Academic literature on the topic 'Vecteurs de clonage'

Différents types de vaccins sont actuellement disponibles ou en cours de développement. Ils peuvent être divisés en deux catégories : vaccins vivants et vaccins inertes. Les vaccins vivants traditionnels incluent des souches atténuées par des moyens conventionnels, comme la croissance dans des conditions de culture inhabituelles (bactéries), ou dans des cellules ou des animaux vis-à-vis desquels les souches ne sont pas initialement adaptées (virus). Les nouvelles générations de vaccins vivants utilisant les techniques de recombinaison génétique (vaccins recombinants) peuvent être fabriquées par mutagénèse dirigée de gènes de virulence, ou par clonage de gènes de protéines immunogènes dans des vecteurs viraux ou bactériens qui possèdent les propriétés souhaitées d’innocuité et d’efficacité. Les vaccins inactivés conventionnels sont fabriqués par traitement des microorganismes par des agents physiques ou chimiques. Dans la mesure où les fractions immunogènes des microorganismes sont de mieux en mieux connues, elles peuvent être utilisées pour fabriquer des vaccins ne comprenant que ces fractions immunogènes majeures (vaccin subunitaires) par purification, ou par expressionin vitro de protéines (un autre type de vaccin recombinant) ou enfin synthèse chimique de peptides. Récemment, il a été démontré, chez différentes espèces, que l’inoculation directe dans le muscle d’un gène codant pour une protéine immunogène (immunisation génétique) permettait d’induire une réponse immune cellulaire et humorale. Cette méthode correspond à un dernier type de vaccin recombinant. L’immunité systémique et muqueuse obtenue après injection de vaccin vivant est comparée à celle obtenue après injection de vaccin inerte.

Les Cowdria ont été purifiées par centrifugation en gradient de densité. L'ADN a été utilisé pour la construction de banques génomiques d'expression. La protéine immunodominante Cr32 a été purifiée et la séquence N-terminale d'acides aminés déterminée. Les banques génomiques d'expression ont été criblées avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine Cr32, mais aucun n'a réagi. Une partie du gène codant pour la Cr32 a ensuite été amplifiée utilisant des amorces provenant de la séquence N-terminale et d'une autre séquence d'acides aminés interne. La séquence amplifiée a servi de sonde pour détecter le fragment d'ADN génomique codant pour la protéine Cr32. Ce fragment, provenant du stock Sénégal de Cowdria ruminantium, a alors été cloné. Une partie du gène, représentant les deux tiers de la longueur totale, a été exprimée dans le vecteur pGEX2T. Le produit d'expression obtenu est reconnu par les anticorps monoclonaux spécifiques de la Cr32.

Allèle : une des formes alternatives d'un locus. Dans une cellule diploïde, il y a deux allèles pour chaque locus (un allèle transmis par chaque parent), qui peuvent être identiques. Dans une population, on peut avoir plusieurs allèles pour un locus.Annotation structurale : repérage des coordonnées des diverses structures dans le génome, telles que les gènes.Annotation fonctionnelle : renseignements sur les fonctions des séquences, le plus souvent pour les gènes.BAC : Bacterial Artificial Chromosome. Vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant un grand fragment d’ADN génomique (taille > 100 kb*). Les BAC assemblés en contigs* sont à la base des cartes physiques du génome.Carte cytogénétique : carte des chromosomes. Réalisée par localisation visuelle (FISH*) au microscope de fragments d’ADN sur les chromosomes au stade métaphase de la mitose.Carte d’hybrides irradiés : réalisée en testant par PCR la présence ou l’absence de fragments d’ADN dans une collection de clones d’hybrides irradiés (RH*). Deux fragments d’ADN sont proches sur le génome s’ils sont trouvés fréquemment dans les mêmes clones.Carte génétique : obtenue par l’étude de la ségrégation dans des familles ou des populations, de marqueurs polymorphes, soit moléculaires, soit phénotypiques, deux séquences étant d’autant plus proches qu’elles sont souvent transmises ensemble lors de la méiose.Clonage positionnel : stratégie visant à identifier un gène responsable de l’expression d’un phénotype en utilisant des informations de position sur le génome.Contig : ensemble de clones (le plus souvent des BAC*) ou de lectures de séquence ordonnés grâce à des informations sur leur parties chevauchantes.Cosmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragments d’ADN génomique de taille avoisinant les 50 kb*.CNV : Copy Number Variation ; polymorphisme du génome correspondant à la variation du nombre de copies d’une séquence, pouvant dans certains cas contenir un ou plusieurs gènes.Déséquilibre gamétique : pour deux loci quelconques, c'est le fait que la fréquence des haplotypes* estimée pour tous les gamètes est différente de celle attendue à partir du produit des fréquences alléliques de chaque locus. Synonyme : déséquilibre de liaison. Contraire de : équilibre gamétique.Dominance : qualificatif de l’effet d'un allèle, dont une copie suffit à l'expression du phénotype* approprié. L’allèle A est