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Dissertations / Theses on the topic 'Vecteurs rétroviraux'
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Savard, Nathalie. "Production de vecteurs rétroviraux à l'aide de vecteurs herpétiques de type amplicon." Lyon 1, 1996. http://www.theses.fr/1996LYO10299.
Full textAbstract:
Le travail rapporte dans ce memoire concerne la mise au point d'un nouveau systeme de production de vecteurs retroviraux a partir de vecteurs herpetiques de type amplicon. Pour ceci, une unite de transcription retrovirale, contenant les genes gag, pol et env de momlv sous le controle de sequences activatrice, promotrice et de polyadenylation herpetiques, a ete construite. Cette unite, deletee des deux ltrs, des sites pbs et ppt ainsi que du signal d'encapsidation, mais conservant les sites accepteur et donneur d'epissage, a ete clonee dans un plasmide vecteur herpetique de type amplicon. Des amplicons vecteurs (ou vecteurs gpe) ont ete produits en utilisant un virus auxiliaire hsv-1 defectif, sur des cellules transcomplementantes. La population virale heterogene, constituee de vecteurs gpe et de virus hsv-1 auxiliaires, a ete utilisee pour infecter des cellules te, contenant un provirus integre porteur du gene lacz, (les cellules te-lac2), et le surnageant de ces cellules infectees a ete preleve et filtre a differents temps post-infection. Ces surnageants contiennent des particules retrovirales lacz ecotropes, capables de transduire une activite -galactosidase dans des cellules murines nih3t3, mais non dans des cellules humaines te671. L'arn viral de ces vecteurs a ete detecte et caracterise par rt-pcr. Le titre de vecteurs retroviraux produits apres infection des cellules te-lac2 par les amplicons gpe augmente avec la quantite d'amplicons utilises. La production de vecteurs retroviraux est fortement inhibee par une surinfection des cellules te-lac2 avec le virus hsv-1 auxiliaire, indiquant que la co-infection par le virus auxiliaire perturbe la production de vecteurs retroviraux induite par les amplicons gpe. Les particules retrovirales semblent donc etre produites seulement dans les cellules te-lac2 qui recoivent uniquement l'amplicon gpe. L'induction de la production de vecteurs retroviraux par les amplicons gpe est neutralisee par des anticorps anti-hsv-1 mais pas par des anticorps anti-momlv. La transduction de l'activite -galactosidase par le surnageant des cellules te-lac2 infectees par les vecteurs gpe est, quant a elle, neutralisee par les anticorps anti-momlv. Ces resultats montrent qu'un vecteur de type amplicon, porteur de l'unite retrovirale gpe, peut permettre la production de maniere transitoire de vecteurs retroviraux. Une des applications possible de ce nouveau systeme de production serait d'utiliser ces amplicons gpe afin de remobiliser un genome vecteur retroviral integre dans une cellule, aussi bien in vivo qu'in vitro
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Drynda, Antoine. "Construction et analyse de vecteurs rétroviraux pour l'étude de l'intégration rétrovirale et le transfert de gènes." Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO10042.
Full textAbstract:
Le travail realise porte sur l'utilisation de vecteurs retroviraux derives du virus de l'erythroblastose aviaire (aev). Ce retrovirus transduit deux oncogenes v-erba et v-erbb. Des vecteurs ont ete construits dans lesquels v-erba est remplace par un gene neo de resistance au g418 et v-erbb est remplace par un gene hygro de resistance a l'hygromycine. Ces vecteurs expriment le gene neo a partir du promoteur viral. Le gene hygro est controle par un promoteur heterologue et utilise un signal interne de polyadenylation. La capacite des vecteurs retroviraux a transduire les genes a ete analysee. Les structures etudiees conferent une seule resistance, celle pour laquelle la cellule a ete selectionnee apres l'infection. Les structures provirales sont caracterisees par la deletion du gene de resistance non selectionne. Deux mecanismes moleculaires distincts sont a l'origine des deletions: 1) des recombinaisons, pendant la retro-transcription dans les cellules cibles, qui engendrent la perte du gene hygro; 2) une encapsidation d'un arn sous-genomique anormal dans la lignee productrice, qui est responsable de la perte du gene neo. Dans un autre vecteur, une sequence de 88 pb contenant le signal d'integration du virus aev (appele att2) a ete inseree en amont du promoteur interne. La presence de att2 permet de transduire le gene hygro 100 fois plus efficacement. Le sequencage des jonctions entre l'adn cellulaire et l'adn proviral demontre que la sequence att2 est utilisee lors de l'integration dans le genome cellulaire
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Cosset, François-Loïc. "Tranfert de gènes par des vecteurs rétroviraux aviaires : élaboration de lignées cellulaires transcomplémentantes aviaires, mise au point d'un nouveau procédé de vaccination utilisation des vecteurs rétroviraux." Lyon 1, 1990. http://www.theses.fr/1990LYO10102.
