Dissertations / Theses: 'Vecteurs de clonage'

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Pheulpin, Patrice. "Construction de vecteurs navettes Escherichia coli - Bacteroides." Lille 1, 1989. http://www.theses.fr/1989LIL10067.

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Abstract:

Un vecteur navette s'exprimant chez e. Coli et bacteroides a été construit par l'association d'un plasmide cryptique de 4,6 kb, d'un plasmide dérivé de pBR 322 et d'un fragment de 4,2 hb du plasmide pBFTM10. Ce plasmide confère la résistance à différents antibiotiques suivant la bactérie où il est inséré. Les régions nécessaires à la réplication chez bacteroides ont été identifiées - un deuxième vecteur navette a été construit, et s'exprime chez e. Coli, b. Distasonis et b. Ruminicola. Ces plasmides peuvent être utiliser pour clouer des gènes de bacteroides chez e. Coli, puis pour étudier leur expression dans des souches de bacteroides hétérologues.

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Gil, Dominique. "Elaboration et caractérisation d'un nouveau type de vecteurs de clonage à nombre de copies régulable." Toulouse 3, 1990. http://www.theses.fr/1990TOU30189.

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Abstract:

L'integration de plasmides en des points predetermines du chromosome d'escherichia coli, et les possibilites ainsi offertes: cartographie, etude de l'activite des genes ou des effets du contexte nucleoidique, clonage ou echange d'alleles, prise en charge de la replication par le plasmide integre, sont realisables a l'aide d'outils distincts aux possibilites limitees. L'objet de cette etude a ete la mise au point d'un plasmide vecteur a replication regulee par l'operateur de maniere thermo-independante. Le replicon de depart a ete cole1, tandis que le systeme lac a servi a l'asservissement du nombre de copies. Le chapitre 1 decrit la derivation d'un vecteur, pam9, a partir d'un plasmide a replication dependante du promoteur lacuv5. Pam9 peut s'integrer par homologie et prendre en charge la replication du chromosome. Toutefois, pla51 et ses derives apparaissent n'exister qu'a l'etat trimerique, ce qui en limite l'utilite. Le chapitre 3 decrit la construction de nouveaux vecteurs a nombre de copies modulables, pam34 et pam35, portant la region regulatrice de l'operon lac substitue au promoteur de l'arn ii amorce, et conservant les elements regulateurs rnai-rnaii et rom. Le chapitre 4 porte sur la replication de ces plasmides. Celle de pam34, porteur de lacl, est strictement dependante de la presence d'inducteur. Ceci permet la selection de l'integration du plasmide au chromosome, la prise en charge de sa replication, et le clonage par recurrence de region proches. J'ai montre aussi que pam34 est un agent efficace pour la chasse de vecteurs de meme incompatibilite. Les proprietes de pam34 permettent son emploi pour diverses manipulations genetiques et pour les etudes de la replication du chromosome et du cycle cellulaire. Ces perspectives sont abordees dans la discussion finale

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Jegot, Gwenhael. "Mise au point d'un système dérivé du transposon Mos1 comme vecteur non viral de transfert de gène en cellules eucaryotes." Tours, 2007. http://www.theses.fr/2007TOUR4014.

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Abstract:

Le transposon Mariner Mos 1 a la capacité intrinsèque de changer de position dans le génome. Le premier axe de mes travaux de thèse est consacré aux caractéristiques du transposon influençant l'activité de transposition de l'élément Mos1 (dont la composition nucléique du transposon et sa taille). Il a permis de montrer qu'un de transgène de taille supérieure à 2,5kb limite l'efficacité de transposition, qu'un fort pourcentage en GC favorise la transposition, et qu'il n'existe pas de taille minimale pour la transposition de Mos1. Le deuxième axe de recherche porte sur l'adaptation et l'amélioration du système Mos1 au contexte des cellules eucaryotes, pour développer un vecteur intégratif non viral de transfert de gène. L'ajout d'une séquence de localisation nucléaire améliore le transfert du noyau, l'humanisation de la séquence de la transposase augmente son expression en cellules de mammifères, et l'utilisation d'un système suicide HSVVtK permet de limiter les évènements de recombinaison
The mariner Mos 1 transposon can naturally move into the genome. The first research axis of this work concern the transposon characteristics which act upon the transposition activity of Mos1 (like the nucleic content of the transposon and its size). It have shown that a size of transgene upper than 2,5 kb limit the transposition efficiency, that a strong GC percentage favour the transposition, and that there is no minimal size for Mos1 transposition. The second research axis concern the adaptation and improvement of the Mos1 system to the eukaryotic cells, to developp a nonviral vector for gene transfer. The addition of a nuclear localization sequence improve the nuclear transfer, the "humanization" of the transposase sequence increase it expression in mammal cells, and the use of the HSVtK suicide system permit to limit the recombination events

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Granio, Ophélia. "Développement de vecteurs adénoviraux pour la mucoviscidose : applications et perspectives en thérapie génique." Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10194.

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Abstract:

Les adénovirus (Ad) sont des agents de transfert de gène efficaces. Ils sont des vecteurs de choix pour l’étude de la mucoviscidose (MV). La MV est une maladie génétique, due à des mutations dans le gène CFTR, qui se caractérise par une atteinte respiratoire sévère. Nous avons étudié l’expression de la protéine CFTR fusionnée à la GFP apportée par un vecteur adénoviral dans des lignées cellulaires trachéales glandulaires et des cultures primaires pulmonaires. Notre construction GFP-CFTR s’est montrée parfaitement fonctionnelle et le signal GFP permet le suivi du produit du transgène dans la cellule. A haute dose virale, un effet négatif sur l’activité CFTR a été observé et associé à la voie d’entrée du virus dépendante de la base de penton. Un nouveau vecteur chimérique portant une fibre de sérotype 35 dépourvu de toxicité et exprimant la construction GFP-CFTR a été construit pour une application thérapeutique. Outre la MV, les vecteurs Ad ont été ciblés sur des lignées de cellules tumorales. Par insertion de molécules appelées Affibody™ fixant le domaine Fc des anticorps dans la fibre, les vecteurs ont pu être reciblés vers des marqueurs cellulaires de cancer du sein et ovarien
Adenoviruses (Ad) are efficient gene transfer vectors. In this study, Ad vectors were developed for cystic fibrosis (CF), a genetic disease characterized by pulmonary complications due to mutations in the CFTR gene. The aim of this work was to construct an Ad5/GFP-CFTR vector which would allow the tracking of both the cellular localization and chloride channel function of the CFTR protein in Ad-transduced cells. The gene delivery of GFP-CFTR by Ad to CFTR-deficient human airway epithelial and tracheal cells showed correction of chloride channel CFTR activity and apical localization of GFP-CFTR. However, the Ad5 vector showed inhibition of CFTR activity at high vector doses which was associated to the penton base-integrin entry pathway. A chimeric Ad5/Fi35 vector was developed which had no toxic effect on the CFTR activity and efficiently transduced lung cells. This work also concerned the re-targeting of Ad vectors to different cell types of interest. Novel Ad vectors with fibers carrying AffibodyTM molecules which bind the Fc domain of antibodies were developed to allow re-targeting of Ad to specific cell receptors using antibodies

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Faraut, Pascal. "Analyse d'événements de recombinaisons induits par la création d'une structure secondaire sur un ARN rétroviral et applications pour l'élaboration de vecteurs rétroviraux." Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO10200.

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Abstract:

Les vecteurs retroviraux offrent des possibilites d'utilisation en recherches fondamentale et appliquee. Dans le cadre d'un transfert de genes in vivo, les stocks vecteurs viraux doivent presenter un titre eleve en particules et ne pas contenir de forme virale parasite. De plus ces vecteurs une fois integres ne doivent pas pouvoir ressortir de la cellule dans laquelle ils ont ete introduits. Il faut donc pouvoir perdre au cours de la replication du genome retroviral un element necessaire a la production du stock viral mais inutile par la suite dans la cellule cible. Il est rapporte que de petites structures secondaires peuvent etre deletees lors de la transcription inverse. Nous avons utilise cette propriete afin de deleter la sequence d'encaspidation suite a son introduction entre une sequence sens-antisens pouvant former une structure secondaire. Il a fallu etudier les effets d'une sequence antisens dans un vecteur retroviral depuis les cellules productrices en passant par l'encapsidation, et jusqu'au provirus integre. Cela a permis de mettre en evidence qu'une large sequence antisens (692nt) entrainait une instabilite des arnm vecteurs dans les cellules productrices suite a l'action de desaminases cellulaires sur les structures secondaires. Les arnm vecteurs modifies par cette activite et encapsides, donnent naissance a des provirus comportant dans 100% des cas la deletion de la totalite, ou presque, des sequences pouvant former une structure secondaire sur l'arn viral ; toutefois, les residus de sequences sens-antisens entrant dans la structure secondaire presentent une modification nucleotidique caracterisee par la transition ag. Pour rendre moins instables les arnm vecteurs, la sequence antisens situee en 3' de la sequence d'encapsidation a ete reduite a 48nt dans le vecteur pfas22. La production de ce vecteur en condition helper free a permis de mettre en evidence une stabilite des arnm vecteurs et un taux de deletion des sequences sens-antisens encadrant la sequence d'encapsidation de 61%. Ces resultats permettent d'obtenir des donnees fondamentales sur la presence et le devenir de structures secondaires pouvant se former sur un arnm viral et des donnees pouvant etre mises a profit dans le but d'optimiser les vecteurs retroviraux pour des applications de therapie genique.

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Torne-Celer, Caroline. "Développement d'un nouveau type de vecteur rétroviral autodéletant pour l'étude de l'intégration rétrovirale et le transfert de gènes." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10114.

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Abstract:

Un systeme de transfert de genes est constitue de 2 composantes : un vecteur et une lignee transcomplementante qui permet sa production sous forme de particules retrovirales. Ce travail a eu pour principal objectif d'ameliorer la composante vecteur d'un systeme retroviral. Le vecteur etudie possede une sequence d'integration surnumeraire (sequence att) en position interne, entre 2 genes de selection (neo sous controle de la ltr et puro sous controle d'un promoteur interne). L'analyse de clones d'infection a mis en evidence un mecanisme d'integration atypique pour 31% des provirus (clivage imprecis des extremites virales, duplications de taille incorrecte et frequentes deletions d'adn genomique au cours de l'integration), qui pourrait resulter du clivage de la sequence att interne par l'integrase, bien que l'existence d'un precurseur att-ltr issu de la transcription inverse ne puisse etre exclue (1). D'autres provirus integres selon le mecanisme classique, par le biais des ltr, presentent des duplications de taille incorrecte qui pourraient s'expliquer par un mauvais positionnement de l'in du a des homologies de sequences entre adn viral et adn cellulaire (2). Le vecteur att presente des proprietes autodeletantes qui permettent de reduire le risque de mobilisation du vecteur en cas de surinfection. L'efficacite de ce processus d'autodeletion peut etre amelioree en augmentant la pression de selection sur le gene puro (75% des provirus sont bornes par la sequence att interne et la ltr3' et plus de 92% sont non mobilisables). La production du vecteur est augmentee d'un facteur 10 par la deletion du signal de polyadenylation du gene puro ou bien le retournement de la cassette de selection puro. L'efficacite de transduction du gene puro est amelioree par l'augmentation de la taille de la sequence att interne (3). Enfin, nous avons montre que le vecteur att conserve ses proprietes autodeletantes sur cellules humaines (4). Ces resultats presentent un nouveau type de vecteur autodeletant qui pourrait etre utilise pour des applications de transfert de genes ou de therapie genique.

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Mselli-Lakhal, Laïla. "Construction de vecteurs lentiviraux défectifs pour la réplication : étude du transport des ARN et des séquences impliquées dans l'encapsidation du génome du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV)." Lyon 1, 1997. http://www.theses.fr/1997LYO1T058.

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BIGEY, FREDERIC. "Clonage et analyse des genes de rhodococcus sp. Acv2 codant pour la degradation de l'adiponitrile. Localisation chromosomique. Construction de vecteurs de clonage." Montpellier, ENSA, 1995. http://www.theses.fr/1995ENSA0010.

