A peste suína africana é uma doença viral infeciosa que afeta os suínos domésticos e os selvagens, com taxas de mortalidade perto dos 100%, originando perdas económicas elevadas nos países afetados. A doença é endémica na maioria dos países subsaarianos, e desde 2007, assistiu-se uma expansão nos países Europeus, incluindo membros da União Europeia, e mais recentemente, na China e Vietname. Atualmente não existe vacina ou tratamento para esta infeção e o controlo da doença baseia-se no diagnóstico rápido, na eliminação compulsiva dos suínos e no bloqueio ao comércio de suínos e produtos derivados. O agente etiológico é o vírus da peste suína africana (VPSA), um vírus composto por uma molécula de ADN de cadeia dupla (170 to 193 kbp) contendo mais de 150 grelhas de leitura. Algumas destas estão devidamente caracterizadas codificando para proteínas estruturais ou regulatórias, contudo, a grande maioria foi identificada por homologia de sequência com outros vírus não se conhecendo, até à data, qual a sua função durante a infeção. Apesar dos inúmeros esforços ao longo dos anos, a complexidade viral, a falta de conhecimento sobre muitos dos aspetos da biologia do vírus e das suas interações com o hospedeiro invalidaram a obtenção de uma vacina segura e eficaz. Por um lado, as abordagens clássicas embora promissoras não garantem proteção contra estirpes heterólogas, enquanto a produção de vacinas de ADN ou proteína, mesmo com adjuvantes, não induzem imunidade contra uma segunda infeção. No entanto, a identificação de suínos previamente infetados e que resistem a novas infeções reforça a ideia da possibilidade de se obter uma imunidade protetora. Dadas as circunstâncias atuais de expansão da doença, estudos recentes apontam a necessidade de se aprofundar o conhecimento sobre os aspetos da biologia do VPSA com vista a identificação de novas estratégias para o desenvolvimento racional de vacinas ou de identificação de novos alvos para o uso de fármacos com vista a controlar a infeção. Neste contexto, os estudos apresentados neste trabalho caracterizam a I215L, QP509L, Q706L e P1192R, identificadas inicialmente, por homologia de sequência com outras proteínas tipicamente envolvidas na replicação e transcrição de outros vírus. A I215L foi identificada por partilhar identidade com as enzimas E2 de conjugação da ubiquitina. Estas enzimas pertencem a uma cadeia de sinalização do sistema de regulação pós-transcricional ubiquitina-proteossoma. Os estudos realizados revelaram que a pI215L tem a capacidade de receber uma ou duas ubiquitinas (mono e di-ubiquitinada) no resíduo Cisteína-85, a diferentes temperaturas e valores de pH, evidenciando a sua plasticidade em participar em diferentes fases da infeção quer no hospedeiro quer no vetor. Além disto, o gene é transcrito precocemente (2 horas após infecção, hpi) e a proteína expressa desde as 4h, sugerindo que esta deverá ser necessária desde o início da infecção. Paralelamente, os nossos estudos por imunofluorescência revelaram uma distribuição da pI215L por toda a célula, e em especial, nas fábricas virais, sugerindo um papel ativo na regulação de vários processos, incluindo replicação de ADN e da transcrição. Os ensaios de ARN de interferência (siRNA) contra o I215L demonstraram um papel essencial desta proteína durante a infeção, originando uma redução dos transcritos tardios, do número de genomas (-63 a -68%) e na libertação de partículas infeciosas (até -94%). [...]