dominant sur l’allèle a si l’hétérozygote* Aa a le même phénotype* que l’homozygote AA.EST : Expressed Sequence Tag : séquences étiquettes (partielles) de transcrit, obtenues par séquençage aléatoire d’ARN.Evaluation génomique : évaluation de la valeur génétique d’individus d’après leurs génotypes pour un ensemble de loci distribués sur le génome, d’après des équations établies à partir des performances d’individus de référencephénotypés et génotypés.Expression génique : études visant à estimer le niveau de production (expression) des gènes en fonction d’états physiologiques ou de tissus différents.Exon : fraction de la partie codante d’un gène eucaryote. Les gènes des organismes eucaryotes sont le plus souvent fractionnés en plusieurs séquences d’ADN dans le génome, les exons, séparés entre eux par d’autres séquences (introns*).FISH : Fluorescent In Situ Hybridisation. Hybridation de sondes d’ADN marquées à l’aide d’un fluorochrome, sur des chromosomes au stade métaphase de la mitose. Permet la réalisation de la carte cytogénétique.Fingerprinting : technique permettant d’estimer très grossièrement la similarité entre des séquences d’ADN sans les séquencer, par la comparaison des longueurs de bandes produites par des enzymes de restriction coupant l’ADN à des sites précis.Fosmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragment d’ADN génomique de taille déterminée et égale à 40 kb*.FPC : FingerPrint Contig* ; contig* de clones (généralement des BAC*) ordonnés par la technique du fingerprinting, afin d’obtenir une carte physique du génome.Génotype 1 : constitution génétique d'un individu. 2. Combinaison allélique* à un locus particulier, ex: Aa ou aa.Haplotype : combinaison allélique spécifique pour des loci appartenant à un fragment de chromosome défini.Héritabilité au sens strict : proportion de la variance phénotypique due à la variabilité des valeurs génétiques = proportion de la variance phénotypique due à la variance génétique additive.Hétérozygote : individu ayant des allèles non identiques pour un locus* particulier ou pour plusieurs loci. Cette condition définit l’ «hétérozygotie». Contraire de: homozygote.Homologues : séquences similaires en raison d’une origine évolutive commune.Hybride irradié : cellule hybride obtenue par fusion entre cellules hôte d’une espèce et donneuse d’une autre espèce, contenant une fraction aléatoire du génome de l’espèce donneuse, après cassures par irradiation, reconstitution aléatoire de chromosomes ou insertion dans des chromosomes de la cellule hôte et rétention partielle. Deux séquences proches sur le génome sont en probabilité dans les mêmes clones RH*, tandis que deux séquences distantes ont une probabilité faible d’être conservées ensemble.IBD : pour identity by descent. Identité entre deux chromosomes (ou parties de chromosomes), liée à leur descendance d’un même chromosome ancestral.Indel : Insertion – deletion ; polymorphisme de présence ou absence d’un ou plusieurs nucléotides.Intron : séquence non-codante dans les gènes, séparant les exons, qui codent pour une protéine.Kb : kilobase ; séquence de mille paires de bases (pb*).Locus (pl. : loci) : Site sur un chromosome. Par extension, emplacement d’un gène ou d’un marqueur génétique sur un chromosome.Marqueur génétique : séquence d'ADN dont le polymorphisme est employé pour identifier un emplacement particulier (locus) sur un chromosome particulier.Mate-pair : séquences appariées (1 à 10 kb* de distance), produites en circularisant les fragments d’ADN, puis par séquençage à travers le point de jointure.Mb : mégabase ; séquence d’un million de paires de bases (pb*) de longueur.Orthologues : séquences homologues* entre deux espèces.Paired-end : séquences appariées produites par la lecture des deux extrémités de courts fragments d’ADN (moins de 500 pb*) dans le cas des nouvelles technologies de séquençage.Paralogues : séquences homologues* résultat de la duplication d’une séquence ancestrale dans le génome. Il s’agit de deux (ou plus) séquences similaires par homologie dans un même génome.Pb : paire de base ; unité de séquence d’ADN, représentée par une base et sa complémentaire-inverse sur l’autre brin.Phénotype : caractère observable d'un individu résultant des effets conjugués du génotype et du milieu.Phylogénomique : utilise les méthodes de la génomique et de la phylogénie. Par la comparaison de génomes entiers, permet de mettre en évidence des pertes et gains de gènes dans les génomes, ainsi que leur variabilité moléculaire, afin (entre autres buts) d’aider à prédire leur fonctions.Plasmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragment d’ADN génomique de taille allant de 500 pb* à 10 kb* environ.Polymorphisme d'ADN : existence de deux ou de plusieurs allèles* alternatifs à un locus.Puce à ADN ou puce pangénomique : Système permettant pour un individu le génotypage simultané de très nombreux marqueurs génétiques (de quelques milliers à quelques centaines de milliers).QTL : abréviation de locus à effets quantitatifs (de l’anglais Quantitative Trait Locus).Récessivité : qualificatif de l’effet d'un allèle, où l'homozygotie* est nécessaire pour