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Abstract:

La souche mutante, rhodococcus sp. Acv2 est capable d'hydrolyser l'adiponitrile en adipate d'ammonium plus efficacement que la souche sauvage rhodococcus sp. R312. Sa nitrile hydratase est capable d'hydrater plus rapidement les mononitriles issus de l'adiponitrile. Il convenait de determiner la structure primaire de l'enzyme. Une banque cosmidique a ete construite chez escherichia coli. Le criblage par hybridation sur colonies a l'aide d'une sonde specifique a permis d'isoler un cosmide contenant le gene de la nitrile hydratase. Le sequencage d'un fragment de 1,7 kb a permis d'identifier les genes ntha et nthb codant pour les deux sous-unites de l'enzyme et de reperer une mutation affectant le gene nthb. Cette mutation se traduit, au niveau du 40#i#e#m#e acide amine de la sous-unite beta, par le remplacement d'une methionine par une valine chez la souche mutante acv2. Une sequence conservee, susceptible d'etre le site de fixation de l'atome de fer des nitrile hydratases, a ete reperee au niveau de la sous-unite alpha. Les plasmides pbl33 et prc1 de brevibacterium linens atcc 9174 et rhodococcus rhodochrous atcc 4276 ont ete employes pour construire des vecteurs navettes entre rhodococcus sp. Et e. Coli. Les plasmides construits, psp33 (replicon de pbl33) et pspc1 (replicon de prc1), porteurs du gene de resistance aphl provenant du transposon tn903, conferent la resistance a la neomycine a rhodococcus sp. R312. Ces plasmides devraient permettre le transfert des genes clones chez rhodococcus sp. Une etude du genome de rhodococcus sp. R312 par electrophorese en champ pulse a ete realisee. La taille du chromosome est estimee a 6,44 mb. Les genes ntha et nthb ainsi que le gene amie codant pour l'amidase generale ont ete localises sur des fragments de restriction. Ces travaux constituent une etape preliminaire a l'elaboration d'une carte physique du chromosome de rhodococcus sp. R312

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Tessier, Jacques. "Étude des facteurs impliqués en cis et en trans dans l'assemblage et la réplication des vecteurs recombinants dérivés de l'adéno-associated virus de type 2 (AAVr)." Nantes, 2002. http://www.theses.fr/2002NANT05VS.

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Abstract:

Le développement et l'utilisation des vecteurs recombinants dérivés de l'Adeno-Associated Virus (AAVr) pour le transfert de gènes in vivo n'ont cessé de croître au cours des dix dernières années. . . . . . Ces lignées d'encapsidation, dérivées des cellules HeLa, produisent des particules d'AAVr de façon efficace après infection par un adénovirus sauvage. Cela s'accompagne d'une synthèse importante de protéines Rep et Cap qui sont produites suite à l'amplification des séquences rep-cap intégrées (Chadeuf et ai. , J. Gene Med. , 2000). Au cours de ce travail de thèse, nous avons précisément caractérisé ce phénomène et défini les acteurs essentiels impliqués en trans (Tessier et ai. , J. Virol. , 2001). De plus, nous avons isolé, dans le génome rep-cap de l'AAV de type 2, un nouvel élément de réplication impliqué en cis dans l'arnplîfication des séquences rep-cap intégrées (Nony et al. , J. Virol. , 2001)
The development and use of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors have increased over the past ten years. The in vivo success of these vectors results in part from the unique properties of the wild type virus. However, the classical procedures for rAAV production are laborious, time-consuming, and rather inefficient. For these reasons, it remains difficult to obtain high-titer rAAV stocks, required for use in large animai models or in humans. To solve these problems, new strategies have been developed by several groups, especially the establishment of stable cell lines harboring the rep and cap sequences, coding for regulatory and structural proteins, respectively. . . . . During this study, we precisely characterized this phenomenon and defined the trans key actors involved (Tessier et al. , J. Virol. , 2001). Furthermore, we isolated a new replication element in the AAV type 2 rep-cap genome which is likely involved in cis in the amplification of the integrated rep-cap sequences (Nony et al. , J. Virol. , 2001)

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Belbellaa, Brahim. "Optimisation du transfert de gène dans la rétine par vecteur adéno-associé." Nantes, 2011. http://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show.action?id=dc719942-5365-4fd2-9ef0-9211fcc46829.

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Abstract:

Le transfert de gène in vivo dans la rétine est réalisé le plus souvent par l'administration d'un vecteur viral recombinant. Les virus adéno-associés recombinant (AAVr) constituent des vecteurs de choix, car ils permettent une expression forte et stable du transgène dans la rétine, tout en étant faiblement immunogène et sans induire d'effets cytopathique ou cancérigène. L'efficacité du transfert de gène dans la rétine, comme dans d'autres organes, dépend essentiellement (1) de la capacité du protocole d'administration du vecteur AAVr à distribuer celui-ci dans toute la rétine, pour le mettre en contact avec toutes les cellules à traiter, (2) de la capacité du vecteur AAVr à entrer dans la cellule et à transporter le transgène dans le noyau, et (3) de la capacité du transgène à être exprimé de façon forte et stable par les cellules transduites. Au cours de cette thèse, nous avons essayé d'optimiser le transfert de gène dans là rétine en travaillant sur ces deux premiers points, et nous avons étudié la stabilité de l'expression du transgène dans la rétine. D'une part, nous avons montré que l'administration intraveineuse du vecteur double brin AAVr (scAAV) de sérotype 9 (scAAV2j9) permet la transduction des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans une très grande partie de la rétine et dans les deux yeux simultanément, lorsque celui-ci est injecté chez le rat et le chien nouveau-né, mais pars lorsque celui-ci est injecté chez l'animal adulte. En outre, nous avons montré que l'administration intraveineuse du vecteur scAAV2j9 chez le nouveau-né permet la mise en place d’une tolérisation immunologique vis-à-vis du transgène, lorsque ce vecteur est injecté chez l'animal nouveau-né, mais pas lorsqu'il est injecté chez l'animal adulte. D'autre part, nous évalué l'impact de l'exposition prolongée à la lumière environnementale sur la stabilité de l'expression de différents vecteurs simple brin AAV4 et AAVS dans la rétine, chez le rat adulte, par rapport à des conditions de lumière environnementale cyclique et de pénombre classiquement trouvées en animalerie. Nous avons montré que l'exposition prolongée à la lumière induit la perte de l'expression des trangènes évalués dans les photorécepteurs, lorsque les transgènes sont sous le contrôle du promoteur CMV. À l'inverse, nous avons montré que l'exposition prolongée à la lumière n'a pas d'effet sur l'expression dans les photorécepteurs de ces transgènes, lorsque ceux-ci sont dirigés soit le promoteur rhodopsine ou le promoteur rhodopsine kinase. Nous avons aussi montré que l'effet inhibiteur de la lumière sur l’expression des transgènes sous le contrôle du promoteur CMV, passe par l'activation de la cascade de phototransduction dans les photorécepteurs. À l'inverse, nous avons montré que l'expression de transgènes dirigée par le promoteur CMV dans les cellules de l'EPR n'est pas affectée par les conditions de lumière.

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Rozoy, Brigitte. "Optimisation du transfert de gène dans les lymphocytes T à l'aide de rétrovirus recombinants non réplicatifs." Paris 5, 1997. http://www.theses.fr/1997PA05P071.

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Jaoua, Samir. "Étude du mode d'intégration des plasmides IncP-1 dans le chromosome de Myxococcus xanthus : optimisation de ces plasmides pour le transfert de gènes étrangers chez cette bactérie." Compiègne, 1986. http://www.theses.fr/1986COMPI232.

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Abstract:

Le plasmide RP4 et ses dérivés du même groupe d'incompatibilité (IncP-1) sont transférables par conjugaison chez Myxococcus xanthus, où ils se maintiennent intégrés dans le chromosome. Le mode d'intégration de ces plasmides s'avère tout à fait différent de ce que l'on trouve chez d'autres bactéries à gram négatif. Ces plasmides intégrés peuvent subir des remaniements dans des proportions variables selon les cas et sont susceptibles d'être stabilisés. De nouveaux vecteurs sont préparés. Ces vecteurs ont une très grande efficacité de transfert chez plusieurs souches de Myxococcus xanthus. L'insertion dans un de ces vecteurs in vitro du gène appA codant pour la synthèse de la phosphatase hyperacide d'E. Coli, montre que ce gène est exprimé chez Myxococcus xanthus
IncP-1 plasmids (RP4 and its derivatives) are self-transmissible to Myxococcus xanthus, and maintained integrated into the host chromosome. The mode of integration is different from the one described for other gram negative bacteria. These plasmids are liable to structural instability, but it is possible to isolate stabilized insertions. New vectors are prepared. They have a high efficiency of transfer into many strains of Myxococcus Xanthus. The gene appA is cloned in vitro in one of these new vectors. Its codes for the synthesis og hyperacid phosphatise of E. Coli. This gene is expressed by Myxococcus Xanthus

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Marcadé, Véronique. "Construction et caractérisation d'adénovirus multi-défectifs." Châtenay-Malabry, Ecole centrale de Paris, 2000. http://www.theses.fr/2000ECAP0871.

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Abstract:

Les adénovirus constituent une classe de vecteurs particulièrement adaptés au développement de thérapies géniques chez l'Homme. Les vecteurs adénoviraux actuellement utilisés dans des protocoles cliniques sont rendus défectifs suite à une délétion létale des gènes E1A et E1B du génome des sérotypes humains 2 (Ad2) et 5 (Ad5). Cependant, cette délétion n'est pas suffisante pour éteindre totalement l'expression des protéines virales. La cytotoxicité et l'immunogénicité des vecteurs adénoviraux qui résultent de cette expression virale résiduelle limitent leur utilisation. Pour surmonter ce problème, plusieurs équipes ont construit des vecteurs adénoviraux présentant des délétions supplémentaires, allant parfois jusqu'à déléter tous les gènes viraux. Certains de ces virus largement délétés présentent une grande instabilité du génome viral et/ou de l'expression du transgène, alors que d'autres, délétés de tous les gènes viraux, sont très stables. Dans cette étude, nous avons cherché à comprendre les mécanismes de stabilisation du génome adénoviral, dans le but d'améliorer les vecteurs pour la Thérapie Génique. Nous avons d'abord cherché à comprendre l'implication de certains gènes viraux dans la stabilité du génome adénoviral, en délétant différentes régions du chromosome viral par l'utilisation du système de recombinaison Cre-loxP. Pour cela, nous avons construit et caractérisé une lignée dérivée de 293 et présentant une activité recombinase Cre inductible. Nous avons ainsi obtenu un vecteur délété d'une région de 25 kpb comprenant E1, E2, E3 et les régions L1 à L4. L'étude de ce " mini- virus " a montré qu'il était très instable, son génome étant dégradé en quelques heures dans les cellules. La stabilité du génome adénoviral nécessite probablement une localisation nucléaire particulière, médiée par des protéines virales. Nous avons donc étudié la possibilité de restaurer la stabilité de notre " mini-virus " en y intégrant notamment des séquences d'association à la matrice nucléaire (matrix attachment region, ou MAR). Les résultats ont montré une stabilisation partielle du vecteur.

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Jain, Namrata. "Non-viral gene delivery vectors based on new unsymmetrical bolaamphiphiles." Strasbourg, 2010. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2010/JAIN_Namrata_2010.pdf.