N/A

La dengue est une maladie ré-émergente qui menace le tiers de la population mondiale, et pour laquelle aucun vaccin n'est disponible. Dans ce travail, nous avons évalué une nouvelle stratégie de vaccination basée sur l'expression d'un antigène combiné du virus de la dengue par un vecteur dérivé du vaccin vivant atténué pédiatrique contre la rougeole. La compréhension des mécanismes de neutralisation des flavivirus par les anticorps est essentielle pour la conception d’approches vaccinales innovantes contre la dengue. C’est pourquoi, dans un premier temps, nous avons étudié le mécanisme de l’inhibition de fusion par des anticorps neutralisants dirigés contre les trois domaines de la protéine d’enveloppe (E). Le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) a été utilisé comme modèle dans des tests de fusion, de neutralisation et d’association aux membranes lipidiques. Les résultats montrent, que les anticorps peuvent interférer avec les étapes précoces ou tardives du processus de fusion. Cette étude montre aussi que les anticorps dirigés contre le domaine III de la protéine E peuvent bloquer à la fois l’entrée et la fusion virale. Pour faire la preuve de concept de notre stratégie de vaccination, nous avons donc inséré dans le vecteur rougeole le domaine III de la glycoprotéine E (EDIII) qui contient le site de liaison au récepteur ainsi que des épitopes neutralisants sérotype-spécifiques. Pour renforcer son immunogénicité, le EDIII a été fusionné à l'ectodomaine pro-apoptotique de la protéine de membrane (ectoM) du VDEN-1. Testé chez des souris sensibles à la rougeole, ce candidat vaccin s’est montré immunogène et capable d'induire des anticorps neutralisants sérotype-spécifiques à long terme. La présence de l'ectoM a été déterminante pour l'immunogénicité du EDIII. Sa capacité adjuvante a été corrélée avec sa capacité à induire la maturation des cellules dendritiques et à favoriser la sécrétion de cytokines pro inflammatoires et antivirales ainsi que des chimiokines impliquées dans l'établissement de l'immunité adaptative. Un candidat rougeole-dengue tétravalent a été ensuite construit dans le but d’induire la même immunité contre les 4 sérotypes du virus de la dengue. Cette stratégie de vaccination combinée rougeole-dengue permettrait d’offrir des vaccins pédiatriques accessibles particulièrement attrayants pour immuniser les enfants simultanément contre la rougeole et la dengue dans des régions du monde où les deux maladies coexistent
Dengue fever is a reemerging disease that threatens one third of the world's population, for which no vaccine is available. In this work, we evaluated a new vaccination strategy based on the expression of a combined dengue antigen by a vector derived from the pediatric live attenuated measles vaccine. Understanding the mechanisms of flavivirus neutralization by antibodies is essential for the design of innovative vaccine approaches against dengue. Therefore, as a first step, we studied the mechanism of inhibition of fusion by neutralizing antibodies directed against the three domains of the envelope protein (E). The Tick-borne encephalitis virus (TBEV) was used as a model in in vitro fusion tests, and coflottation assays with lipid membranes. The results showed that the neutralizing antibodies can interfere with the early or late stages of the fusion process. This study also shows that antibodies against domain III of the E protein can block both the viral entry and fusion. As a proof-of-concept of our vaccination strategy, we inserted into measles vector the domain III of the glycoprotein E of dengue virus (EDIII), which contains the putative receptor binding site and serotype-specific neutralizing epitopes. To strengthen its immunogenicity, EDIII was fused with the pro-apoptotic ectodomain of the membrane protein (ectoM) of VDEN-1. Tested in mice susceptible to measles, this vaccine candidate was immunogenic and able to induce long term serotype-specific neutralizing antibodies. The presence of the ectoM proved crucial for the immunogenicity of EDIII. Its adjuvant capacity correlated with its ability to mature dendritic cells and to enhance the secretion of proinflammatory and antiviral cytokines, as well as chemokines involved in the development of adaptive immunity. A tetravalent measles-dengue candidate was then generated in order to induce the same immunity against the 4 serotypes of dengue virus. This vaccination strategy combining measles and dengue might offer an affordable pediatric vaccine particularly attractive to immunize children both against measles and dengue fever in areas of the world where the two diseases co-exist

Influenza vaccination is the best preventive measure against influenza virus infection, and antivirals including oseltamivir are effective treatments. From a public health point of view, it is important to evaluate whether vaccination and antiviral treatment reduces transmission of the virus. I analyzed data from a community-based study of influenza virus transmission in households, and identified effectiveness of antiviral treatment in reducing duration of illness and some evidence that treatment reduced transmission to household contacts. I also analyzed data from a community-based placebo-controlled trial of influenza vaccination and confirmed efficacy of vaccination against seasonal influenza but differential efficacy against pandemic influenza possibly because of timing and mediation of seasonal influenza epidemics. In further analyses I found that antibody titers of 1:40 correlated with 50% protection against infection, and repeated vaccination with the same strains tended to be associated with reduced responses to those strains although there was no evidence of reduced efficacy. In the study, one child in each household was randomly allocated to receive vaccine or placebo and I did not identify any evidence of indirect benefits to the household members of vaccinated children. I reviewed vaccine target groups in different countries, and noted that some countries now include school-age children in their target groups based mainly on the principle of herd immunity. My findings did not support the inclusion of school-age children as a target group for vaccination in Hong Kong. Further studies should examine the indirect as well as direct benefits of vaccination in different settings in order to guide optimal influenza vaccination policies.
