Academic literature on the topic 'Vecteurs rétroviraux'

Le travail rapporte dans ce memoire concerne la mise au point d'un nouveau systeme de production de vecteurs retroviraux a partir de vecteurs herpetiques de type amplicon. Pour ceci, une unite de transcription retrovirale, contenant les genes gag, pol et env de momlv sous le controle de sequences activatrice, promotrice et de polyadenylation herpetiques, a ete construite. Cette unite, deletee des deux ltrs, des sites pbs et ppt ainsi que du signal d'encapsidation, mais conservant les sites accepteur et donneur d'epissage, a ete clonee dans un plasmide vecteur herpetique de type amplicon. Des amplicons vecteurs (ou vecteurs gpe) ont ete produits en utilisant un virus auxiliaire hsv-1 defectif, sur des cellules transcomplementantes. La population virale heterogene, constituee de vecteurs gpe et de virus hsv-1 auxiliaires, a ete utilisee pour infecter des cellules te, contenant un provirus integre porteur du gene lacz, (les cellules te-lac2), et le surnageant de ces cellules infectees a ete preleve et filtre a differents temps post-infection. Ces surnageants contiennent des particules retrovirales lacz ecotropes, capables de transduire une activite -galactosidase dans des cellules murines nih3t3, mais non dans des cellules humaines te671. L'arn viral de ces vecteurs a ete detecte et caracterise par rt-pcr. Le titre de vecteurs retroviraux produits apres infection des cellules te-lac2 par les amplicons gpe augmente avec la quantite d'amplicons utilises. La production de vecteurs retroviraux est fortement inhibee par une surinfection des cellules te-lac2 avec le virus hsv-1 auxiliaire, indiquant que la co-infection par le virus auxiliaire perturbe la production de vecteurs retroviraux induite par les amplicons gpe. Les particules retrovirales semblent donc etre produites seulement dans les cellules te-lac2 qui recoivent uniquement l'amplicon gpe. L'induction de la production de vecteurs retroviraux par les amplicons gpe est neutralisee par des anticorps anti-hsv-1 mais pas par des anticorps anti-momlv. La transduction de l'activite -galactosidase par le surnageant des cellules te-lac2 infectees par les vecteurs gpe est, quant a elle, neutralisee par les anticorps anti-momlv. Ces resultats montrent qu'un vecteur de type amplicon, porteur de l'unite retrovirale gpe, peut permettre la production de maniere transitoire de vecteurs retroviraux. Une des applications possible de ce nouveau systeme de production serait d'utiliser ces amplicons gpe afin de remobiliser un genome vecteur retroviral integre dans une cellule, aussi bien in vivo qu'in vitro

Le travail realise porte sur l'utilisation de vecteurs retroviraux derives du virus de l'erythroblastose aviaire (aev). Ce retrovirus transduit deux oncogenes v-erba et v-erbb. Des vecteurs ont ete construits dans lesquels v-erba est remplace par un gene neo de resistance au g418 et v-erbb est remplace par un gene hygro de resistance a l'hygromycine. Ces vecteurs expriment le gene neo a partir du promoteur viral. Le gene hygro est controle par un promoteur heterologue et utilise un signal interne de polyadenylation. La capacite des vecteurs retroviraux a transduire les genes a ete analysee. Les structures etudiees conferent une seule resistance, celle pour laquelle la cellule a ete selectionnee apres l'infection. Les structures provirales sont caracterisees par la deletion du gene de resistance non selectionne. Deux mecanismes moleculaires distincts sont a l'origine des deletions: 1) des recombinaisons, pendant la retro-transcription dans les cellules cibles, qui engendrent la perte du gene hygro; 2) une encapsidation d'un arn sous-genomique anormal dans la lignee productrice, qui est responsable de la perte du gene neo. Dans un autre vecteur, une sequence de 88 pb contenant le signal d'integration du virus aev (appele att2) a ete inseree en amont du promoteur interne. La presence de att2 permet de transduire le gene hygro 100 fois plus efficacement. Le sequencage des jonctions entre l'adn cellulaire et l'adn proviral demontre que la sequence att2 est utilisee lors de l'integration dans le genome cellulaire