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Abstract:

Le succès de la thérapie génique repose sur la découverte de nouveaux et efficaces vecteurs de gènes. Les vecteurs non-viraux présentent un intérêt certain, car ils peuvent délivrer du matériel génétique en grande quantité et sont faiblement immunogéniques. Dans ce contexte, des molécules bolaamphiphiles dissymétriques (bolas) portant deux têtes polaires hydrophiles différentes reliées par un espaceur hydrophobe peuvent s’avérer être une alternative intéressante, car ils peuvent former des nano-structures supramoléculaires bien définies (nano-vésicules ou nanotubes) et plus stables que celles formées par des lipides. Le but du présent travail fût donc de développer de nouveaux vecteurs de transfection basés sur des bolas à même de former de telles nano-structures pouvant héberger une molécule d’ADN et exposer à leur surface externe des ligands neutres. Dans ce but, plusieurs types de bolas, portant des groupements cationiques et neutres reliés par un espaceur hydrophobe, ont été obtenus par synthèse organique multi-étapes. Leur caractérisation par différentes techniques démontre que la nature aussi bien des têtes polaires que de l’espaceur hydrophobe conditionne l’auto-assemblage des bolas, leur interaction avec l’ADN et la morphologie des complexes obtenus (bolaplexes). Les deux premières générations de bolas n’ont pas présentés les caractéristiques essentielles de bons vecteurs non-viraux. La troisième génération, au contraire, est apparue très prometteuse. Celle-ci montre une forte interaction avec l’ADN, la formation de bolaplexes de petites tailles et une bonne efficacité de transfection pour plusieurs lignées cellulaires. L’augmentation de l’efficacité de transfection en présence de DOPE ou de chloroquine suggère que l’étape essentielle pouvant limiter leur internalisation pourrait être leur fusion avec la membrane ou leur sortie des endosomes. Certaines formulations de bolaplexes présentent une efficacité comparable aux meilleurs agents de transfection commerciaux. Le présent travail introduit donc une nouvelle classe d’agents de transfection efficaces sur la base de bolaamphiphiles dissymétriques
The success in gene therapy relies strongly on new efficient gene delivery vectors. Non-viral vectors are highly attractive, since they can deliver large quantities of genetic information and are low immunogenic. In this respect, unsymmetrical bolaamphiphiles (bolas) bearing two different hydrophilic head-groups connected by a hydrophobic spacer could be an attractive alternative for vector design, as they can form well-defined supramolecular nanostructures (nanovesicles and nanotubes) that are more stable than those formed with lipids. The aim of the present work was to develop new gene delivery vectors based on bolas capable to form such nanostructures hosting a DNA molecule and exposing at their external surface neutral ligands. For this purpose, a variety of bolas, bearing cationic and neutral groups connected by a hydrophobic spacer, were obtained by multi-step organic synthesis. Their characterization by different instrumental techniques suggested that the nature of the head groups as well as the hydrophobic spacer defines the bola self-assembly, their interaction with DNA and the morphology of their complexes (bolaplexes). While the first two generations of bolas lack the essential features of nonviral vectors, the final third generation was found highly promising. The latter showed a strong interaction with DNA, the formation of small bolaplexes and good transfection efficiency in different cell lines. The increase in transfection efficiency in presence of DOPE or chloroquine suggested that the key barrier for their internalization could be the lipid fusion and the endosomal escape. Some bolaplex formulations showed a transfection efficiency comparable to the best commercial transfection agents. Thus, the present work introduces a new class of efficient transfection agents based on unsymmetrical bolaamphiphiles

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Genin, Sarah. "Développement de vecteurs herpétiques pour la thérapie génique et l'oncolyse virale des tumeurs cérébrales." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10120.

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Ronfort, Corinne. "Etude des structures rétrovirales endogènes dans des cellules de poules et d'un exemple d'interaction avec des vecteurs rétroviraux dérivés des ASLV (Avian Sarcoma Leukemia Viruses)." Lyon 1, 1992. http://www.theses.fr/1992LYO10214.

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Abstract:

Les structures retrovirales endogenes (ou ev) sont des sequences retrovirales integrees dans les genomes cellulaires et qui se transmettent a la descendance des sujets comme des genes cellulaires. Le travail de these a consiste, en premier lieu, a etudier les loci ev qui sont presents au sein d'une souche de poules leghorn doree. Par cartographie de restriction, 4 loci endogenes ont ete identifies, 2 d'entre eux representent des formes non encore decrites. Tous sont deletes pour une partie plus ou moins importante de leur genome et aucun n'est capable de produire des particules virales infectieuses. Certaines regions (genes env, ltr) ont ete sequencees. Les resultats montrent une homogeneite importante entre les divers ev indiquant que l'infection et la stabilisation de retrovirus dans les lignees germinales de poulet est limitee a une categorie de retrovirus le sous-groupe e. Une seconde partie du travail a consiste a determiner les formes virales nouvelles generees suite a des interactions entre des genomes endogenes et des vecteurs retroviraux (vr). Les vr sont utilises dans le cadre d'experiences de transfert de genes; il s'agit de formes virales modifiees de sorte a ce qu'elles transportent, dans le genome d'une cellule cible, le gene que l'on souhaite y apporter. Les particules virales vecteurs sont obtenues sur des lignees transcomplementantes aptes a les produire, en absence de formes virales replicatives. A partir de cellules transcomplementantes pourvues de loci ev, il a ete observe l'emergence de formes virales non souhaitees, formes non detectees dans des cellules depourvues de loci ev. Ces formes sont representees: a) par des particules renfermant des genomes endogenes capables de s'integrer dans l'adn d'une cellule cible et de s'y exprimer, b) par des formes virales competentes pour la replication generees par recombinaison entre genomes ev et vecteurs

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Dechaux, Elsa. "Vectorologie non virale de l'ADN : ciblage par des oligosides." Paris 5, 2001. http://www.theses.fr/2001PA05P607.

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Abstract:

L'interaction initiale entre la E-sélectine exprimée sur l'endothélium lors des processus inflammatoires et métastatiques, et son ligand tétrasaccharidique l'acide Lewis X sialylé (sLeX) de structure NeuAcα(2,3)Galβ(1,4)(Fucα(1,3)GlcNAc présent à la surface des cellules tumorales, peut être utilisée dans des stratégies de vectorisation. Dans l'optique d'un blocage de cette interaction et d'une délivrance de matériel génétique au sein des cellules tumorales, notre but est d'encapsuler un ADN thérapeutique dans des liposomes cationiques assurant la neutralisation des phosphates de l'ADN et portant des analogues du sLeX greffés à leur surface. La synthèse de quatre analogues a été envisagée, deux d'entre eux contenant un motif pyrrolidine commun, et les deux autres un motif pipéridine également commun. Ces hétérocycles trans-dihydroxylés remplacent la glucosamine du sLeX, et ont pour rôle d'assurer une répartition spatiale des motifs nécessaires à la reconnaissance par la E-sélectine. .
Inflammatory and metastatic processes take place through the initial interction between endothelial E-selectin and its tetrasaccharidic ligand Lewis X (sLeX), present on the outlayer of tumour cells. The complex structure of sLeX, NeuAcα(2,3)Galβ(1,4)(Fucα(1,3)GlcNAc, has led to the development of many mimetics. We envisioned that cationic liposomes grafted with SLeX mimetics could potentialy block the interaction between cancer cells and endothelium, and simultaneously permit tergeted and specific delivery of drugs to tumoral tissus. .

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Decourt, Catherine. "Les maladies par dépôts d'immunoglobulines monoclonales : contribution à l'étude de leurs mécanismes moléculaires et analyse mutationnelle dans un modèle expérimental." Limoges, 1998. http://www.theses.fr/1998LIMO0027.

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Abstract:

Nous nous sommes interesses a trois maladies humaines caracterisees par la formation de depots tissulaires ou d'inclusions intracellulaires de chaines d'immunoglobulines (ig) monoclonales : la maladie de depots de chaines legeres monoclonales (lcdd), l'amylose-al et le syndrome de fanconi. La premiere etape nous a conduit a caracteriser (par sequencage d'adn complementaire) les chaines legeres monoclonales impliquees dans trois nouveaux cas de lcdd. Dans un deuxieme temps, nous avons realise un modele animal de syndrome de fanconi. Pour l'optimisation de ce modele, nous avons d'abord cherche a ameliorer l'efficacite de nos vecteurs d'expression. Nous avons ensuite clone les adn complementaires correspondant a la chaine humaine de syndrome de fanconi et a deux de ses variants obtenus par mutagenese dirigee (permettant chacun de modifier un residu suspect de contribuer a une conformation pathogene de la chaine) dans ces vecteurs d'expression. Apres transfection dans une lignee cellulaire murine, nous avons selectionne les clones produisant le plus de chaines legeres et nous les avons injectes a des souris pour induire des tumeurs. Nous avons ainsi pu detecter la formation de cristaux intracellulaires (morphologiquement identiques a ceux du patient) chez les animaux ; en revanche, chacune des deux mutations a supprime la formation de cristaux par les chaines variantes et a permis d'affirmer l'importance des residus cibles dans le mecanisme de la cristallisation. Enfin, nous avons egalement travaille a l'etablissement de modeles de souris transgeniques qui developperaient spontanement soit une amylose-al soit un syndrome de fanconi et pourraient servir de base a des etudes physiopathologiques et/ou pharmacologiques appliquees a chacune de ces deux pathologies.

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Boutin, Fontaine Marjorie. "Vers la modification et l’assemblage de novo du génome baculoviral en vue de la production de vecteurs AAV." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLE013.

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Abstract:

Le système baculovirus / cellules d’insectes est un outil performant pour la production de vecteurs AAV recombinant pour la thérapie génique. Cette production nécessite que, les gènes rep et cap de l’AAV ainsi que le transgène encadré par les ITR, soient codés dans le génome du baculovirus AcMNPV. L’utilisation de cassettes de recombinaison pour intégrer ces gènes provoque à grande échelle une certaine instabilité au sein des 134Kb du génome. Pour pallier à ce phénomène, une nouvelle stratégie d’intégration de gènes a été mise en place. Celle-ci doit permettre notamment d’éviter la présence de cicatrices de recombinaison et de modifier le génome du bacmid d’AcMNPV. Basée sur la technique de Gibson Assembly, nous avons tenté d’assembler de novo le génome du baculovirus d’AcMNPV à partir de fragments PCR chevauchants. Nous avons réussi à pré assembler en 4 parties la totalité du génome. Celles-ci ont permis d’insérer le gène de la GFP comme gène d’intérêt mais également d’éliminer le gène de résistance antibiotique et le Mini-F réplicon, facteur d’instabilité en cellules d’insecte. Plusieurs clones obtenus ne contiennent aucune mutation. Cette technique pourrait être appliquée à la production de vecteurs AAVr
The baculovirus / insect cell system allows AAV vector production for gene therapy purposes. Current baculoviruses used for the production of rAAV vectors are a bottleneck for Scaling up production. Indeed the use of recombination boxes to insert the genes brings instability to the134kb genome. To avoid this, a new gene integration strategy has been implemented. In this work, we have assayed the full assembly of AcMNPV´s genome using the Gibson Assembly technic. PCR fragments covering the totality of genome and able to assemble through overlapping terminal regions have been pre-assembled in 4 segments. The finally assembly should contain the eGFP gene used has gene of interest along with replacement of the Mini-F replicon by polyhedrin gene. This feasibility study has shown that we could obtain segments without any mutation. Final assembly is still on-going. This technology should be applied next for the generation of baculovirus used for the production of rAAV vectors. This marker less combination method should solve problems of genome instability

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Fournel-Garcia, Sandrine. "Mise au point et analyse de vecteurs herpétiques de type amplicon destinés au transfert de gène dans les cellules eucaryotes." Lyon 1, 1996. http://www.theses.fr/1996LYO10085.