l'expression du phénotype* approprié. opposé de : dominance*.RH : Radiation Hybrid (hybride irradié*)Sanger (méthode de) : méthode de séquençage publiée en 1977 (Sanger et al 1977) et encore utilisée de nos jours avec les séquenceurs à électrophorèse capillaire.Scaffold : ensemble de contigs* de séquence reliés entre eux par des informations apportées par des lectures appariées (mate-pairs* ou paired-ends*).Sélection assistée par marqueurs (abréviation : SAM) : utilisation d’un jeu restreint de marqueurs de l'ADN pour améliorer la réponse à la sélection dans une population : les marqueurs sont choisis comme étroitement liés à un ou plusieurs loci cibles, qui sont souvent des loci à effets quantitatifs ou QTL*.SNP : polymorphisme d'un seul nucléotide à une position particulière de la séquence d’ADN (abréviation de l’anglais Single Nucleotide Polymorphism).Supercontig : nom alternatif pour les scaffolds*.WGS : Whole Genome Shotgun ; production de lectures de séquence d’un génome entier de manière aléatoire.

Quoiqu’entré dans le langage courant, le terme de “biotechnologies” a gardé une signification quelque peu imprécise. Au sens large, les biotechnologies peuvent être définies comme un ensemble de techniques et de connaissances permettant d’exploiter les propriétés du vivant à des fins d’application. Sous cette acception, les biotechnologies sont aussi vieilles que nos civilisations puisque l’homme s’est servi très tôt - bien sûr sans le savoir - de micro-organismes pour fabriquer des aliments tels le pain, le fromage et des boissons fermentées. Mais ce sont les avancées spectaculaires de la biologie moderne, notamment celles de la biologie moléculaire, qui élargissent presque à l’infini le champ d’application potentiel des biotechnologies. C’est le cas, entre autres, des applications possibles à l’élevage des progrès de la biologie animale. Le présent ouvrage regroupe, sur les biotechnologies animales, huit contributions qui représentent un spectre très large d’applications : produits issus de procédés biotechnologiques (vaccins, hormone), techniques de reproduction, aide à l’ amélioration génétique, transgenèse et nouveaux outils d’analyse de mécanismes biologiques. Prenant le contre-pied d’une certaine partie de la littérature antérieure sur le sujet, qui se présente comme une sorte d’hymne un peu naïf à la modernité, ces textes sont inspirés par le souci de replacer les biotechnologies dans leur contexte d’application réel, qu’il soit actuel ou potentiel, en essayant de dégager les perspectives et les limites de leur utilisation, tant du point de vue économique que de celui de l’acceptabilité par le citoyen. Dans cette optique, il est intéressant de rapprocher certaines des contributions présentées. Le premier rapprochement suggéré est celui des contributions traitant de l’utilisation de produits issus des biotechnologies, les vaccins et l’hormone de croissance recombinante. Dans le cas de la fabrication des vaccins, les progrès de la biologie moléculaire, associés à ceux des connaissances sur les agents pathogènes et le déterminisme de leur virulence, ont ouvert une série de voies nouvelles (vaccins recombinants, vecteurs inertes ou subunitaires). Toutefois, comme le remarque M. Eloit, ces produits ne sont pas encore entrés en force sur le marché pour des raisons d’ordre pratique et économique. En effet, les vaccins “de nouvelle génération” ne sont pas forcément à ce stade plus intéressants que les vaccins conventionnels existants, et ne sont pas nécessairement plus faciles à produire quand ces derniers n’ont pas pu l’être. On a donc ici le cas d’applications très attendues, ne posant pas de problème majeur d’acceptabilité par le public, mais qui n’ont pas encore débouché autant qu’on pouvait l’espérer. Bien entendu, il reste encore une marge de progrès considérable, et la vaccinologie moderne ne peut qu’aboutir, à l’avenir, à des obtentions significatives. A l’opposé, la production industrielle d’hormone de croissance recombinante est bien maîtrisée. Par ailleurs, une somme importante de connaissances, synthétisées par Y. Chilliard et coll., a été accumulée sur les effets zootechniques de cette hormone -positifs- ainsi que sur son mode d’action et sur les conséquences prévisibles de son utilisation au niveau des élevages et de la filière. Mais on sait que l’utilisation de cette hormone recombinante est interdite en Europe pour des raisons socio-économiques : il s’agit du refus de voir encore accélérer le processus de concentration des élevages avec ses conséquences sur la déprise de certaines zones agricoles, ainsi que de la crainte d’une dégradation de l’image des produits laitiers. On a donc ici le cas, inverse du précédent, d’un outil techniquement au point mais dont l’utilisation, pourtant fortement voulue par les lobbies industriels intéressés, se heurte à des oppositions inspirées par le souci de l’intérêt général. Le second groupe d’articles qu’il est intéressant de rapprocher est celui des biotechnologies de la reproduction : insémination artificielle, cryoconservation des gamètes, transplantation embryonnaire, sexage des embryons, fécondation in vitro et clonage embryonnaire. Il s’agit des contributions de J. Mallard et J.