Les retrovirus permettent la mise au point de vecteurs de transfert de genes efficaces, en substituant leurs genes par ceux que l'on veut faire vehiculer. Les structures retrovirales recombinantes qui en resultent sont alors defectives. Pour obtenir sous forme de particules virales vecteur ces structures recombinantes, il est imperatif d'elaborer des cellules dites transcomplementantes qui assurent la formation des seules particules virales vecteurs, ce qui conduit a un stock viral defectif qui ne peut alors perpetuer l'etat de viroproduction. Une premiere partie du travail presente dans ce memoire s'inscrit dans le cadre de l'amelioration des deux composantes du systeme de transfert: les vecteurs retroviraux, et les cellules transcomplementantes, a partir des virus de leucose aviaire (alsv), et en particulier des retrovirus rav-1 (rous associated virus) et aev (avian erythroblastosis virus). Nos resultats montrent qu'il est possible de constuire et de caracteriser des vecteurs retroviraux dont on peut obtenir des titres superieurs a 10#5 particules infectieuses par ml, egalement grace a l'amelioration de vecteurs permettant l'elaboration de cellules transcomplementantes. Une des ameliorations apportees sur les vecteurs retroviraux, consiste a definir parmi plusieurs retrovirus, quelles sont les regions les plus actives agissant en cis sur l'expression. Une des ameliorations apportees sur les constructions transcomplementantes est representee par l'insertion de genes de selection sur les genomes recombinants construits, et l'apport dans une cellule, des genes viraux gag, pol, env selon deux constructions distinctes. Une deuxieme partie du travail presente dans ce memoire porte sur une des possibilites d'utilisation du systeme de transfert de genes developpe, chez l'animal, a des fins de vaccinations, soit contre la leucose aviaire induite par les retrovirus, soit contre la maladie de newcastle indu

Les vecteurs rétroviraux défectifs pour la réplication (RDR) dérivés des oncorétrovirus murin ont marqué l’histoire du fait de leur utilisation pour les premières thérapies géniques réussies. Malgré cela, ces vecteurs présentent deux désavantages majeurs : une efficacité de transfert de gène in vivo insuffisante et une mutagénicité insertionnelle. Notre travail a consisté à surmonter ces problèmes lors de la génération de vecteurs destinés à des applications dans les domaines du cancer et des maladies infectieuses. Ceci nous a amené à concevoir, réaliser et évaluer deux types de vecteurs ayant des caractéristiques opposées : (i) des vecteurs rétroviraux compétent pour la réplication (RCR) et (ii) des pseudo-particules rétrovirales (VLP) dépourvues de génome. Notre travail illustre la versatilité des vecteurs rétroviraux, qui permet des designs novateurs et en font des acteurs majeurs de la thérapie génique et des vaccins génétiques
Replication defective retroviral (RDR) vectors based on murine oncoretroviruses marked history by being the gene transfer vectors used in the first successful gene therapies. Despite this achievement, they have two major drawbacks: insufficient efficacy for in vivo gene transfer and insertional mutagenesis. During the course of the work presented here, we attempted to overcome these problems while making vectors useful for two different indications; cancer and infectious disease. This led to the conceptualization, realization and evaluation of two retroviral vector designs of principally opposite character; (i) replication competent retroviral (RCR) vectors transducing largely complete genomes and (ii) genome free virus-like particle (VLP) vectors. Our work illustrates that the versatility of retroviral vectors, which permits inventive designs, make them major actors in gene therapy and genetic vaccines

Les vecteurs retroviraux offrent des possibilites d'utilisation en recherches fondamentale et appliquee. Dans le cadre d'un transfert de genes in vivo, les stocks vecteurs viraux doivent presenter un titre eleve en particules et ne pas contenir de forme virale parasite. De plus ces vecteurs une fois integres ne doivent pas pouvoir ressortir de la cellule dans laquelle ils ont ete introduits. Il faut donc pouvoir perdre au cours de la replication du genome retroviral un element necessaire a la production du stock viral mais inutile par la suite dans la cellule cible. Il est rapporte que de petites structures secondaires peuvent etre deletees lors de la transcription inverse. Nous avons utilise cette propriete afin de deleter la sequence d'encaspidation suite a son introduction entre une sequence sens-antisens pouvant former une structure secondaire. Il a fallu etudier les effets d'une sequence antisens dans un vecteur retroviral depuis les cellules productrices en passant par l'encapsidation, et jusqu'au provirus integre. Cela a permis de mettre en evidence qu'une large sequence antisens (692nt) entrainait une instabilite des arnm vecteurs dans les cellules productrices suite a l'action de desaminases cellulaires sur les structures secondaires. Les arnm vecteurs modifies par cette activite et encapsides, donnent naissance a des provirus comportant dans 100% des cas la deletion de la totalite, ou presque, des sequences pouvant former une structure secondaire sur l'arn viral ; toutefois, les residus de sequences sens-antisens entrant dans la structure secondaire presentent une modification nucleotidique caracterisee par la transition ag. Pour rendre moins instables les arnm vecteurs, la sequence antisens situee en 3' de la sequence d'encapsidation a ete reduite a 48nt dans le vecteur pfas22. La production de ce vecteur en condition helper free a permis de mettre en evidence une stabilite des arnm vecteurs et un taux de deletion des sequences sens-antisens encadrant la sequence d'encapsidation de 61%. Ces resultats permettent d'obtenir des donnees fondamentales sur la presence et le devenir de structures secondaires pouvant se former sur un arnm viral et des donnees pouvant etre mises a profit dans le but d'optimiser les vecteurs retroviraux pour des applications de therapie genique.