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Abstract:

Nous avons construit un plasmide, pa-sf1, permettant de generer des vecteurs de genes amplicons, derives du virus de l'herpes hsv-1. Ce plasmide contient le transgene s:h-lacz (phleor et activite b-galactosidase), l'origine de replication oris du virus hsv-1 ainsi que sa sequence a de clivage et d'encapsidation. La surinfection par un virus hsv-1 auxiliaire de cellules transfectees prealablement par ce plasmide permet d'obtenir des amplicons infectieux, vecteurs du transgene. Leur genome est constitue par un concatemere d'unites plasmidiques pa-sf1 repetees et encapsidees dans un virion fourni par l'auxiliaire. Les vecteurs amplicons produits permettent l'expression du transgene dans des cellules post-mitotiques (neurones, myotubes) ou proliferatives (vero, cos7, myoblastes). L'impossibilite de separer physiquement les amplicons des virus auxiliaires aboutit a la production de populations heterogenes de vecteurs. Par une dilution adequate de cette population infectieuse, une cellule cible peut ne recevoir qu'un vecteur amplicon. Dans ce cas le vecteur apporte un nombre reduit de facteurs pathogenes et la cellule cible reste capable de continuer a proliferer (cos7) a se differencier (myoblaste) tout en presentant l'activite transgenique b-galactosidase. L'expression du transgene s'effectue cependant a condition qu'il soit place sous controle d'un promoteur non regule par des facteurs herpetiques, tels que les promoteurs ie-hcmv ou ie3-hsv-1. A l'oppose, lorsque le transgene est place sous controle d'un promoteur hsv-1 de classe beta (tk) ou de classe gamma (gc), des conditions de co-infection de la cellule cible par l'amplicon et le virus auxiliaire sont alors necessaires a l'expression transgenique. La possibilite de co-infecter une cellule cible par l'amplicon et le virus auxiliaire, malgre la toxicite cellulaire resultante, peut etre utilisee pour obtenir une complementation entre un virus hsv-1 defectif du gene essentiel ul42 et un amplicon porteur de l'allele sauvage, permettant ainsi la propagation du virus defectif dans des cellules non permissives

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Chan, Kwo Chion Chan Ka Ning. "Constitution d'un système de clonage pour une souche de Brevibacterium à applications industrielles." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20246.

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Brevibacterium sp. R312, une souche coryneforme d'importance industrielle, possede une enzyme amidase etroitement impliquee dans la biotransformation des derives nitriles, amides et acides. Deux axes de recherche ont ete poursuivis dans le but de cloner le gene de l'amidase. La premiere voie consiste a utiliser les techniques de clonage developpees chez escherichia coli. Ainsi, une banque genomique de brevibacterium sp. R312 a ete constituee. La proteine amidase a ete purifiee et le microsequencage peptidique n-terminal effectue. Des sondes oligonucleotidiques adequates ont ete recherchees et testees sur la banque. Les travaux preliminaires des clones positifs sont abordes. Le deuxieme axe de recherche concerne le developpement d'un systeme de clonage chez brevibacterium sp. R312. Les methodes de transformation de protoplastes et l'electroporation de cellules entieres ont ete testees avec succes. La technique d'electrotransformation a ete optimisee. La replication de differents plasmides cryptiques de souches voisines a ete examinee chez brevibacterium sp. R312. Deux vecteurs navettes escherichia coli/brevibacterium ont ete construits; ils possedent plusieurs sites de clonage uniques et expriment la resistance a la neomycine et a la tetracycline chez brevibacterium

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Richard, Emmanuel. "Développement de vecteurs lentiviraux : application à la thérapie génique d'un modèle murin de protoporphyrie érythropoi͏̈étique." Bordeaux 2, 2003. http://www.theses.fr/2003BOR21060.

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Abstract:

La transplantation de cellules souches hématopoietiques (CSH) génétiquement modifiées peut représenter une alternative à l'allogreffe de moelle osseuse (MO) en cas d'absence de greffon HLA compatible. Dans cette thèse nous avons développé des vecteurs de transfert de gène dérivés de lentivirus (VIH-1) et testé leur capacité à délivrer un gène thérapeutique dans les CSH d'un modèle murin de protoporphyrie érythropoiétique (PPE). La PPE est une maladie génétique liée à un déficit en ferrochélatase (FECH), conduisant à l'accumulation toxique de protoporphyrine associée à une photosensibilité cutanée. Nous démontrons un transfert de gène efficace dans les CSH murines associé à la correction de la photosensibilité à long terme grâce à l'expression du gène FECH dans le compartiment érythroide de la MO. La coexpression du gène FECH et du gène MGMT (méthylguanine ADN-méthyltransférase) permet la correction métabolique et la sélection in vivo des CSH transplantées en l'absence de myéloablation, conduisant à la correction phénotypique à long terme de la maladie
Transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells (HSCs) could represent an alternative to bone marrow transplantation when a match-HLA graft is not available. In this thesis, we have developed gene transfer vectors based on lentivirus (HIV-1) and tested their ability to deliver a therapeutic gene into HSCs, using a mouse model of erythropoietic protoporphyria (EPP). EPP is a genetic disease characterized by a ferrochelatase (FECH) deficiency, leading to the accumulation of toxic protoporphyrin associated with skin photosensibility. We demonstrate an efficient gene transfer into murine HSCs associated with long term skin photosensibility correction related to erythroid specific expression of the FECH gene. Coexpression of FECH and MGMT (methylguanine DNA-methyltransferase) genes allows metabolic correction and in vivo selection of genetically corrected HSCs transplanted without myeloablation after alkylating drug injection, leading to the long-term phenotypic correction of the disease

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Dary, Annie. "Études génétiques et moléculaires de streptomyces ambofaciens : 1) construction d'un vecteur de clonage, 2) plasticité génomique et production de spiramycine." Nancy 1, 1991. http://www.theses.fr/1991NAN10002.

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Abstract:

I. Construction d'un vecteur de clonage. Un gène de résistance au nosiheptide, présent dans streptomyces actuosus producteur de nosiheptide, a été cloné chez s. Lividans en utilisant le plasmide naturel ps10147. Un des clones résistants au nosiheptide sélectionnés présentait le plasmide recombinant pns1. Il correspond à ps10147 avec un insert de 10. 5 kb. Le gène conférant la résistance au nosiheptide a été localisé sur un fragment psti-pvuii de 1,12 kb de pns1. Après transformation de s. Ambofaciens dsm40697 par psn1, un nouveau plasmide (pns2) de plus petite taille et dérivé de pns1 a été isolé dans un clone résistant au nosiheptide sélectionné. Pns2 contient le fragment psti-pvuii de 1,12 kb porteur du gène de résistance au nosiheptide. Ii. Plasticité génomique et production de spiramycine. Dans la descendance de s. Ambofaciens dsm40697, producteur de spiramycine, une souche mutante dépigmentée et dépourvue de mycélium aérien a été isolée. L'analyse de l'ADN génomique a permis de déceler et de caractériser une séquence d'ADN amplifiée (ADS pour amplified dna sequence). Un remaniement génomique localisé sur un seul coté de la région amplifiée a été détecté dans la souche mutante. Une famille de molécules multimarques CCC a été détectée dans la souche mutante. La forme monomérique de cette famille présente une taille identique à celle de l'ADS précédemment décrite et toutes les molécules multimarques de cette famille sont homologues à cette ADS. Dans la descendance de souches amplifiées, isolées après un traitement au bromure d'ethidium de s. Ambofaciens rp181110, sept souches amplifiées ont été isolées. Les ADS de ces souches présentent un profil de restriction différent de celui présent dans la souche dont elles dérivent. Ces ADS ont été localisées à l'intérieur d'une même région amplifiable du génome de rp181110, laquelle est homologue a l'aud90 de la souche dsm40697.

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Maurice, Marielle. "Modification de la glycoprotéine portée par les vecteurs rétroviraux pour favoriser le transfert de gènes dans les cellules quiescentes et le ciblage cellulaire." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10274.

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Abdou, Souad. "Stratégie antisens d'inhibition de l'expression de gènes viraux (Coronavirus et Cytomegalovirus) : intérêt des cyclodextrines pour la vectorisation d'oligonucléotides." Nancy 1, 1999. http://www.theses.fr/1999NAN12017.

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Abstract:

La stratégie antisens est basée sur la capacité des oligonucléotides à reconnaître spécifiquement leurs cibles et inhiber la synthèse des protéines. Toutefois l'utilisation d'oligonucléotides en thérapeutique est actuellement limitée. Les difficultés tiennent à leur dégradation rapide par les nucléases des milieux biologiques et à leur faible pénétration intracellulaire. Les recherches actuelles s'orientent vers le développement d'oligonucléotides chimiquement modifiés ou de systèmes transporteurs. L'approche de vectorisation des médicaments vise à moduler voire même à maîtriser la distribution et les propriétés effectrices d'un principe actif en l'associant à un système approprié, un vecteur. Les cyclodextrines, oligosaccharides cycliques de faible masse moléculaire, sont des biovecteurs de choix. Leur cavité hydrophobe leur permet d'inclure de nombreuses molécules, de plus elles sont facilement véhiculées dans l'organisme, non immunogènes et dépourvues de toxicité. Enfin, leur fonctionnalisation par des groupements chimiques devrait améliorer leur capacité de complexation et leur conférer des propriétés de reconnaissance spécifique de récepteurs cellulaires. Ce travail de recherche s'est attaché, d'une part, à concevoir et à expérimenter l'approche oligonucléotidique antisens la plus adaptée à l'inhibition de la production de virus (coronavirus et cytomegalovirus) et, d'autre part, à étudier les propriétés de ces oligonucléotides après leur complexation à des cyclodextrines fonctionnalisées par des groupements glycosylés ou aminés. [. . . ]

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Olayat, Sophie. "Utilisation de vecteurs rétroviraux aviaires pour l'étude de l'implication de gènes dans la resistance des oiseaux aux maladies viro-induites." Tours, 1996. http://www.theses.fr/1996TOUR3309.

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Lleres, David. "Nouvelles stratégies de vectorisation non virale impliquant des détergents cationiques : Caractérisation physicochimique et devenir intracellulaire des complexes vecteurs/ADN." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2003. http://www.theses.fr/2003STR13184.

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Abstract:

Le succès de la thérapie génique repose sur la mise au point de vecteurs capables de délivrer efficacement le gène d'intérêt thérapeutique dans la cellule cible. Dans le cadre d'un transfert de gènes in vivo, la taille et la stabilité des complexes vecteurs/ADN sont des facteurs déterminants pour une bonne diffusion dans les milieux extracellulaire et intracellulaire. De ce fait, de nouveaux vecteurs synthétiques combinant les détergents cationiques et lipides cationiques ont été synthétisés dans le laboratoire du Dr. J. P Behr. Cependant, malgré des propriétés favorables de condensation monomoléculaire de l'ADN, ces vecteurs présentent des efficacités de transfection variables et limitées. Dans ce contexte, afin d'étudier les relations structure-activité de ces vecteurs, nous avons caractérisé les propriétés physicochimiques de complexes entre l'ADN et des vecteurs de la classe des détergents cationiques dimérisables. Par spectroscopie de fluorescence, nous avons montré que la capacité à condenser l'ADN, le degré de structuration des domaines hydrophobes ainsi que la stabilité des complexes formés étaient étroitement corrélés aux propriétés structurales des détergents. Ainsi, une longueur minimale de la chaîne hydrocarbonée des détergents est requise pour stabiliser les complexes. De même, une relation entre la stabilité des complexes et leur efficacité de transfection a été établie. L'ensemble de ces résultats nous a conduit à préparer de nouveaux complexes ternaires combinant des liposomes cationiques et des détergents cationiques avec l'ADN. Par cette approche, nous avons formé des complexes ternaires de petite taille et stables. En présence de sérum, leur efficacité de transfection s'est révélée supérieure à celle des lipoplexes. Des observations par microscopie confocale suggèrent que les complexes ternaires ne sont pas déstabilisés par le sérum et sont efficacement endocytosés par la cellule. Les études structurales par microscopie électronique et spectroscopie de fluorescence combinées au suivi du devenir intracellulaire des complexes ternaires, nous ont permis de corréler l'organisation lamellaire des complexes avec leur stabilité colloi͏̈dale en présence de sérum et leur efficacité de transfection cellulaire
The success of gene therapy depends on the development of vectors able to efficiency deliver therapeutic gene into target cells. For in vivo applications, the size and the stability of vector/DNA complexes are key determinants for an efficient blood diffusion and intracellular trafficking. Within this framework, new synthetic vectors combining properties of cationic detergents and lipids were synthesized in the laboratory of J. P Behr. In spite of their favourable monomolecular DNA condensing properties, the transfection efficiency of these vectors was limited. In this context, in order to study the structure-activity relationship of these vectors, we have characterized the physicochemical properties of DNA complexed with dimerizable cationic detergents. By fluorescence spectroscopy, we have investigated their ability to condense DNA, the molecular order of the hydrophobic domains, and the stability of these complexes. Indeed, a minimal hydrocarbon tail length is required to stabilize the complexes. Moreover, a tight relationship between the stability of these complexes and their transfection efficiency was established. Based on these results, we have prepared new ternary complexes combining cationic liposomes and cationic detergents to DNA. By this strategy, we have formed small and stable ternary complexes. In the presence of serum, their transfection efficiency was higher than lipoplexes. Confocal microscopy observations suggested that ternary complexes were only marginally destabilized by serum and efficiently internalized into cells by endocytosis. Structural studies by electron microscopy and fluorescence spectroscopy associated with the monitoring of intracellular trafficking revealed that the internal lamellar organization of the complexes was strongly correlated with their colloidal stability and their high transfection efficiency in the presence of serum

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Robert-Richard, Elodie. "Transfert de gène dans les cellules souches hématopoïétiques : application à la thérapie génique des porphyries érythropoïétiques." Bordeaux 2, 2006. http://www.theses.fr/2006BOR21341.