Full textAbstract:
Les retrovirus permettent la mise au point de vecteurs de transfert de genes efficaces, en substituant leurs genes par ceux que l'on veut faire vehiculer. Les structures retrovirales recombinantes qui en resultent sont alors defectives. Pour obtenir sous forme de particules virales vecteur ces structures recombinantes, il est imperatif d'elaborer des cellules dites transcomplementantes qui assurent la formation des seules particules virales vecteurs, ce qui conduit a un stock viral defectif qui ne peut alors perpetuer l'etat de viroproduction. Une premiere partie du travail presente dans ce memoire s'inscrit dans le cadre de l'amelioration des deux composantes du systeme de transfert: les vecteurs retroviraux, et les cellules transcomplementantes, a partir des virus de leucose aviaire (alsv), et en particulier des retrovirus rav-1 (rous associated virus) et aev (avian erythroblastosis virus). Nos resultats montrent qu'il est possible de constuire et de caracteriser des vecteurs retroviraux dont on peut obtenir des titres superieurs a 10#5 particules infectieuses par ml, egalement grace a l'amelioration de vecteurs permettant l'elaboration de cellules transcomplementantes. Une des ameliorations apportees sur les vecteurs retroviraux, consiste a definir parmi plusieurs retrovirus, quelles sont les regions les plus actives agissant en cis sur l'expression. Une des ameliorations apportees sur les constructions transcomplementantes est representee par l'insertion de genes de selection sur les genomes recombinants construits, et l'apport dans une cellule, des genes viraux gag, pol, env selon deux constructions distinctes. Une deuxieme partie du travail presente dans ce memoire porte sur une des possibilites d'utilisation du systeme de transfert de genes developpe, chez l'animal, a des fins de vaccinations, soit contre la leucose aviaire induite par les retrovirus, soit contre la maladie de newcastle indu
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Dalba, Charlotte. "Nouveaux vecteurs rétroviraux pour l'immunothérapie des cancers et des infections virales." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066604.
Full textAbstract:
Les vecteurs rétroviraux défectifs pour la réplication (RDR) dérivés des oncorétrovirus murin ont marqué l’histoire du fait de leur utilisation pour les premières thérapies géniques réussies. Malgré cela, ces vecteurs présentent deux désavantages majeurs : une efficacité de transfert de gène in vivo insuffisante et une mutagénicité insertionnelle. Notre travail a consisté à surmonter ces problèmes lors de la génération de vecteurs destinés à des applications dans les domaines du cancer et des maladies infectieuses. Ceci nous a amené à concevoir, réaliser et évaluer deux types de vecteurs ayant des caractéristiques opposées : (i) des vecteurs rétroviraux compétent pour la réplication (RCR) et (ii) des pseudo-particules rétrovirales (VLP) dépourvues de génome. Notre travail illustre la versatilité des vecteurs rétroviraux, qui permet des designs novateurs et en font des acteurs majeurs de la thérapie génique et des vaccins génétiquesReplication defective retroviral (RDR) vectors based on murine oncoretroviruses marked history by being the gene transfer vectors used in the first successful gene therapies. Despite this achievement, they have two major drawbacks: insufficient efficacy for in vivo gene transfer and insertional mutagenesis. During the course of the work presented here, we attempted to overcome these problems while making vectors useful for two different indications; cancer and infectious disease. This led to the conceptualization, realization and evaluation of two retroviral vector designs of principally opposite character; (i) replication competent retroviral (RCR) vectors transducing largely complete genomes and (ii) genome free virus-like particle (VLP) vectors. Our work illustrates that the versatility of retroviral vectors, which permits inventive designs, make them major actors in gene therapy and genetic vaccines
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Faraut, Pascal. "Analyse d'événements de recombinaisons induits par la création d'une structure secondaire sur un ARN rétroviral et applications pour l'élaboration de vecteurs rétroviraux." Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO10200.