-C. Mocquot, J.-J. Colleau et coll., et G. Maisse et coll. L’insémination artificielle, et notamment son application aux bovins laitiers, est l’exemple par excellence d’une technologie de la reproduction ayant connu un plein succès. Comme le notent J. Mallard et J.-C. Mocquot, on dispose dans ce cas du recul nécessaire pour analyser tous les effets de l’utilisation de cette technologie, bien au point chez les bovins, qui sont considérables. Associée à la congélation du sperme, l’insémination artificielle a surtout permis le testage des mâles puis l’utilisation préférentielle des sujets améliorateurs ainsi repérés. Or, même si le terme de “testage” n’existait pas encore, l’idée d’une pratique consistant à observer la descendance des taureaux pour pouvoir ensuite en utiliser les meilleurs préexistait, avant sa réalisation effective, chez les plus clairvoyants des éleveurs et des cadres de l’élevage. On a, sur ce point, des témoignages datant de plus de 75 ans. Il est donc fondamental de prendre conscience du fait que la technologie de l’insémination artificielle associée à la congélation du sperme est venue répondre à un besoin latent très fort, ce en quoi elle représente un cas de figure très particulier. La situation n’est pas tout à fait comparable pour les autres biotechnologies de la reproduction - transplantation embryonnaire, sexage des embryons, clonage embryonnaire - qui répondent certes à des besoins, mais à des besoins beaucoup moins caractérisés et plus réduits que le précédent. L’article de J.-J. Colleau et coll. permet de préciser les limites techniques et économiques de l’utilisation de ces nouveaux outils de la reproduction, ainsi que leurs perpectives d’application dans les programmes d’amélioration génétique, c’est-à-dire dans le cadre d’une démarche d’intérêt collectif. Curieusement, la cryoconservation des gamètes, routinière dans certaines espèces, est loin d’être au point dans d’autres, alors qu’elle pourrait rendre de grands services dans le cadre de la sélection et dans celui de la préservation des ressources génétiques. La contribution de G. Maisse et coll. fait le point des travaux qui se poursuivent chez les poissons, où de nombreuses difficultés restent à résoudre. Au début des années 80, période pendant laquelle, selon la formule de J. Mallard et J.-C. Mocquot, le terme de biotechnologies était “majoritairement décliné au futur”, la transgenèse a été volontiers présentée comme le substitut moderne aux méthodes de la génétique quantitative utilisées pour l’amélio ration génétique des espèces d’élevage. La lecture des contributions de D. Boichard et coll. sur l’utilisation des marqueurs moléculaires en génétique animale et de L.M. Houdebine sur la transgenèse animale confirme à quel point ces prévisions étaient naïves. A l’heure actuelle, deux constats principaux doivent être faits. Tout d’abord, la transgenèse appliquée à la création de souches des grandes espèces animales est encore balbutiante, surtout par manque de techniques vérita blement opérationnelles. En second lieu, les travaux d’analyse des génomes animaux qui, eux, progressent très vite, doivent permettre, dans un avenir proche, de détecter les principales régions chromosomiques impliquées dans le déterminisme des caractères économiques et d’intégrer cette masse d’informations nouvelles dans le processus de sélection. Il s’agira du début d’une nouvelle phase décisive de l’histoire de la génétique appliquée aux espèces d’élevage. Les progrès auront donc été beaucoup plus significatifs que pour la trans genèse. A l’avenir, celle-ci devrait bénéficier des résultats de ces travaux d’analyse du génome, ne serait-ce que pour identifier des gènes dont le transfert ou la mutation pourrait s’avérer judicieux. Il restera quand même à prendre en compte, dans le contexte futur encore incertain, les limites de l’acceptabilité par le public des obtentions transgéniques. Last but not least, il ne faut pas oublier que les nouvelles biotechnologies sont à leur tour des outils très puissants d’analyse des mécanismes du vivant. La contribution de T. Pineau donne l’exemple des avancées en cours dans les domaines de la pharmacologie et de la toxicologie. En définitive le bilan qui peut être fait aujourd’hui des avancées des biotechnologies animales peut paraître contra sté, surtout si on se réfère aux prévisions faites il y a une quinzaine d’années par les bateleurs de la Science. De nos jours, l’affichage des perspectives d’application des biotechnologies reste parfois contaminé par la nécessité devant laquelle se trouvent les équipes, engagées dans la chasse aux crédits, de justifier leurs travaux par la promesse de retombées concrètes. Toutefois, la lecture du présent document montre que, dans certains domaines, les choses ont déjà beaucoup avancé. Par ailleurs, les perspectives de progrès de la biologie animale sont encore considérables, tout comme les perspectives d’application des biotechnologies qui en décou leront. Mais beaucoup d’inattendu étant devant nous, on se gardera ici d’être plus précis dans les prédictions !