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Abstract:

La porphyrie erythropoietique congénitale (PEC) est une maladie monogénique hématologique sévère liée à un déficit en uroporphyrinogène III synthase, conduisant à l'accumulation toxique de porphyrines dans les issus hématopoietiques. La greffe allogénique de cellules souches hématopoietiques (CSH) génétiquement modifiées peut être une alternative à l'allogreffe de moelle osseuse en cas d'absence de donneurs HLA compatibles. Dans notre étude, des vecteurs dérivés de lentivirus ont été développés pour obtenir un tranqfert de gène efficace et stable dans les CSH murines et humaines. Ces vecteurs permettent une expression erythroide-spécifique du gène thérapeutique entraînant une correction enzymatique, métabolique et phénotypique complète du modèle murin PEC. L'évaluation de l'efficacité du transfert de gène dans les CSH humaines in vivo dans des souris immunodéficientes NOD/SCID sera un prérequis avant la mise en place d'un protocole clinique de thérapie génique
Congenital erythropoietic porphyria (CEP) is an hematological genetic disease characterized by an uroporphyrinogen III synthase deficiency, leading to an accumulation of toxic porphyrin in hemotopoietic tissues. Transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells (HSCs) could represent an alternative to bone marrow transplantation when a match-HLA graft is not available. In our work, lentiviral vectors were developed to obtain a stable and efficient gene transfer in murine and human HSCs. These vectors allow an erythroid-specific expression of the therapeutic gene leading to a complete enzymatic, metabolic and phenotypic correction of CEP mice. Evaluation of efficiency of gene transfer in human HSCs in an immunodeficient NOD/SCID model is a necessary step before we consider a gene therapy clinical trial for this disease

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Du, Perron de Revel Thierry. "Essais de stimulation de l'hématopoïèse par le transfert de gène de l'interleukine-1[alpha] chez le macaque cynomolgus : application à l'aplasie médullaire secondaire à une irradiation accidentelle." Besançon, 2002. http://www.theses.fr/2002BESA3021.

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Abstract:

L'interleukine-1 a, est une cytokine stimulant l'hématopoïèse mais dont les propriétés pro-inflammatoires limitent son utilisation thérapeutique lié à l'existence d'effets secondaires systémiques. Nous proposons une approche de délivrance locale médullaire d'IL-1 a, chez le macaque cynomolgus par le développement d'une méthode de transfert de gène selon deux stratégies vectorielles différentes. Le transfert ex vivo du gène de l'IL 1-a, par vecteur rétroviral dans les cellules stromales de moelle osseuse permet un accroissement de la production de GM-CSF et de G-CSF et de l'activité stimulant les colonies de progéniteurs myéloïdes du surnageant de culture. La ré-injection intraveineuse à l'animal de cellules génétiquement modifiées exprimant le gène de l'IL-1 a, et amplifiées ex vivo, entraîne une inflation modérée des lignées leucocytaire et plaquettaire. Une domiciliation médullaire est mise en évidence par la détection moléculaire du gène marqueur lacZ au niveau de la moelle osseuse. L'injection intramédullaire directe d'adénovirus recombinant exprimant l'IL 1-a, à l'animal sain entraîne une hyperleucocytose immédiate et une hyperplaquettose différée dont les mécanismes sont discutés. Après irradiation à doses sub-létales·(4 Gy), l'administration intramédullaire d'adénovirus recombinant IL-1 a permet une protection partielle des animaux liée à une diminution de la profondeur et de la durée de l'aplasie médullaire. La tolérance clinique des deux procédures est satisfaisante sans effet secondaire immédiat lié au vecteur rétroviral ou adénoviral ou à la production intramédullaire d'IL-1 a. En conclusion, la stratégie de délivrance locale intramédullaire d'un gène codant une cytokine possédant des effets secondaires systémiques, pourrait être mise en œuvre dans un but de stimulation de la myélopoïèse tout en limitant la toxicité générale de son administration par voie générale. Cette approche thérapeutique est discutée dans le cadre de la prise en charge des aplasies médullaires secondaires à une irradiation accidentelle
Pas de résumé en anglais

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Ioualalen, Karim. "Etude de l'acylation régiosélective de nanoparticules polysaccharidiques : application à la synthèse des bio vecteurs supramoléculaires (BVSM)." Toulouse, INSA, 1994. http://www.theses.fr/1994ISAT0053.

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Abstract:

Les biovecteurs supramoleculaires (bvsm) sont constitues d'un noyau polysaccharidique fonctionnalise, entoure par un compartiment lipidique permettant l'insertion des ligands assurant le ciblage cellulaire. L'ancrage dynamique des phospholipides en peripherie des particules polysaccharidiques, necessite le greffage prealable d'une couche d'acides gras. Cette reaction de derivation regioselective des particules seches, est realisee en solvant apolaire, non solubilisant des polysaccharides. Ce travail porte sur l'etude de la reaction d'acylation et sur l'etude des conditions de deshydratation permettant une dispersion maximale des particules dans le solvant de reaction. L'etude des techniques de dessiccation des polysaccharides, nous a permis de retenir la lyophilisation pour la deshydratation des particules de 20 nm. Cependant, l'emploi de sels volatils est necessaire pour limiter les phenomenes d'agregation. Enfin, la derivation complete et homogene des particules de 20 nm, ne peut etre obtenue qu'apres plusieurs cycles d'acylation. Les particules acylees sont alors capables de stabiliser l'ancrage externe des phospholipides, pour former les bvsm

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Rueda, Naika. "Development of lentiviral vectors to study the influence of angiogenic molecules on glioma growth." Thesis, Université Laval, 2010. http://www.theses.ulaval.ca/2010/27128/27128.pdf.

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Abstract:

Les glioblastomes sont des tumeurs du système nerveux central hautement létaux. Ils se caractérisent par leur grande infiltration dans les tissus avoisinants. Ils modifient les vaisseaux sanguins préexistants et ils migrent d’une façon perivasculaire. Cette cooption vasculaire est un processus entraînant l’expression d’Angiopoietine-2 (Angpt2) par des cellules endothéliales et sa liaison au récepteur Tie2. Le premier objectif de cette étude était d’examiner le potentiel thérapeutique de deux protéines qui pourraient interférer avec Angpt2, à savoir Angpt3 et la partie soluble extracellulaire du récepteur Tie2 (sTie2). Le deuxième objectif était de développer des vecteurs lentiviraux capables d’exprimer ces protéines, tout en offrant la possibilité d’identifier et détruire les cellules génétiquement modifiées. À cette fin, nous avons construit un vecteur contenant une cassette bicistronique qui exprime le marqueur amélioré de la protéine fluorescente verte (EGFP) fusionnée au gène suicide provenant du virus herpès simplex de type I-thymidine kinase (HSVtk). Les cellules du gliome GL261 transduites avec ce vecteur pourraient être suivies et tuées sur demande par l’administration de la prodrogue ganciclovir, soit in vitro, soit après l'implantation dans le cerveau des souris. Malgré l’expression des hauts niveaux d’Angpt3 et de sTie2 obtenus avec ce vecteur, nous avons observé qu’Angpt3 augmente la déstabilisation capillaire et la croissance de gliomes, alors que sTie2 n’exerce aucun effet. Globalement, cette étude a permis de comprendre l’importance de la voie de signalisation de Tie2 dans le développement des gliomes et le rôle d’Angpt3, mais suggère que ni cette molécule ni sTie2 soient des agents efficaces contre les gliomes malins. Cette étude fournit également le prototype d’un vecteur lentiviral pour la thérapie génique plus sécuritaire.
Glioblastomas are highly lethal tumors of the central nervous system characterized by large spread into the surrounding tissues. They modify and migrate along pre-existing blood vessels. This vascular cooption is a process involving the release of angiopoietin-2 (Angpt2) from endothelial cells and binding to the Tie2 receptor. The first goal of this study was to examine the therapeutic potential of two proteins that could interfere with Angpt2, namely Angpt3 and the soluble extracellular domain of Tie2 (sTie2). The second goal was to develop a lentiviral vector capable of delivering such proteins while offering the possibility to identify and destroy the genetically modified cells. To this end, we designed a bicistronic construct expressing the marker enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the suicide gene herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSVtk). GL261 glioma cells transduced with this vector could be tracked and killed on command by the administration of the prodrug ganciclovir, either in vitro or after implantation into mouse brains. High levels of Angpt3 or sTie2 could be achieved with this vector; however, Angpt3 increased capillary destabilization and glioma growth, whereas sTie2 exerted no effect. Overall, this study helps to understand the importance of the Tie2 signaling pathway in glioma development and the role of Angpt3, but suggests that neither this molecule nor sTie2 are effective agents against malignant gliomas. This study also provides a lentiviral vector design for safer gene therapy.

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Polard, Patrice. "Etude de l'élément transposable bactérien IS911 : mise en évidence et caractérisation des facteurs nécessaires à sa transposition." Toulouse 3, 1993. http://www.theses.fr/1993TOU30057.

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Abstract:

La sequence d'insertion is911 est un element transposable decouvert chez l'enterobacterie shigella dysenteriae. Elle appartient a la famille is3, qui rassemble actuellement le quart des sequences d'insertion bacteriennes. De taille voisine, elles presentent deux cadres de lecture juxtaposes, orfa et orfb. La caracteristique centrale qui rassemble ces elements est une forte similitude de la sequence proteique deduite du cadre de lecture majeur orfb. A ce critere unificateur s'ajoute l'identite de leurs bases terminales, invariablement formees du dinucleotide 5-ca-3. Les homologies majeures qui rassemblent les sequences d'insertion de la famille is3 ont ete retrouvees chez les retrovirus et les retrotransposons. Les proteines deduites des cadres de lecture orfb portent un domaine proteique d'une centaine d'acides amines retrouve dans l'integrase de ces retro-elements eucaryotes. Ces retro-elements se terminent tous par le dinucleotide 5-ca-3. Les proteines exprimees par is911 sont au nombre de trois. Deux d'entre elles, orfa et orfb, sont des produits independants d'orfa et d'orfb. La troisieme, orfab, est une fusion de ces deux proteines. Elle est issue d'un decalage de phase traductionnel programme. Orfab est la transposase de l'element. La transposition d'is911 ne serait pas replicative. D'un point de vue mecanistique, elle se rapprocherait de l'integration retrovirale. L'expression individuelle de la transposase s'accompagne de la circulation precise de l'element au niveau de ses extremites. Cette forme excisee d'is911 est le resultat d'une transposition intramoleculaire. Elle n'est pas observee lorsqu'orfab est exprimee avec orfa. De plus, cette proteine stimule la transposition intermoleculaire. Nous n'avons trouve aucun role a la proteine orfb. Les proteines orfa et orfab, mais pas orfb, se fixent specifiquement sur les extremites de l'element. L'ensemble de ces resultats ont permis de proposer un modele pour le deroulement de la transposition et de la circularisation d'is911

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Bossin, Hervé. "Développement de vecteurs d'expresssion stable dérivés du densovirus JcDNV : application à l'expression constitutive de protéines hétérologues en lignées cellulaires de lépidoptères et comme marqueur au cours du développement chez la drosophile." Montpellier 2, 1998. http://www.theses.fr/1998MON20207.