Full textAbstract:
Les vecteurs retroviraux offrent des possibilites d'utilisation en recherches fondamentale et appliquee. Dans le cadre d'un transfert de genes in vivo, les stocks vecteurs viraux doivent presenter un titre eleve en particules et ne pas contenir de forme virale parasite. De plus ces vecteurs une fois integres ne doivent pas pouvoir ressortir de la cellule dans laquelle ils ont ete introduits. Il faut donc pouvoir perdre au cours de la replication du genome retroviral un element necessaire a la production du stock viral mais inutile par la suite dans la cellule cible. Il est rapporte que de petites structures secondaires peuvent etre deletees lors de la transcription inverse. Nous avons utilise cette propriete afin de deleter la sequence d'encaspidation suite a son introduction entre une sequence sens-antisens pouvant former une structure secondaire. Il a fallu etudier les effets d'une sequence antisens dans un vecteur retroviral depuis les cellules productrices en passant par l'encapsidation, et jusqu'au provirus integre. Cela a permis de mettre en evidence qu'une large sequence antisens (692nt) entrainait une instabilite des arnm vecteurs dans les cellules productrices suite a l'action de desaminases cellulaires sur les structures secondaires. Les arnm vecteurs modifies par cette activite et encapsides, donnent naissance a des provirus comportant dans 100% des cas la deletion de la totalite, ou presque, des sequences pouvant former une structure secondaire sur l'arn viral ; toutefois, les residus de sequences sens-antisens entrant dans la structure secondaire presentent une modification nucleotidique caracterisee par la transition ag. Pour rendre moins instables les arnm vecteurs, la sequence antisens situee en 3' de la sequence d'encapsidation a ete reduite a 48nt dans le vecteur pfas22. La production de ce vecteur en condition helper free a permis de mettre en evidence une stabilite des arnm vecteurs et un taux de deletion des sequences sens-antisens encadrant la sequence d'encapsidation de 61%. Ces resultats permettent d'obtenir des donnees fondamentales sur la presence et le devenir de structures secondaires pouvant se former sur un arnm viral et des donnees pouvant etre mises a profit dans le but d'optimiser les vecteurs retroviraux pour des applications de therapie genique.
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Ghani, Karim. "Développement d'une lignée cellulaire pour la production à grande échelle de vecteurs rétroviraux." Thesis, Université Laval, 2010. http://www.theses.ulaval.ca/2010/28046/28046.pdf.
Full text
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Mercèdes, Segura Maria de las. "Downstream processing of recombinant retroviral vectors." Doctoral thesis, Université Laval, 2006. http://hdl.handle.net/20.500.11794/18860.