published_or_final_version
Community Medicine
Doctoral
Doctor of Philosophy

La thymidylate kinase du virus de Vaccine (VaccTMPK) présente une spécificité de substrat plus étendue que celle de son homologue humain. Elle est capable de catalyser la phosphorylation de TMP, dUMP mais surtout du dGMP. Les paramètres cinétiques obtenus pour le TMP sont proches de ceux de la TMPK humaine (kcat = 2 s-1 ; KM = 20 µM). Les données cristallographiques de l’enzyme virale liés au TDP montre que VaccTMPK adopte le même repliement que l’enzyme humaine avec une association orthogonale des sous-unités, probablement due à un défaut de compaction au niveau du domaine à NMP. Cette singularité permet à l’enzyme de lier des susbtrats plus volumineux comme le dGMP et le 5-bromo-vinyl-dUMP et s’accompagne d’une stabilité moins grande comme l’indiquent les expériences de microcalorimétrie. Dans le cadre de la recherche de nouveaux substrats antipoxvirus de VaccTMPK, une série de phosphonates analogues du dUMP, composés d’une partie acyclique de 3, 4 ou 5 carbones à la place du désoxyribose, ont été testés pour leur réactivité avec les TMPK virale et humaine. De plus, un groupement méthyle-, halogène- ou aryl- est ajouté en position C5 de la base. Les dérivés methylés ou halogénés, des séries allyl- et pentenyl-, sont substrats des TMPKs alors que les dérivés substitués par un aryl- ne le sont pas. D’autre part, une série d’analogues alkylés et oxydés de dGMP a été testés pour leur réactivité avec VaccTMPK et la GMPK humaine. Ils sont tous substrats des deux enzymes sauf le O6-Me-dGMP qui est spécifiquement phosphorylé par VaccTMPK

Rift Valley Fever is a zoonotic, arthropod-borne disease that adversely affects ungulates and people. The etiologic agent, Rift Valley fever virus (RVFV; Bunyaviridae, Phlebovirus), is primarily transmitted through mosquito bites, yet can be transmitted by exposure to infectious aerosols. Presently, there are no licensed vaccines or therapeutics to prevent or treat severe RVFV infection in humans. We have previously reported on the activity of favipiravir (T-705) against the MP-12 vaccine strain of RVFV and other bunyaviruses in cell culture. Additionally, efficacy has been documented in mouse and hamster models of infection with the related Punta Toro virus. Here, we characterize a hamster RVFV challenge model and use it to evaluate the activity of favipiravir against the highly pathogenic ZH501 strain of the virus. Subcutaneous RVFV challenge resulted in substantial serum and tissue viral loads and caused severe disease and mortality within 2-3 days after infection. Oral favipiravir (200 mg/kg/day) prevented mortality in 60% or greater in hamsters challenged with RVFV when administered within 6 h post-exposure and reduced RVFV titers in serum and tissues relative to the time of treatment initiation. In contrast, although ribavirin (75 mg/kg/day) was effective at protecting animals from the peracute RVFV disease, most ultimately succumbed from a delayed-onset neurologic disease associated with high RVFV burden in the brain observed in moribund animals. When combined, T-705 and ribavirin treatment started 24 h post-infection significantly improved survival outcome and reduced serum and tissue virus titers compared to monotherapy. Our findings demonstrate significant post-RVFV exposure efficacy with favipiravir against both peracute disease and delayed-onset neuroinvasion, and suggest added benefit when combined with ribavirin.

Includes bibliographical references (leaves 65-77).