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Abstract:

Une serie de vecteurs derives du genome du densovirus jcdnv exprimant le gene gfp (green fluorescent protein) sous controle du promoteur viral p9 ont ete construits. La transfection de la lignee cellulaire sf9 de lepidoptere par ces construits conduit a l'expression stable de la proteine et a l'obtention de clones cellulaires en dehors de toute pression de selection. L'analyse du statut de l'adn viral recombinant dans ces clones montre qu'il y a integration dans l'adn cellulaire, via les repetitions terminales inversees, si les fonctions non structurales virales sont presentes, et maintien sous forme episomale si ces fonctions sont deletees. Par ailleurs, les potentialites d'expression stable en cellules spc-sl-52 d'une proteine d'interet, l'erythropoiteine humaine (epo), ont ete confirmees en construisant un recombinant du jcdnv exprimant le gene sous controle du promoteur de l'actine cytoplasmique a3 de bombyx mori. Des clones cellulaires exprimant l'epo a des taux significatifs (de 20 a 95 ui/ml de surnageant de culture) ont ete isoles et la stabilite d'expression demontree pendant plus de six mois. Enfin, la microinjection dans des oeufs de drosophiles, des construits jcdnv exprimant le gene lacz ou gfp, a conduit a l'expression de ces proteines dans les embryons, les larves et jusqu'au stade adulte, demontrant ainsi les potentialites de ces vecteurs pour la transformation genetique des insectes.

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Devedjian, Jean-Christophe. "Etude de la régulation de la réceptivité alpha 2-adrénergique dans les cellules épithéliales digestives humaines." Toulouse 3, 1993. http://www.theses.fr/1993TOU30249.

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Abstract:

Le recepteur alpha2-adrenergique de l'epithelium intestinal est responsable des effets antidiarrheiques des alpha2-agonistes. Mon travail a consiste a caracteriser le sous-type de recepteur exprime dans l'epithelium intestinal humain et a etudier sa regulation in vivo et in vitro. Nos etudes montrent que seul le sous-type pharmacologique alpha2a, produit du gene alpha2c10, est exprime dans ce tissu. Le recepteur disparait au cours de la differenciation enterocytaire et la diminution des arnm observee au cours de ce processus laisse presager une regulation transcriptionnelle. La suite de ce travail n'a pu etre realisee que grace a l'utilisation d'un modele de cellule cancereuse colique humaine en culture: la lignee ht29. Les resultats obtenus sur cette cellule montrent que la transcription du recepteur alpha2a-adrenergique est fortement inhibee par l'insuline et les acides gras volatils (butyrate et propionate). Cette derniere observation est d'autant plus interessante que ces produits de la fermentation colique peuvent induire la differenciation des cellules ht29 in vitro. Ce travail peut maintenant deboucher sur l'analyse des sequences du promoteur responsable des regulations observees. De plus, grace aux outils et aux modeles developpes au laboratoire, nous pouvons desormais envisager l'etude du role des recepteurs alpha2-adrenergiques tant au niveau de la secretion que de la proliferation de ces cellules

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Ly, Nary. "Caractérisation moléculaire du VIH-1 et premières données de la résistance aux antirétroviraux au Cambodge." Bordeaux 2, 2006. http://www.theses.fr/2006BOR21336.

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Abstract:

La variabilité génétique du VIH-1 a de nombreuses implications en particulier au niveau de la résistance aux anti-retroviraux (ARVs). En effet les mutants résistants aux ARVs sont bien caractérisés pour le sous-type B mais des données nouvelles sont nécessaires pour les sous-types non-B. Dans ce travail mené au Cambodge, nous nous sommes intéressés au CRF01_AE. Dans une première étude nous avons caractérisé les isolats viraux de patients adultes naîfs d'ARVs ; nous avons montré la large prédominance (95,5 %) du CRF01_AR , en outre nous avons mis en évidence la faible prévalence de mutations de résistance (MDR), inférieure au seuil fixé par l'OMS (5 %). La seconde étude a concerné des femmes enceintes recevant une prophylaxie par une simple dose de nevirapine dans le cadre d'une prévention de la transmission du VIH-1 de la mère à l'enfant. Nous avons observé un taux d'incidence des MDR aux inhibiteurs non nucléosidique de la transcriptase inverse variant de 18,8 % à 31,3 %, selon la période de l'échantillonnage. Globalement les mutations du CRF01_AE cambodgien étaient similaires à celles des sous-types A, D et CRF02_AG. Une dernière étude a porté sur des patients adultes recevant une HAART et présentant un échec thérapeutique. Les MDR observées étaient celles attendues pour le sous-type B. Cependant, d'autres substitutions ont été détectées chez ces patients en échec qui devront être confirmées sur de plus larges séries. Ces données pourraient à terme plaider pour une réactualisation artielle des algorithmes
Genetic variability of HIV-1 has multiple implications, especially in regard to antiretroviral (ARV) drug resistance. Mutant resistances to ARVs are well characterized for B subtype but new data are needed for non-B subtypes. This research project investigated CRF01_AE in Cambodia. A first study has characterized viral isolates from adult patients naive to ARVs. It showed a large predominance of CRF01_AE (95,5 %), and a low prevalence of drug resistance mutations (DRM), lower than World Health Organization's 5 % threshold. A second study involved pregnant women who received nevirapine single dose prophylaxis for prevention of mother-to-child HIV-1 transmission. We observed incidence rates of DRM to nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors of 18,8 % to 31,3 % according to the sampling time. Cambodian CRF01_AE mutations are generally similar to those observed in A, D and CRF02_AG subtypes. A last study involved adult patients in therapy failure under HAART. The DRM observed were those expected for the B subtype. Other substitutions were also detected in these patients but should be confirmed on larger samples. These data could lead to the partial update of algorithms

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Leriche, Françoise. "Recherche d'outils, génétiques utilisables chez la bactérie psycrotrophe MFO, étude de leur comportement aux différentes températures de croissance de la souche et construction d'une fusion traductionnelle par génétique réverse." Rouen, 1993. http://www.theses.fr/1993ROUES040.

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Abstract:

Recherche d'outils génétiques utilisables chez la bactérie pseudomonas fluorescens MFO et mise au point des conditions de leur utilisation aux différentes températures de croissance de la souche. Mise au point d'un vecteur de clonage, de conditions d'intégration de gènes étrangers dans le chromosome bactérien, d'une méthode de cartographie par transfert chromosomique et de transposition par génétique réverse

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Robaglia, Christophe. "Étude du génome du virus Y de la pomme de terre : construction et utilisation de vecteurs d'expression en vue d'obtenir des plantes transgéniques résistantes à ce virus." Paris 11, 1988. http://www.theses.fr/1988PA112247.

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Abstract:

L’ADN complémentaire de l’ARN génomique de ce virus a été clone et séquence entièrement. Cet Arn comporte 9704 bases et peut coder pour une poly protéine de 3063 acides aminés que l'on a comparés à d'autres polyvirus. Des vecteurs d'expression bases sur le système de transformation génétique du plasmide ri d'agrobacterium rhizogenes ont été construits et utilisés pour introduire dans des plantes un gène artificiel codant pour la protéine de capside du virus

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Mougenot-Lhériteau, Elsa. "Évaluation de vecteurs associés à l'adénovirus recombinant (AAVr) pour le traitement par thérapie génique de modèles canins de l'amaurose congénitale de Leber : le teckel RPGRIP1 déficient et le briard RPE65 déficient." Nantes, 2010. https://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show/show?id=7bc97fdd-81ff-4f9a-b108-c661ca097f92.

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Abstract:

L'amaurose congénitale de Leber est une dystrophie rétinienne héréditaire responsable de cécité congénitale. Le teckel RPGRIP1-/- et le briard RPE65-/- sont deux modèles canins de cette pathologie. Chez le teckel RPGRIP1-/-, nous avons tout d'abord caractérisé la pathologie puis nous avons mis au point un vecteur ciblant spécifiquement les photorécepteurs. L'efficacité de ce vecteur portant le gène RPGRIP1 humain ou canin a alors été évalué. La thérapie génique d'addition médiée par les AAV a déjà démontré son efficacité chez le briard RPE65-/-. Dans le but de réguler l'expression du transgène dans le temps, nous avons développé et évalué l'efficacité de vecteurs portant le gène RPE65 humain sous le contrôle de promoteurs régulables à la tétracycline
Leber congenital amaurosis is an hereditary retinal dystrophy responsible for congenital blindness. The Dachshund dog RPGRIP1-/- and the Briard dog RPE65-/- are two canine models of this pathology. We have characterized the pathology in the dachshund dog RPGRIP1-/-. Then, we have developed a photoreceptor-specific AAV vector and we have evaluated the efficiency of this vector carrying either the human RPGRIP1 gene, or the canine RPGRIP1 gene. Replacement gene therapy with AAV vectors has already showed its efficacy in the Briard dog RPE65-/-. We have investigated the ability of the tetracycline-regulatable system to regulate retinal function in RPE65-/- Briard dogs

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Lupoli, Roland. "Recherches sur la caractérisation intraspécifique moléculaire et biologique des pucerons en vue de son application à l'épidémiologie des virus de type non persistant." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20101.

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Abstract:

Un critere de differenciation des populations de pucerons reposant sur les techniques d'hybridation a l'aide d'une sonde d'adn ribosomal a ete obtenu. La variabilite observee est liee aux regions non transcrites de l'adn ribosomal. Elle n'est pas la meme chez toutes les especes de pucerons: on l'observe a l'echelle d'un meme champ avec rhopalosiphum maidis, et a l'echelle de plusieurs centraines de kilometres chez aphis gossypii. L'efficacite de transmission d'un virus de type non persistant est un caractere stable au cours du temps chez un meme clone de puceron en conditions controlees. A l'echelle regionale, l'amplitude de ce caractere est faible chez aphis gossypii. Les utilisations de ces methodologies pour suivre les deplacements des pucerons ou evaluer les risques d'introduction de populations virales sont discutees

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Belmadi, Nawal. "Développement, formulation et biodistribution de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes dans le cadre de la thérapie génique de la mucoviscidose." Thesis, Brest, 2015. http://www.theses.fr/2015BRES0093/document.