Les vecteurs rétroviraux dérivés du virus Moloney de la leucémie murine (MoMLV) ont été utilisés pour livrer des gènes depuis plus de 20 ans et ils continuent d’être le meilleur outil disponible pour transférer de façon stable et efficace des gènes thérapeutiques dans différents types de cellules. Bien que la plupart des études précliniques de thérapie génique utilisent des surnageants bruts ou concentrés de vecteurs rétroviraux, l’étape de purification, pour éliminer le sérum et les impuretés dérivées des cellules hôtes contenus dans ces préparations, est incontournable pour les applications cliniques. Cette thèse décrit le développement de stratégies de purification des vecteurs rétroviraux. Au cours de ce projet, deux procédés complets de purification (à partir d’un surnageant brut de rétrovirus jusqu’au virus de grade clinique) ont été établis, vérifiés, et leurs performances ont été analysées en détail. La filtration sur membrane a contribuée à la clarification, la concentration, à l’échange de tampon et à la purification partielle des particules retrovirales à partir de surnageants à l’état brut sans aucune perte significative d’infectivité virale. Deux nouvelles méthodes de purification, spécifiquement adaptées aux caractéristiques biochimiques et physiques des particules rétrovirales, ont été développées. La première méthode de purification des particules rétrovirales, utilise la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine suivie d’un tamis moléculaire. L’avantage principal d’utiliser les techniques de chromatographie pour la purification des virus, est d’offrir la possibilité de purifier à grande échelle les rétrovirus de façon sélective et efficace. De plus, la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine a donné lieu à des taux de récupération exceptionnels de particules infectieuses et s’est avérée utile pour la purification des vecteurs rétroviraux produits par différentes lignées cellulaires indépendamment de l’enveloppe protéique utilisée pour le pseudo-typage. La deuxième méthode de purification est basée sur la technique de centrifugation zonale transitoire utilisant l’iodixanol comme milieu pour former un gradient. La force de cette technique repose sur les hauts niveaux de pureté obtenus en une seule étape de purification et la capacité à séparer les particules virales des espèces proches telles que les vecteurs défectueux et / ou les vésicules membranaires, qui posent un sérieux défi dans les procédés de purification. Les récupérations finales en particules infectieuses (~38%) et le degré de pureté atteint (plus de 95%) étaient comparables avec l’une ou l’autre des stratégies de purification utilisées. Les méthodes décrites dans cette thèse représentent une amélioration significative sur la méthodologie conventionnelle utilisant un gradient de densité de sucrose pour la purification des rétrovirus et contribuera certainement à l’avancement technologique dans le domaine de la thérapie génique.
Retroviral vectors derived from the Moloney murine leukemia virus (MoMLV) have been used as gene delivery vehicles for more than two decades and continue to be the best available tool for stable and efficient transfer of therapeutic genes into various cell types. Although most gene therapy preclinical studies use crude or concentrated retroviral vector supernatants, purification to eliminate serum and host-derived impurities contained in these stocks is a must for clinical applications. This thesis describes the development of downstream processing strategies for retroviral vectors. During the course of this project, two complete multi-step purification schemes (from crude retrovirus supernatant to clinical-grade virus) were designed, tested and their performance analyzed in detail. Membrane filtration contributed to the clarification, concentration, buffer exchange and partial purification of retroviral particles from crude supernatants with essentially no loss in vector infectivity. Two novel purification methods specifically tailored to the biochemical and physical features of retroviral particles were developed. The first method consists of the chromatographic purification of retroviral particles by heparin affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. The main advantage of employing chromatography technology for virus purification is that it offers the possibility to selectively and efficiently purify retroviruses on a large-scale. Moreover, heparin affinity chromatography resulted in exceptional recoveries of infective particles and proved to be useful for the purification of retroviral vectors produced by different packaging cell lines independently of the Env-protein used for pseudotyping. The second purification method is based on a rate zonal centrifugation technique using iodixanol as gradient medium. The power of this technique was revealed by the high levels of purity achieved in a single purification step and its potential to separate viral particles from closely-related species such as defective vector forms and/or cell membrane vesicles, all of which pose a serious challenge in downstream processing. The overall yield of infective particles (~38%) and level of purity achieved (over 95%) using either purification strategy was comparable. The methods described in this thesis represent a significant improvement over the conventional sucrose density gradient methodology used for retrovirus purification and will hopefully contribute to the technological progress in the field of gene therapy.