Un vecteur navette s'exprimant chez e. Coli et bacteroides a été construit par l'association d'un plasmide cryptique de 4,6 kb, d'un plasmide dérivé de pBR 322 et d'un fragment de 4,2 hb du plasmide pBFTM10. Ce plasmide confère la résistance à différents antibiotiques suivant la bactérie où il est inséré. Les régions nécessaires à la réplication chez bacteroides ont été identifiées - un deuxième vecteur navette a été construit, et s'exprime chez e. Coli, b. Distasonis et b. Ruminicola. Ces plasmides peuvent être utiliser pour clouer des gènes de bacteroides chez e. Coli, puis pour étudier leur expression dans des souches de bacteroides hétérologues.

L'integration de plasmides en des points predetermines du chromosome d'escherichia coli, et les possibilites ainsi offertes: cartographie, etude de l'activite des genes ou des effets du contexte nucleoidique, clonage ou echange d'alleles, prise en charge de la replication par le plasmide integre, sont realisables a l'aide d'outils distincts aux possibilites limitees. L'objet de cette etude a ete la mise au point d'un plasmide vecteur a replication regulee par l'operateur de maniere thermo-independante. Le replicon de depart a ete cole1, tandis que le systeme lac a servi a l'asservissement du nombre de copies. Le chapitre 1 decrit la derivation d'un vecteur, pam9, a partir d'un plasmide a replication dependante du promoteur lacuv5. Pam9 peut s'integrer par homologie et prendre en charge la replication du chromosome. Toutefois, pla51 et ses derives apparaissent n'exister qu'a l'etat trimerique, ce qui en limite l'utilite. Le chapitre 3 decrit la construction de nouveaux vecteurs a nombre de copies modulables, pam34 et pam35, portant la region regulatrice de l'operon lac substitue au promoteur de l'arn ii amorce, et conservant les elements regulateurs rnai-rnaii et rom. Le chapitre 4 porte sur la replication de ces plasmides. Celle de pam34, porteur de lacl, est strictement dependante de la presence d'inducteur. Ceci permet la selection de l'integration du plasmide au chromosome, la prise en charge de sa replication, et le clonage par recurrence de region proches. J'ai montre aussi que pam34 est un agent efficace pour la chasse de vecteurs de meme incompatibilite. Les proprietes de pam34 permettent son emploi pour diverses manipulations genetiques et pour les etudes de la replication du chromosome et du cycle cellulaire. Ces perspectives sont abordees dans la discussion finale

Le transposon Mariner Mos 1 a la capacité intrinsèque de changer de position dans le génome. Le premier axe de mes travaux de thèse est consacré aux caractéristiques du transposon influençant l'activité de transposition de l'élément Mos1 (dont la composition nucléique du transposon et sa taille). Il a permis de montrer qu'un de transgène de taille supérieure à 2,5kb limite l'efficacité de transposition, qu'un fort pourcentage en GC favorise la transposition, et qu'il n'existe pas de taille minimale pour la transposition de Mos1. Le deuxième axe de recherche porte sur l'adaptation et l'amélioration du système Mos1 au contexte des cellules eucaryotes, pour développer un vecteur intégratif non viral de transfert de gène. L'ajout d'une séquence de localisation nucléaire améliore le transfert du noyau, l'humanisation de la séquence de la transposase augmente son expression en cellules de mammifères, et l'utilisation d'un système suicide HSVVtK permet de limiter les évènements de recombinaison
The mariner Mos 1 transposon can naturally move into the genome. The first research axis of this work concern the transposon characteristics which act upon the transposition activity of Mos1 (like the nucleic content of the transposon and its size). It have shown that a size of transgene upper than 2,5 kb limit the transposition efficiency, that a strong GC percentage favour the transposition, and that there is no minimal size for Mos1 transposition. The second research axis concern the adaptation and improvement of the Mos1 system to the eukaryotic cells, to developp a nonviral vector for gene transfer. The addition of a nuclear localization sequence improve the nuclear transfer, the "humanization" of the transposase sequence increase it expression in mammal cells, and the use of the HSVtK suicide system permit to limit the recombination events