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Abstract:

La mucoviscidose est une maladie monogénique, caractérisée par des mutations survenant au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le clonage en 1989 du gène CFTR a permis d’envisager de traiter cette maladie par thérapie génique. Cela consiste à transférer à l’aide d’un vecteur, une version normale du gène CFTR dans les cellules atteintes des patients. En raison de la gravité des complications pulmonaires, c’est l’épithélium respiratoire qui constitue aujourd’hui le tissu cible pour le transfert de gènes. Le principe de la thérapie génique est évidemment très séduisant et un certain nombre d’essais cliniques ont d’ores et déjà été réalisés. La thérapie génique nécessite des outils de vectorisation efficaces et compatibles avec une utilisation répétée en clinique.Mon sujet de thèse a porté donc sur le développement, la biodistribution et l’optimisation de vecteurs synthétiques (lipides cationiques) pour le transfert de gènes dans l’épithélium respiratoire. Au cours de mes travaux, nous avons donc pu mettre au point des lipophosphoramidates KLN47 fluorescents utiles pour les études de biodistribution in vivo. Comparés au KLN47 non fluorescent, ces nouveaux composés présentent les mêmes propriétés physicochimiques, à savoir une taille relativement petite et un potentiel zêta positif. Sur lignées cellulaires, nous avons montré que les nouvelles formulations étaient aussi efficaces que le KLN47, et pas ou peu toxiques. Ensuite, sur modèle animal, les profils de biodistribution de lipoplexes pégylés et non-pégylés ont été comparés après injection systémique. Les profils de biodistribution des lipoplexes pégylés et non-pégylés étaient similaires, cependant, la pégylation des complexes a conduit à une circulation prolongée dans la circulation sanguine, alors que l’expression du transgène (luciférase) était équivalente dans les deux cas. De plus, l’activité luciférase était similaire à celle obtenue avec le KLN47 non fluorescent. Nous avons ainsi démontré que l’ajout des sondes lipidiques fluorescentes dans la solution liposomale du KLN47, ne modifie pas ses propriétés physicochimiques et transfectantes. L’ensemble des résultats montre que nous disposons d’outils prometteurs pour les études de biodistribution in vivo. D’autres molécules ont également été testées avec succès
Cystic fibrosis is a monogenic disease characterized by mutations occurring at the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. The clonining in 1989 of the CFTR gene has enabled to consider treating this disease by gene therapy. This consists of transferring a normal version of the CFTR gene in the affected patients’ cells, using a vector. Due to the severity of pulmonary complications, it is obvious that the respiratory epithelium constitutes the target tissue for the gene transfer. The principle of gene therapy is indeed very attractive and a number of clinical trials have already been made. Gene therapy requires vectorization tools that are efficient and compatible with repeated clinical use.My thesis has focused on the development, biodistribution and optimization of synthetic vectors (cationic lipids) for gene transfer in the respiratory epithelium. During my work, we were able to develop useful fluorescent KLN47 lipophosphoramidates for in vivo biodistribution studies. Compared to non fluorescent KLN47, these new compounds exhibit the same physicochemical properties: a relatively small size and a positive zeta potential. On cell lines, we found that the new formulations were as effective as the KLN47, with little or no toxicity. Then, in animal models, the biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were compared after systemic injection. The biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were similar. However, the pegylation of the complex resulted in prolonged circulation in the bloodstream, whereas transgene expression (luciferase) was equivalent in both cases. In addition, luciferase activity was similar to that obtained with the non-fluorescent KLN47. We have demonstrated that the addition of fluorescent lipid probes in the liposomal solution KLN47, does not change its physicochemical and transfectant properties. The overall results show that we have promising tools for in vivo biodistribution studies. Other molecules have also been tested successfully

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Bire, Solenne. "Optimisation de la biosécurité du vecteur transposon piggyBac pour le transfert de gène : utilisation des ARN messagers et des insulateurs." Thesis, Tours, 2011. http://www.theses.fr/2011TOUR4043.

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Abstract:

Les progrès en biotechno]ogie ont permis le développement d’outils pour le transfert de gène intégratif en transgénèse, bioproduction et thérapie génique. Cependant, trois challenges majeurs doivent être relevés pour garantir un système sécurisé : l’innocuité et l’efficacité du transfert, l’intégration ciblée et contrôlée dans le génome, le niveau et la durée d’expression du transgène au cours du temps. Dans ce but, mes travaux de thèse ont consisté à tester des solutions pour améliorer la biosécurité du transposon piggyBac qui nécessite un plasmide porteur du gène d’intérêt à insérer dans le génome et une source de transposase catalysant la réaction d’intégration du transgène. Une des stratégies de ma thèse repose sur l’apport de la source de transposase sous forme d’ARN messager au lieu d’ADN afin d’améliorer la stabilité de l’intégration et de réduire les effets génotoxiques en limitant la transposase dans les cellules. Pour la première fois, la biodisponibilité de l’ARNm de la transposase et les conditions optimales d’utilisation en cellules humaines ont été déterminées pour augmenter la biosêcurité du système. Le second objectif de mes travaux consiste à améliorer l’expression du transgène en ajoutant des insulateurs connus pour s’opposer à l’extinction de l’expression des gênes. En termes de biosécurité, cette stratégie permet de réduire le nombre de copies du transgène nécessaires pour obtenir une expression suffisante. Deux candidats ont été identifiés pour améliorer l’expression du transgène. La combinaison des approches ARNrn et insulateurs est prometteuse pour sécuriser le transfert de gène médié par piggyBac et pour maintenir l’expression du gène d’intérêt
Advances in biotechnology have enabled the development of tools for gene transfer applicable to transgenesis, bioproduction and gene therapy. But, 3 major challenges must be met to ensure a secure system: the safety and effectiveness of the transfer. the targeted and controlled integration into the genome. and the level of transgene expression over time. In this aim, my thesis project was to validate solutions to improve the biosafety of the piggyBac transposon, which requires a plasmid carrying the gene of interest to be inserted in the genome, and a source of transposase which catalyzes the transgene integration. One approach of my thesis work is to deliver the source of piggyBac transposase as an mRNA molecule instead of DNA. This strategy aims to improve the stability of the integration and reduce the genotoxic effects by limiting the transposase in the cells. For the 1st time, the bioavailability of the transposase rnRNA and the optimal conditions for its use in human cells were determined to increase the biosafety of the transposon system. The 2nd objective ofmy project is to improve the expression of the transgene by adding insulators known to counteract the transgene silencing. This strategy reduces the number of integrations required ta get a sufficient expression of the transgene and thus, improve biosecurity. Two candidates have been identified to improve transgene expression. The combination of the mRNA and insulator strategies is promising to secure the piggyBac-mediated gene transfer and to maintain the expression of the gene of interest

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Meziadi, Chouaïb. "Caractérisation génétique et génomique de l'interaction Phaseolus vulgaris/Bean pod mottle virus." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS494.

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Abstract:

Les interactions plante-virus diffèrent des autres interactions plante-pathogènes du fait de la nature des virus qui sont des parasites intracellulaires obligatoires. Plus spécifiquement, l’interaction haricot commun (Phaseolus vulgaris L.)-Bean pod mottle virus (BPMV) a été étudiée en mettant l’accent à la fois sur la résistance de la plante mais aussi sur la virulence du virus dans l’objectif de mieux comprendre et d’identifier les facteurs intervenant dans le dialogue moléculaire entre plante et virus. Ces deux partenaires interagissent selon le modèle «gène-à-gène» de Flor. 1) Côté plante, nous avons identifié un gène de résistance dominant vis-à-vis du BPMV chez BAT93, le gène R-BPMV. Ce gène est localisé à l’extrémité du chromosome Pv02, dans la région du locus I, un locus de résistance multi-parasitaire vis-à-vis de différents virus, bactérie et champignon. La cartographie fine du gène R-BPMV suivie du séquençage de la région à partir d’un contig de clones BACs chez BAT93 a permis d’identifier des séquences codant pour des protéines NB-LRR qui pourraient correspondre au gène R-BPMV. Des études de microsynténie et de phylogénie ont été réalisées afin de mieux comprendre l’évolution des gènes présents dans cette région. L’étude au niveau cellulaire du phénotype associé à la résistance a permis de montrer que le gène R-BPMV bloque le mouvement de cellule à cellule du virus et que le phénotype associé est température-dépendant. 2) Côté virus, le clonage de toutes les ORFs du BPMV associé à des expériences d’agroinfiltration sur P. vulgaris et Nicotiana benthamiana ont permis d’identifier deux facteurs viraux importants dans le dialogue moléculaire plante-virus : la protéine VPg du BPMV correspond à la protéine d’avirulence agissant en interaction avec le produit du gène R-BPMV dans le cadre du modèle «gène-à-gène», et l’ARN polymérase ARN-dépendante virale correspond à un suppresseur de silencing à effet faible. 3) A ce jour, la transformation génétique stable n’est pas applicable en routine chez les légumineuses. Un objectif de la thèse est de développer des outils de validation fonctionnelle pouvant s’appliquer à des gènes d’intérêt agronomique, dont des gènes de résistance aux maladies. L’approche VIGS basée sur un vecteur viral dérivé du BPMV, déjà utilisée chez le soja, a ainsi été adaptée sur haricot et pois (Pisum sativum), une légumineuse économiquement importante en Europe
Plant-virus interactions differ from other plant-pathogen interactions because viruses are obligate intracellular parasites. More specifically, common bean (Phaseolus vulgaris L.)-Bean pod mottle virus (BPMV) interaction was studied by focusing both on the plant resistance and on the virus virulence in order to highlight and identify factors involved in the molecular dialog between plant and virus. These two partners interact according to the “gene-for-gene” model described by Flor. 1) On the plant side, we identified a dominant resistance gene against BPMV in cv. BAT93, the R-BPMV gene. This gene is located at one end of chromosome Pv02 in the I locus region, a multi-parasitic resistance locus involved in resistance to different viruses, bacteria and fungi. Fine mapping of R-BPMV followed by sequencing of the region from a BACs contig in BAT93 allowed us to identify sequences encoding NB-LRR proteins that could correspond to R-BPMV. Microsynteny and phylogeny studies were performed to understand the evolution of genes present in this region. When resistance phenotype was studied at the cellular level, we found that R-BPMV blocks BPMV cell-to-cell movement and that resistance phenotype is temperature-dependent. 2) On the virus side, cloning of all BPMV ORFs in association with agroinfiltration assays in P. vulgaris and Nicotiana benthamiana allowed us to identify two important factors involved in plant-virus molecular dialog: the BPMV VPg acting as an avirulence factor in interaction with the product of R-BPMV in the “gene-for-gene” model, and the viral RNA-dependent RNA polymerase that corresponds to a weak RNA silencing suppressor. 3) To date, stable genetic transformation is not routinely feasible in legumes. One objective of this thesis was to develop news tools for functional validation studies for genes of agronomic interest, including disease resistance genes. The VIGS approach based on the viral BPMV vector, first used in soybean, was adapted to common bean and pea (Pisum sativum), a legume species of high economic importance in Europe

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Gonzalez, Gaëlle. "Transfert du CFTR par vecteurs de gènes dérivés des adénovirus ou par trogocytose de microparticules membranaires : mécanismes moléculaires et applications à la mucoviscidose." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00819319.

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La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR, conduisant à une altération de la fonction de canal à ions chlorure de la glycoprotéine transmembranaire CFTR associée à une atteinte pulmonaire sévère. Plusieurs études récentes ont amené à reconsidérer l'utilisation des vecteurs adénoviraux (Ad) de sérotype 5 (Ad5) dans la mucoviscidose, lesquels induisent non seulement des réactions immunes anti-adénovirales mais aussi des effets cytopathiques indésirables. (1) Dans une première partie de notre étude, nous avons étudié l'entrée et le transit intracellulaire de l'Ad5/F35, vecteur chimérique portant les fibres de l'Ad sérotype 35 sur une capside de sérotype 5. Nous avons montré que la protéine fibre est déterminante dans l'internalisation et le trafic intracellulaire de ce vecteur. Le vecteur Ad5/F35 exprimant la fusion GFP-CFTR s'est révélé (i) être dépourvu de cytotoxicité, (ii) transduire efficacement les cellules épithéliales pulmonaires par voie apicale, et (iii) restaurer l'activité de canal à chlorure dans les cellules CFTR(-). Il constitue donc un vecteur de transfert du gène CFTR potentiellement utilisable en thérapie génique de la mucoviscidose. (2) Dans une seconde partie, nous avons exploré une stratégie alternative de transfert de la protéine CFTR par trogocytose. Nous avons fait l'hypothèse que le canal CFTR pouvait être véhiculé par des microvésicules ou microparticules membranaires (MP) émanant de la membrane cellulaire et libérées dans le milieu de culture. En utilisant un système d'expression stable de la protéine CFTR étiquetée par la protéine fluorescente GFP (GFP-CFTR) dans des cellules donneuses, nous avons pu démontrer que les MP sont capables de prendre en charge et délivrer la protéine GFP-CFTR à des cellules réceptrices, mais ce transfert n'est assuré que par une population réduite de MP (≤ 8 %), et la durée de vie du GFP-CFTR n'est que transitoire (≤ 24h). En fait, la majorité des MP transfèrent des molécules d'ARN messager ou polysomal GFP-CFTR. La protéine GFP-CFTR néosynthétisée à partir de ces ARNm est exprimée plus tardivement (> 48h) mais de façon prolongée (≥ 10 jours). La fonctionnalité du canal CFTR ainsi néosynthétisé est en cours d'évaluation. Les MP constituent donc un nouveau type de vecteurs de transfert non génique du CFTR qui pourraient être employés en thérapie de la mucoviscidose.