The anti-poxvirus agent SECOMET V was the reference name for a plant extract produced in a bioreactor from primary plant stem cells, whose antiviral activity has been widely reported in folklore medicine. It exerted its anti-vaccinia virus activity by neutralizing cell-free virus rather than interfering with the downstream events following adsorption.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, na especialidade de Sanidade Animal.
African swine fever virus (ASFV) is a nucleo-cytoplasmic large DNA virus which infects all members of the family Suidae, causing a fatal disease of domestic swine and wild boar. Since no effective vaccine or treatment is available, ASF is considered a global threat for pig husbandry. The ASFV genome encodes among others, enzymes required for virion assembly, genome transcription and replication, including a putative histone-like protein, pA104R. In bacteria, these proteins perform topological modification of the chromosome (twisting, bending and folding), playing important structural and regulatory functions. Since ASFV has a large genome, a viral histone-like protein may be important for packaging its genome within the virion particle and/or for viral replication and transcriptional events. In this study, the ASFV-pA104R activity was characterized and its DNA-binding activities were evaluated. pA104R binds both to ssDNA and dsDNA, although having higher affinity to ds-DNA, over a wide range of temperatures, pH values, and salt concentrations and in an ATP-independent manner, with an estimated binding site size of about 14 to 16 nucleotides. The arginine residue located in pA104R’s DNA-binding domain, at position 69, also revealed to be important for an efficient DNA-binding. Additionally, since pA104R together with the viral type II topoisomerase, pP1192R, displayed DNA-supercoiling activity, a synergistic effect between these viral is proposed. The expression of pA104R was observed in the late phase of infection in infected cells with the Vero-adapted ASFV isolate Ba71V, co-localizing with cell nucleus and viral factories. siRNA experiments showed that the knockdown of A104R induce a reduction of viral progeny, copy numbers of viral genomes and transcription of a late viral gene, revealing that pA104R plays a critical role in viral DNA replication and gene expression. Results obtained on these studies prompted us to pursue the objective to generate a defective infectious single cycle (DISC) ASFV lacking the A104R gene. Recombinant virus was successfully obtained, however the complementary cell line previously developed did not support its replication. The antiviral activity of four HDACi against ASFV was also evaluated in this study. The results showing the abrogation of viral replication by NaPB open new insights on its use as an antiviral strategy to control ASFV spreading. Overall our data strongly support that pA104R plays an important role on ASFV replication opening a new window for the design of ASF control measures through the development of efficient and safe vaccines and antivirals.
RESUMO - Modulação da estrutura cromatínica e da expressão génica durante a infeção do Vírus da Peste Suína Africana – novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina eficaz - O vírus da peste suína africana (VPSA) é um vírus de DNA nucleo-citoplasmático que infeta todos os membros da família Suidae, causando uma doença com elevada mortalidade em suínos domésticos e nos javalis. Atualmente não existe uma vacina ou tratamento eficaz, tornando a peste suína africana (PSA) uma ameaça para a suinicultura mundial. O genoma do VPSA codifica aproximadamente 150 proteínas, algumas delas bem caracterizadas, estando envolvidas na transcrição, replicação ou na montagem do virião. No entanto, e apesar de todos os esforços realizados nas últimas décadas, a função biológica de numerosas proteínas virais não é ainda conhecida. Esta lacuna aliada à necessidade de um melhor entendimento sobre a biologia do VPSA e as suas interações com o hospedeiro têm contribuído em grande parto para a dificuldade no desenvolvimento de uma vacina eficaz contra PSA. Por homologia de sequências proteicas, o genoma do VPSA codifica para uma proteína tipo histona (pA104R). Nas bactérias, estas proteínas são responsáveis por modular a topologia do DNA (torção, flexão e dobramento), desempenhando assim importantes funções estruturais e controlando a expressão de diferentes genes. O facto do genoma do VPSA codificar entre outras uma