Les adénovirus (Ad) sont des agents de transfert de gène efficaces. Ils sont des vecteurs de choix pour l’étude de la mucoviscidose (MV). La MV est une maladie génétique, due à des mutations dans le gène CFTR, qui se caractérise par une atteinte respiratoire sévère. Nous avons étudié l’expression de la protéine CFTR fusionnée à la GFP apportée par un vecteur adénoviral dans des lignées cellulaires trachéales glandulaires et des cultures primaires pulmonaires. Notre construction GFP-CFTR s’est montrée parfaitement fonctionnelle et le signal GFP permet le suivi du produit du transgène dans la cellule. A haute dose virale, un effet négatif sur l’activité CFTR a été observé et associé à la voie d’entrée du virus dépendante de la base de penton. Un nouveau vecteur chimérique portant une fibre de sérotype 35 dépourvu de toxicité et exprimant la construction GFP-CFTR a été construit pour une application thérapeutique. Outre la MV, les vecteurs Ad ont été ciblés sur des lignées de cellules tumorales. Par insertion de molécules appelées Affibody™ fixant le domaine Fc des anticorps dans la fibre, les vecteurs ont pu être reciblés vers des marqueurs cellulaires de cancer du sein et ovarien
Adenoviruses (Ad) are efficient gene transfer vectors. In this study, Ad vectors were developed for cystic fibrosis (CF), a genetic disease characterized by pulmonary complications due to mutations in the CFTR gene. The aim of this work was to construct an Ad5/GFP-CFTR vector which would allow the tracking of both the cellular localization and chloride channel function of the CFTR protein in Ad-transduced cells. The gene delivery of GFP-CFTR by Ad to CFTR-deficient human airway epithelial and tracheal cells showed correction of chloride channel CFTR activity and apical localization of GFP-CFTR. However, the Ad5 vector showed inhibition of CFTR activity at high vector doses which was associated to the penton base-integrin entry pathway. A chimeric Ad5/Fi35 vector was developed which had no toxic effect on the CFTR activity and efficiently transduced lung cells. This work also concerned the re-targeting of Ad vectors to different cell types of interest. Novel Ad vectors with fibers carrying AffibodyTM molecules which bind the Fc domain of antibodies were developed to allow re-targeting of Ad to specific cell receptors using antibodies

Les vecteurs retroviraux offrent des possibilites d'utilisation en recherches fondamentale et appliquee. Dans le cadre d'un transfert de genes in vivo, les stocks vecteurs viraux doivent presenter un titre eleve en particules et ne pas contenir de forme virale parasite. De plus ces vecteurs une fois integres ne doivent pas pouvoir ressortir de la cellule dans laquelle ils ont ete introduits. Il faut donc pouvoir perdre au cours de la replication du genome retroviral un element necessaire a la production du stock viral mais inutile par la suite dans la cellule cible. Il est rapporte que de petites structures secondaires peuvent etre deletees lors de la transcription inverse. Nous avons utilise cette propriete afin de deleter la sequence d'encaspidation suite a son introduction entre une sequence sens-antisens pouvant former une structure secondaire. Il a fallu etudier les effets d'une sequence antisens dans un vecteur retroviral depuis les cellules productrices en passant par l'encapsidation, et jusqu'au provirus integre. Cela a permis de mettre en evidence qu'une large sequence antisens (692nt) entrainait une instabilite des arnm vecteurs dans les cellules productrices suite a l'action de desaminases cellulaires sur les structures secondaires. Les arnm vecteurs modifies par cette activite et encapsides, donnent naissance a des provirus comportant dans 100% des cas la deletion de la totalite, ou presque, des sequences pouvant former une structure secondaire sur l'arn viral ; toutefois, les residus de sequences sens-antisens entrant dans la structure secondaire presentent une modification nucleotidique caracterisee par la transition ag. Pour rendre moins instables les arnm vecteurs, la sequence antisens situee en 3' de la sequence d'encapsidation a ete reduite a 48nt dans le vecteur pfas22. La production de ce vecteur en condition helper free a permis de mettre en evidence une stabilite des arnm vecteurs et un taux de deletion des sequences sens-antisens encadrant la sequence d'encapsidation de 61%. Ces resultats permettent d'obtenir des donnees fondamentales sur la presence et le devenir de structures secondaires pouvant se former sur un arnm viral et des donnees pouvant etre mises a profit dans le but d'optimiser les vecteurs retroviraux pour des applications de therapie genique.