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De, Dreuzy Edouard. "Ciblage chromosomique des vecteurs lentiviraux, risque génotoxique, dominance clonale et expansion des cellules souches hématopoïétiques." Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC009.

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Abstract:

La thérapie génique associée à la transplantation de cellules médullaires est une approche médicale expérimentale, notamment développée pour des individus atteints de maladies génétiques du sang. Les premiers essais cliniques concluants furent basés sur l'utilisation de vecteurs y-rétroviraux mais leur insertion dans le génome a provoqué l'émergence de néoplasmes à une fréquence élevée. Depuis près de dix ans, les vecteurs lentiviraux sont testés chez l'Homme. En plus d'une meilleure efficacité de transduction des cellules souches hématopoïétiques, l'intégration de ces vecteurs, guidée par le facteur cellulaire LEDGF, se concentre dans des régions à plus faible risque oncogénique. Toutefois, des études réalisées in vitro et in vivo montrent qu'ils ne sont pas totalement dénués de risque génotoxique. Lors du premier essai clinique de thérapie génique lentivirale pour la p-thalassémie, l'insertion du vecteur dans le gène HMGA2 a conduit à la surexpression du gène et à l'expansion d'un clone hématopoïétique myéloïde. Nous avons entrepris d'éclaircir les mécanismes cellulaires affectés par l'expression du gène HMGA2. Les résultats mettent en évidence une expansion bégnine des cellules souches hématopoïétiques ainsi que des lymphocytes T de mémoire centrale. Afin de réduire le risque oncogénique associé à l'insertion des vecteurs lentiviraux, nous avons conçu des protéines capables de se substituer au facteur endogène LEDGF et susceptibles d'assurer l'intégration des vecteurs dans des régions du génome dénuées d'oncogènes. Nous avons également mis au point un protocole de transfert de gènes permettant l'exploitation de ces résultats dans les cellules souches hématopoïétiques
Gene therapy based on the transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells is an experimental medical approach for patients with genetic blood diseases when compatible allogeneic donors are not available. The first clinical successes were based on the use of y¬retroviral vectors, but vector insertions close to oncogenes have led to the development of neoplasms at a high frequency. Lentiviral vectors have been tested in human clinical trials for nearly ten years. In addition to better transduction efficiency in hematopoietic stem cells, their integration, guided by the cellular LEDGF protein, is less genotoxic than that of y-retroviral vectors. Nevertheless, in vitro and in vivo studies have demonstrated the existence of residual genotoxic potential. In the first lentiviral clinical trial for P-thalassemia, one patient had anintegration site within the HMGA2 gene, leading to overexpression of a truncated form of the protein and to clonai dominance restricted to the myeloid compartment. In order to clarify the cellular mechanisms affected by HMGA2, we have undertaken in vivo mouse studies. Our results indicate that HMGA2 induces a benign expansion of hematopoietic stem cells as well as of self-renewing central memory T cells. In order to reduce the risk associated with lentiviral vector integration, we have developed chimeric proteins, targeted to safe genomic harbors, which were able to substitute for the cellular LEDGF tethering protein. We also developed a gene transfer protocol allowing the translation of these results to hematopoietic stem cells

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Delaunay, Anne-Marie. "5-aminolevulinate deshydratase : clonage et expression du gène de rhodobacter sphaeroïdes." Rouen, 1990. http://www.theses.fr/1990ROUE5009.

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Abstract:

La construction d'une banque génomique de rhodobacter sphaeroïdes dans une souche d'escherichia coli (SHSP3) hem b#), mutée sur le gène codant pour la 5-aminolevulinate deshydratase (5-ALAD, E. C. 4. 2. 1. 24) a été réalisée. La 5-ALAD est une enzyme oligomérique synthétisant à partir de 5-ALA le porphobilinogène, monopyrrole précurseur des hemes. La banque obtenue après transformation de la souche SHSP3 présente des colonies de phénotypes différents. Certaines sont caractérisées par une croissance rapide. Nous avons sélectionné parmi ces colonies, 2 clones présentant une activité 5-ALAD, accompagnée de la production d'une protéine reconnue par des anticorps specifiques apres immunoempreinte. L'analyse de ces plasmides recombines indique que l'adn a été remanié au cours de la transformation. Toutefois l'un des plasmides conserve après purification et retransformation de la souche SHSP3, la possibilité de complémenter la délétion; ce plasmide possède au moins une partie de l'adn introduit, en particulier le gène codant pour la 5-ALAD. Le sous-clonage a été effectué dans le plasmide PUC19. La séquence codante pour la 5-ALAD est sous le contrôle du promoteur du vecteur d'expression

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Llanes, Catherine. "Plasmides de resistance de serratia marcescens : typage de replicons, clonage et sequencage du replicon repa/c." Besançon, 1993. http://www.theses.fr/1993BESA3709.

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Simoneau, Philippe. "Etude biochimique et génétique des protéines membranaires de Spiroplasma citri et construction d'un vecteur de clonage fonctionnel chez les Spiroplasmes." Bordeaux 2, 1989. http://www.theses.fr/1989BOR22002.

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Abstract:

Electrophorese bidimensionnelle des proteines de s. Citri dans laquelle proteines membranaires et cytoplasmiques sont differenciees, caracterisation de fragments d'adn genomique et construction d'un vecteur permettant l'etude de l'expression de genes codant pour des proteines membranaires mutees in vitro

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QUANTIN, BEATRICE. "Partie i : clonage et caracterisation d'une metalloprotease de la famille collagenase. partie ii: l'adenovirus, vecteur d'expression dans les cellules musculaires." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1991. http://www.theses.fr/1991STR13170.

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Abstract:

Partie 1: le processus de metastase implique une degradation enzymatique de la matrice extracellulaire. Il est bien etabli maintenant que les metalloproteases, comme la collagenase et la stromelysine jouent un role dans ce processus. Nous avons identifie et clone des adnc correspondant a deux nouveaux genes humains; leur sequence presente une homologie avec celle de la collagenase. Nous avons dirige l'expression du produit de l'un de ces genes (pump-1) dans des cellules eucaryotes a partir de son adnc. Nous avons caracterise ses inhibiteurs et ses substrats, et nous les avons compares a ceux de la stromelysine. Nos resultats permettent de classer pump-1 par les metalloproteases. Partie 2: la myopathie de duchenne est une maladie neuromusculaire incurable; le gene implique dans cette maladie est maintenant clone. Nous avons utilise l'adenovirus pour effectuer un transfert de gene dans les cellules musculaires. Apres construction d'un adenovirus recombinant contenant le gene codant pour la beta galactosidase sous le controle d'un promoteur musculaire, nous avons obtenu une expression de la beta galactosidase lors de l'infection de myotubes derives de lignees cellulaires myogeniques murines, et de muscles de souris. Nous avons reconstitue l'adnc codant pour une minidystrophine decrite dans la famille d'un patient atteint d'une forme peu severe de myopathie, et nous l'avons place sous le controle du promoteur musculaire qui s'est revele efficace in vitro et in vivo dans nos experiences precedentes, en vue d'une insertion dans le vecteur viral

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WATRIN, LAURENT. "Developpement d'un marqueur genetique de selection chez un archaeon hyperthermophile pyrococcus abyssi, premiere etape vers la mise au point d'un vecteur de clonage." Paris 6, 1996. http://www.theses.fr/1996PA066722.

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Abstract:

Ces dernieres annees, les archaea hyperthermophiles (thermococcales) ont ete plus particulierement etudiees pour leurs enzymes thermostables. Cependant, les etudes genetiques de ces microorganismes sont limitees par le manque d'outils genetiques (marqueurs de selection, systeme de transformation, vecteurs de clonage) fonctionnant a hautes temperatures. La decouverte d'un plasmide cryptique (pgt5) de la souche isolee recemment d'une source hydrothermale profonde, pyrococcus abyssi, a permis d'entreprendre des recherches visant a developper un systeme de transformation et a construire un vecteur de clonage. Notre contribution dans ce projet, a consiste tout d'abord a mettre au point un milieu minimum permettant une croissance de p. Abyssi avec des rendements et des taux de croissance similaires a ceux obtenus sur milieu riche. Ce milieu est compose de 9 acides amines : histidine, threonine, arginine, tyrosine, methionine, valine, phenylalanine, isoleucine et leucine. Des cmi de 14 antibiotiques ont egalement ete determinees pour p. Abyssi, des souches proches et differentes thermococcales. De bonnes thermostabilites et de basses frequences de mutation spontanee ont permis de selectionner l'acide fusidique et la puromycine comme les antibiotiques les plus prometteurs dans la recherche de marqueurs de selection chez les thermococcales. De plus, meme si des mutants de resistance a la puromycine ont pu etre isoles, la recherche de mutants auxotrophes pour l'uracil s'est averee la plus prometteuse, l'auxotrophie etant liee a la resistance a l'acide 5-fluoroorotique (5-foa). Apres mutation spontanee, et/ou mutagenese aux uv ou a l'ethylmethanesulfonate (ems), 9 mutants stables de p. Abyssi ont ete isoles et leur auxotrophie a ete confirmee. Des mesures enzymatiques ont montre que ces mutations se situaient dans les genes pyre et/ou pyrf, successivement impliques dans la voie de biosynthese des pyrimidines. Des experiences de complementation d'un mutant e. Coli (pyre-) avec une banque genomique de p. Abyssi, nous ont permis de cloner et de sequencer un fragment de 965pb possedant une origine de replication majeure de 165 codons correspondant au gene pyre de p. Abyssi. Ce gene pourrait representer un marqueur de selection potentiel utile tout d'abord dans l'elaboration d'un systeme de transformation, puis dans la construction d'un vecteur de clonage base sur pgt5.

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LABARRE, JEAN. "Etude genetique de la cyanobacterie synechocyctis pcc 6803 : recherche de mutantssurproducteurs d'acides amines et developpement d'un vecteur de clonage integratif dans le chromosome." Paris 6, 1989. http://www.theses.fr/1989PA066281.

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Abstract:

Ce travail concerne l'etude genetique de la cyanobacterie synechocystis pcc 6803, souche transformable et radioresistante qui a ete choisie au laboratoire pour produire des molecules marquees au #1#4c par voie biologique. Dans un premier temps, la recherche de mutants resistant aux analogues toxiques d'acides amines a permis l'obtention: (1) de mutants surproducteurs et excreteurs d'acides amines dont certains (les mutants resistants a la p-fluorophenylalanine) produisent des quantites importantes de phenylalanine. (2) de mutants deficients dans le transport des acides amines dont l'analyse a permis une premiere caracterisation du transport actif es acides amines chez les cyanobacteries. Dans un deuxieme temps, l'etude de la transformation chez cet organisme confirme que l'adn etranger s'integre dans le genome de l'hote par recombinaison homologue de type conversion genique (ou double crossing-over). Ce mecanisme est aussi a la base d'un procede de transformation mutagene qui permet d'integrer des genes de resistance aux antibiotiques au hasard dans le genome de pcc 6803. L'adn d'un des transformants a ete utilise pour developper un vecteur dirigeant l'integration de genes en un site defini du chromosome. D'un point de vue pratique, ces resultats permettent d'envisager plusieurs applications en ce qui concerne le marquage de molecules au #1#4c par voie biologique: (1) produire de la phenylalanine recuperable dans le milieu de cultgure. (2) cloner un gene etranger (codant pour une hormone polypeptidique par exemple) dans le chromosome de pcc 6803 en utilisant le vecteur d'integration mentionne plus haut

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Dissertations / Theses on the topic 'Vecteurs de clonage'

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