Le laboratoire a developpe, a partir de retrovirus aviaires de type alsv, des lignees transcomplementantes productrices de particules vecteurs en condition helper-free. Nous avons ici recherche a augmenter le titre en particules produites par ces lignees transcomplementantes et analyse les formes virales recombinantes generees par ces systemes. L'introduction du genome vecteur dans la lignee d'empaquetage par infection plutot que par transfection a permis d'accroitre les titres des stocks de vecteurs retroviraux a des valeurs de 10#6 efu-(expressing forming unit)/ml. En revanche, le systeme ping-pong decrit pour les vecteurs retroviraux murins n'a pas permis d'obtenir l'amplification escomptee des titres en virus vecteurs. En outre, dans de telles cocultures, il apparait un virus competent pour la replication, qui porte les fonctions trans des genomes transcomplementants et les fonctions cis du genome vecteur. Les genomes transcomplementants sont deletes de la sequence d'encapsidation et de sequences necessaires a la transcription inverse et l'integration. Cependant, des arn transcrits a partir de ces genomes peuvent etre encapsides, retrotranscrits et s'integrer dans l'adn de la cellule cible. Ce transfert parasite, de l'ordre de 1 particule pour 10#5 particules vecteurs, peut etre explique par des evenements de recombinaison retrovirale entre le genome transcomplementant et le genome vecteur coencapsides. Ces formes virales parasites defectives pour la replication pourraient conduire, apres plusieurs cycles de replication successifs, a l'emergence de formes virales completes, comme celles observees dans le surnageant des cocultures decrites ci-dessus. Le genome des cellules de poule contient des sequences dites endogenes dont la structure est proche de celle des retrovirus. Lorsque les cellules lmh de leghorn noire sont utilisees pour la construction de lignees transcomplementantes, la presence de l'endogene ev3 conduit a la generation de formes virales parasites defectives pour la replication. Celles-ci representent 1% des particules virales produites. Ces resultats permettent d'obtenir une meilleure connaissance des systemes de production de vecteurs retroviraux

Les vecteurs retroviraux recombinants constituent a l'heure actuelle, un des outils les plus performants pour le transfert de genes dans les cellules non quiescentes. Dans une perspective de maitrise de l'infection retrovirale, nous nous sommes proposes, d'une part, d'effectuer une etude theorique et fonctionnelle des glycoproteines d'enveloppe retrovirales aviaires, qui regissent la specificite d'infection, et d'autre part, de modifier la specificite d'infection de vecteurs retroviraux aviaires par insection de ligands dans les glycoproteines d'enveloppe. Les etudes theoriques et fonctionnelles des glycoproteines d'enveloppe retrovirales ont permis l'identification de quatre regions du domaine de reconnaissance (appelees 1, 2, 3 et 4) peu conservees et structurees, particulierement flexibles, accessibles et hydrophiles, potentiellement favorables a l'insertion de ligands. Les resultats obtenus mettent en evidence que l'insertion d'un peptide de 16 acides amines (correspondant a un ligand des integrines) en position 2 du gene d'enveloppe permet la production de particules virales recombinantes aviaires ayant conserve leur tropisme initial aviaire, mais qui acquierent la capacite d'infecter specifiquement des cellules mammiferes grace a l'utilisation du nouveau recepteur

Le role de trois proteines soupconnees intervenir dans le controle de la differenciation erythrocytique aviaire a ete etudie par le transfert de leur sequences codantes dans les cellules qui ne les expriment pas initialement. Pour cela, nous avons construit un nouveau vecteur retroviral capable de promouvoir le transfert et l'expression stable, elevee et eventuellement regulable, d'unites genetiques completes. L'originalite de ce vecteur, appele autoinactivable, reside dans la formation d'une deletion inhibant la transcription virale dans les cellules cibles du transfert. Le transfert et l'expression de l'histone h5 dans des fibroblastes en culture a permis de montrer que cette proteine provoque la condensation de la chromatine et consecutivement bloque la proliferation cellulaire. Nous avons de plus montre que cette fonction est inhibee par la phosphorylation de la proteine. Les deux autres proteines etudiees sont: l'anhydrase carbonique ii, dont l'expression dans les precurseurs erythrocytiques est induite par l'hormone thyroidienne t3, et un des recepteur de t3, c-erba. Nous suggerons un role pour ces proteines dans l'inhibition de la proliferation cellulaire. Enfin, nous avons construit diverses chimeres entre c-erba et son derive oncogenique v-erba et montre par le transfert et l'expression de ces sequences dans des fibroblastes, que les mutations de v-erba qui rendent la proteine incapable de fixer l'hormone t3, sont suffisantes pour expliquer la derive oncogenique, et l'activite transformante de v-erba