Un systeme de transfert de genes est constitue de 2 composantes : un vecteur et une lignee transcomplementante qui permet sa production sous forme de particules retrovirales. Ce travail a eu pour principal objectif d'ameliorer la composante vecteur d'un systeme retroviral. Le vecteur etudie possede une sequence d'integration surnumeraire (sequence att) en position interne, entre 2 genes de selection (neo sous controle de la ltr et puro sous controle d'un promoteur interne). L'analyse de clones d'infection a mis en evidence un mecanisme d'integration atypique pour 31% des provirus (clivage imprecis des extremites virales, duplications de taille incorrecte et frequentes deletions d'adn genomique au cours de l'integration), qui pourrait resulter du clivage de la sequence att interne par l'integrase, bien que l'existence d'un precurseur att-ltr issu de la transcription inverse ne puisse etre exclue (1). D'autres provirus integres selon le mecanisme classique, par le biais des ltr, presentent des duplications de taille incorrecte qui pourraient s'expliquer par un mauvais positionnement de l'in du a des homologies de sequences entre adn viral et adn cellulaire (2). Le vecteur att presente des proprietes autodeletantes qui permettent de reduire le risque de mobilisation du vecteur en cas de surinfection. L'efficacite de ce processus d'autodeletion peut etre amelioree en augmentant la pression de selection sur le gene puro (75% des provirus sont bornes par la sequence att interne et la ltr3' et plus de 92% sont non mobilisables). La production du vecteur est augmentee d'un facteur 10 par la deletion du signal de polyadenylation du gene puro ou bien le retournement de la cassette de selection puro. L'efficacite de transduction du gene puro est amelioree par l'augmentation de la taille de la sequence att interne (3). Enfin, nous avons montre que le vecteur att conserve ses proprietes autodeletantes sur cellules humaines (4). Ces resultats presentent un nouveau type de vecteur autodeletant qui pourrait etre utilise pour des applications de transfert de genes ou de therapie genique.

La souche mutante, rhodococcus sp. Acv2 est capable d'hydrolyser l'adiponitrile en adipate d'ammonium plus efficacement que la souche sauvage rhodococcus sp. R312. Sa nitrile hydratase est capable d'hydrater plus rapidement les mononitriles issus de l'adiponitrile. Il convenait de determiner la structure primaire de l'enzyme. Une banque cosmidique a ete construite chez escherichia coli. Le criblage par hybridation sur colonies a l'aide d'une sonde specifique a permis d'isoler un cosmide contenant le gene de la nitrile hydratase. Le sequencage d'un fragment de 1,7 kb a permis d'identifier les genes ntha et nthb codant pour les deux sous-unites de l'enzyme et de reperer une mutation affectant le gene nthb. Cette mutation se traduit, au niveau du 40#i#e#m#e acide amine de la sous-unite beta, par le remplacement d'une methionine par une valine chez la souche mutante acv2. Une sequence conservee, susceptible d'etre le site de fixation de l'atome de fer des nitrile hydratases, a ete reperee au niveau de la sous-unite alpha. Les plasmides pbl33 et prc1 de brevibacterium linens atcc 9174 et rhodococcus rhodochrous atcc 4276 ont ete employes pour construire des vecteurs navettes entre rhodococcus sp. Et e. Coli. Les plasmides construits, psp33 (replicon de pbl33) et pspc1 (replicon de prc1), porteurs du gene de resistance aphl provenant du transposon tn903, conferent la resistance a la neomycine a rhodococcus sp. R312. Ces plasmides devraient permettre le transfert des genes clones chez rhodococcus sp. Une etude du genome de rhodococcus sp. R312 par electrophorese en champ pulse a ete realisee. La taille du chromosome est estimee a 6,44 mb. Les genes ntha et nthb ainsi que le gene amie codant pour l'amidase generale ont ete localises sur des fragments de restriction. Ces travaux constituent une etape preliminaire a l'elaboration d'une carte physique du chromosome de rhodococcus sp. R312