proteína viral semelhante a histonas bacterianas, reveste-se assim de enorme relevância pelo papel que que estas proteínas possam desempenhar na compactação do genoma na partícula viral e/ou para a sua replicação e transcrição. Neste contexto, este estudo pretendeu caracterizar o papel da VPSA-pA104R na replicação viral, tendo como objetivo contribuir para o conhecimento da biologia deste vírus e para averiguar se o gene A104R será um bom candidato para desenvolver uma vacina DISC (do inglês “defective infectious single cycle). Além disso, diferentes inibidores das histonas deacetilases (HDACs) foram testados como potenciais antivirais, eventualmente úteis no controlo da PSA Os principais objetivos deste trabalho foram assim os seguintes: (1) estudar VPSA-pA104R, através da clonagem, expressão, purificação e caracterização de sua atividade in vitro; (2) Compreender a relevância funcional de dois resíduos conservados de pA104R; (3) Avaliar os níveis de mRNA e proteína, bem como a localização intracelular de pA104R em células infetadas com VPSA, em diferentes tempos de infeção; (4) Desenvolver uma estratégia que permita a deleção da ORF A104R do genoma do VPSA e a obtenção de uma vacina DISC; (5) avaliar os níveis de acetilação das histonas das células infetadas para melhor compreensão do mecanismo de modulação dos mecanismos epigenéticos do hospedeiro pelo VPSA; (6) Avaliar o efeito dos inibidores das HDACs na infeção pelo VPSA. Neste estudo, a VPSA-pA104R foi expressa num sistema procariota baseado em Escherichia coli. Após a sua purificação, a sua atividade foi caracterizada através de ensaios EMSA (do inglês “electrophoretic mobility shift assay”) e concluiu-se que esta proteína viral se liga tanto a DNA de cadeia simples como dupla, embora tenha maior afinidade para o de cadeia dupla, e estimou-se que o local de ligação seja cerca de 14 a 16 nucleótidos. Esta ligação ao DNA continua presente em variadas condições de temperaturas, pH e concentrações de sal e é independente de ATP. A perda de atividade da proteína mutada pontualmente no resíduo de arginina localizado na posição 69, revelou que este resíduo é importante para uma ligação eficaz ao DNA. Além disto, foi possível concluir que a carga positiva deste aminoácido é determinante para a capacidade de ligação do pA104R ao DNA. Adicionalmente, uma vez que se observou atividade de superenrolamento de DNA quando a pA104R e uma topoisomerase tipo II viral, pP1192R, foram adicionados a DNA plasmídeo relaxado, este trabalho suporta que o VPSA codifica de facto para proteínas necessárias a compactação do seu genoma e ainda é proposto a existência de um efeito sinérgico entre as duas proteínas virais acima descritas. Como o objetivo de melhor compreender a importância da pA104R na infeção do VPSA, avaliou-se a dinâmica da sua expressão e a sua localização intracelular. A expressão de pA104R foi observada na fase tardia da infeção em células Vero infetadas com o isolado viral Ba71V, co-localizando com núcleo da célula e fábricas virais citoplasmáticas. Em relação à dinâmica de transcrição do gene A104R, apesar de ser típica de um gene tardio, foi possível detetar transcritos a partir das 2 horas pós-infeção (hpi). As experiências usando siRNA (do inglês “small interference RNA”) contra os transcritos do gene A104R, mostraram que a redução dos níveis de RNA deste gene induzem uma redução da progenia viral, do número de cópias de genomas virais e da transcrição de um gene viral tardio (B646L), revelando que o pA104R desempenha um papel crítico na replicação do DNA viral e na expressão de genes virais. Atualmente, as únicas medidas de controlo do VPSA são baseadas na deteção precoce da doença e na rápida aplicação de medidas biossanitárias como o abate de animais infetados, controlo do movimento de animais e a vigilância. As tentativas falhadas até agora em obter uma vacina inativada ou atenuada permitem que novas estratégias, como as vacinas DISC ganhem espaço na investigação do VPSA como uma revigorante estratégia para controlar o VPSA. Os resultados obtidos neste estudo, anteriormente descritos, suportam a ideia que um mutante de deleção no gene A104R replicará o seu genoma nas células hospedeiras, mas não poderá compacta-lo dentro do virião, resultando num virião não-infecioso "vazio" que será incapaz de iniciar um segundo ciclo de infeção. Assim a infeção com este vírus mutante será capaz de estimular o sistema imunitário do hospedeiro, mas ao mesmo tempo será seguro, não produzindo progenia infeciosa. Assim outro objetivo deste trabalho foi então obter um vírus DISC deletado no gene A104R. Para isto, o vírus recombinante foi obtido por recombinação homóloga e uma linha Vero complementar, que expressa a pA104R, foi desenvolvida. Embora, o vírus recombinante tenha sido obtido com sucesso, a linha celular complementar desenvolvida não suporta a sua replicação e, como tal, a seleção e propagação do vírus recombinante não foi possível. Os baixos níveis de expressão de pA104R destas células quando comparados com os de células infetadas poderão explicar esta não complementação. Com base em estudos anteriores que mostram que VPSA regula o estado epigenético da célula hospedeira, o grau de acetilação das histonas de células infetadas foi avaliado e a atividade antiviral de quatro inibidores das HDACs (NaPB, VPA, TSA e SAHA) contra a infeção pelo VPSA também foi testada neste estudo. O VPSA induz uma hipoacetilação dos resíduos de lisina 9 e 14 da histona H3 (H3K9K14). Esta modificação epigenética corrobora outras reportadas noutros estudos e todas elas estão classicamente correlacionada com o silenciamento de genes em células eucarióticas e pode indicar que o VPSA subverte diferentes mecanismos celulares, controlando o acesso da maquinaria de transcrição aos genes hospedeiros. Adicionalmente, um dos inibidores das HDACs testados, o NaPB, reverte este estado de hipoacetilação da histona e inibe a replicação do VPSA, interferindo com a expressão de gene virais tardios. Os resultados obtidos neste estudo sugerem fortemente que a pA104R participa da modulação da topologia do DNA viral, estando envolvida na replicação, transcrição e/ ou compactação do DNA viral. Com o objetivo de desenvolver uma vacina DISC, o gene A104R poderá assim constituir um bom alvo a deletar. Esta nova estratégia poderá ser uma alternativa às tentativas até agora falhadas de obter uma vacina contra a PSA. Contudo, antes de uma vacina DISC ser realidade, um esforço científico no desenvolvimento de uma linha celular complementar será imperativo. Os resultados obtidos sugerem ainda que as HDACs celulares estão envolvidas no estabelecimento de infeção pelo VPSA e revelaram que o NaPB pode ser usado como uma estratégia antiviral adicional para controlar a propagação de vírus nas áreas de surto.
N/A

The interferon (IFN) system is integral to antiviral innate immunity in vertebrate hosts. Inside a cell, viral pathogen associated molecular patterns (PAMPs) trigger the IFN response, comprised of IFN induction and an IFN-induced antiviral state. However, viruses have evolved strategies to counteract the IFN system. The E3 protein of vaccinia virus (VV), encoded by the E3L gene, impedes cytokine expression and suppresses the activation and function of antiviral proteins. Deletion of the E3L gene (VVΔE3L) produces an IFN sensitive mutant virus that is replication defective in most human cell lines. Due to the limited human cell lines available to support VVΔE3L replication, the capacity of E3 inhibition of human IFN-induced antiviral activities is not well defined. In this study, VVΔE3L was generated and characterized to facilitate the study of other viral IFN antagonists at modulating human IFN-induced antiviral responses. A human liver carcinoma cell line, Huh7, was found to support VVΔE3L replication. A comprehensive analysis of VVΔE3L IFN sensitivity revealed E3 inhibits all human type I and type II IFN-induced antiviral activities by modulation of the protein kinase R (PKR) pathway. Influenza non-structural protein 1 (NS1) is well-known to mediate the suppression of IFN induction and IFN action in influenza virus infections. However, the IFN antagonizing potential of influenza NS1 may be virus subtype and/or isolate specific. VVΔE3L was next applied as an expression vector to study influenza NS1 function in modulating IFN-induced antiviral activities and IFN induction in human cells. Recombinant viruses were generated to express influenza NS1 (from avian H5N1 and pandemic viruses 1918 pH1N1, 1968 pH3N2, and 2009 pH1N1) in replacement of E3. It was found that influenza NS1 inhibits human IFN-induced antiviral activity in a subtype and isolate specific manner. Moreover, influenza NS1 differentially regulates human IFN expression in a virus isolate-dependent manner. Altogether, this work highlights the potential of VVΔE3L as an excellent virus model system to study viral proteins modulating IFN expression and IFN-induced antiviral activities in human cells.