Le développement et l'utilisation des vecteurs recombinants dérivés de l'Adeno-Associated Virus (AAVr) pour le transfert de gènes in vivo n'ont cessé de croître au cours des dix dernières années. . . . . . Ces lignées d'encapsidation, dérivées des cellules HeLa, produisent des particules d'AAVr de façon efficace après infection par un adénovirus sauvage. Cela s'accompagne d'une synthèse importante de protéines Rep et Cap qui sont produites suite à l'amplification des séquences rep-cap intégrées (Chadeuf et ai. , J. Gene Med. , 2000). Au cours de ce travail de thèse, nous avons précisément caractérisé ce phénomène et défini les acteurs essentiels impliqués en trans (Tessier et ai. , J. Virol. , 2001). De plus, nous avons isolé, dans le génome rep-cap de l'AAV de type 2, un nouvel élément de réplication impliqué en cis dans l'arnplîfication des séquences rep-cap intégrées (Nony et al. , J. Virol. , 2001)
The development and use of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors have increased over the past ten years. The in vivo success of these vectors results in part from the unique properties of the wild type virus. However, the classical procedures for rAAV production are laborious, time-consuming, and rather inefficient. For these reasons, it remains difficult to obtain high-titer rAAV stocks, required for use in large animai models or in humans. To solve these problems, new strategies have been developed by several groups, especially the establishment of stable cell lines harboring the rep and cap sequences, coding for regulatory and structural proteins, respectively. . . . . During this study, we precisely characterized this phenomenon and defined the trans key actors involved (Tessier et al. , J. Virol. , 2001). Furthermore, we isolated a new replication element in the AAV type 2 rep-cap genome which is likely involved in cis in the amplification of the integrated rep-cap sequences (Nony et al. , J. Virol. , 2001)

Le transfert de gène in vivo dans la rétine est réalisé le plus souvent par l'administration d'un vecteur viral recombinant. Les virus adéno-associés recombinant (AAVr) constituent des vecteurs de choix, car ils permettent une expression forte et stable du transgène dans la rétine, tout en étant faiblement immunogène et sans induire d'effets cytopathique ou cancérigène. L'efficacité du transfert de gène dans la rétine, comme dans d'autres organes, dépend essentiellement (1) de la capacité du protocole d'administration du vecteur AAVr à distribuer celui-ci dans toute la rétine, pour le mettre en contact avec toutes les cellules à traiter, (2) de la capacité du vecteur AAVr à entrer dans la cellule et à transporter le transgène dans le noyau, et (3) de la capacité du transgène à être exprimé de façon forte et stable par les cellules transduites. Au cours de cette thèse, nous avons essayé d'optimiser le transfert de gène dans là rétine en travaillant sur ces deux premiers points, et nous avons étudié la stabilité de l'expression du transgène dans la rétine. D'une part, nous avons montré que l'administration intraveineuse du vecteur double brin AAVr (scAAV) de sérotype 9 (scAAV2j9) permet la transduction des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans une très grande partie de la rétine et dans les deux yeux simultanément, lorsque celui-ci est injecté chez le rat et le chien nouveau-né, mais pars lorsque celui-ci est injecté chez l'animal adulte. En outre, nous avons montré que l'administration intraveineuse du vecteur scAAV2j9 chez le nouveau-né permet la mise en place d’une tolérisation immunologique vis-à-vis du transgène, lorsque ce vecteur est injecté chez l'animal nouveau-né, mais pas lorsqu'il est injecté chez l'animal adulte. D'autre part, nous évalué l'impact de l'exposition prolongée à la lumière environnementale sur la stabilité de l'expression de différents vecteurs simple brin AAV4 et AAVS dans la rétine, chez le rat adulte, par rapport à des conditions de lumière environnementale cyclique et de pénombre classiquement trouvées en animalerie. Nous avons montré que l'exposition prolongée à la lumière induit la perte de l'expression des trangènes évalués dans les photorécepteurs, lorsque les transgènes sont sous le contrôle du promoteur CMV. À l'inverse, nous avons montré que l'exposition prolongée à la lumière n'a pas d'effet sur l'expression dans les photorécepteurs de ces transgènes, lorsque ceux-ci sont dirigés soit le promoteur rhodopsine ou le promoteur rhodopsine kinase. Nous avons aussi montré que l'effet inhibiteur de la lumière sur l’expression des transgènes sous le contrôle du promoteur CMV, passe par l'activation de la cascade de phototransduction dans les photorécepteurs. À l'inverse, nous avons montré que l'expression de transgènes dirigée par le promoteur CMV dans les cellules de l'EPR n'est pas affectée par les conditions de lumière.