Full textAbstract:
Les vecteurs rétroviraux dérivés du virus Moloney de la leucémie murine (MoMLV) ont été utilisés pour livrer des gènes depuis plus de 20 ans et ils continuent d’être le meilleur outil disponible pour transférer de façon stable et efficace des gènes thérapeutiques dans différents types de cellules. Bien que la plupart des études précliniques de thérapie génique utilisent des surnageants bruts ou concentrés de vecteurs rétroviraux, l’étape de purification, pour éliminer le sérum et les impuretés dérivées des cellules hôtes contenus dans ces préparations, est incontournable pour les applications cliniques. Cette thèse décrit le développement de stratégies de purification des vecteurs rétroviraux. Au cours de ce projet, deux procédés complets de purification (à partir d’un surnageant brut de rétrovirus jusqu’au virus de grade clinique) ont été établis, vérifiés, et leurs performances ont été analysées en détail. La filtration sur membrane a contribuée à la clarification, la concentration, à l’échange de tampon et à la purification partielle des particules retrovirales à partir de surnageants à l’état brut sans aucune perte significative d’infectivité virale. Deux nouvelles méthodes de purification, spécifiquement adaptées aux caractéristiques biochimiques et physiques des particules rétrovirales, ont été développées. La première méthode de purification des particules rétrovirales, utilise la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine suivie d’un tamis moléculaire. L’avantage principal d’utiliser les techniques de chromatographie pour la purification des virus, est d’offrir la possibilité de purifier à grande échelle les rétrovirus de façon sélective et efficace. De plus, la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine a donné lieu à des taux de récupération exceptionnels de particules infectieuses et s’est avérée utile pour la purification des vecteurs rétroviraux produits par différentes lignées cellulaires indépendamment de l’enveloppe protéique utilisée pour le pseudo-typage. La deuxième méthode de purification est basée sur la technique de centrifugation zonale transitoire utilisant l’iodixanol comme milieu pour former un gradient. La force de cette technique repose sur les hauts niveaux de pureté obtenus en une seule étape de purification et la capacité à séparer les particules virales des espèces proches telles que les vecteurs défectueux et / ou les vésicules membranaires, qui posent un sérieux défi dans les procédés de purification. Les récupérations finales en particules infectieuses (~38%) et le degré de pureté atteint (plus de 95%) étaient comparables avec l’une ou l’autre des stratégies de purification utilisées. Les méthodes décrites dans cette thèse représentent une amélioration significative sur la méthodologie conventionnelle utilisant un gradient de densité de sucrose pour la purification des rétrovirus et contribuera certainement à l’avancement technologique dans le domaine de la thérapie génique.Retroviral vectors derived from the Moloney murine leukemia virus (MoMLV) have been used as gene delivery vehicles for more than two decades and continue to be the best available tool for stable and efficient transfer of therapeutic genes into various cell types. Although most gene therapy preclinical studies use crude or concentrated retroviral vector supernatants, purification to eliminate serum and host-derived impurities contained in these stocks is a must for clinical applications. This thesis describes the development of downstream processing strategies for retroviral vectors. During the course of this project, two complete multi-step purification schemes (from crude retrovirus supernatant to clinical-grade virus) were designed, tested and their performance analyzed in detail. Membrane filtration contributed to the clarification, concentration, buffer exchange and partial purification of retroviral particles from crude supernatants with essentially no loss in vector infectivity. Two novel purification methods specifically tailored to the biochemical and physical features of retroviral particles were developed. The first method consists of the chromatographic purification of retroviral particles by heparin affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. The main advantage of employing chromatography technology for virus purification is that it offers the possibility to selectively and efficiently purify retroviruses on a large-scale. Moreover, heparin affinity chromatography resulted in exceptional recoveries of infective particles and proved to be useful for the purification of retroviral vectors produced by different packaging cell lines independently of the Env-protein used for pseudotyping. The second purification method is based on a rate zonal centrifugation technique using iodixanol as gradient medium. The power of this technique was revealed by the high levels of purity achieved in a single purification step and its potential to separate viral particles from closely-related species such as defective vector forms and/or cell membrane vesicles, all of which pose a serious challenge in downstream processing. The overall yield of infective particles (~38%) and level of purity achieved (over 95%) using either purification strategy was comparable. The methods described in this thesis represent a significant improvement over the conventional sucrose density gradient methodology used for retrovirus purification and will hopefully contribute to the technological progress in the field of gene therapy.
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Girod, Anne. "Production de vecteurs rétroviraux par des lignées transcomplémentantes aviaires : augmentation du titre en vecteurs et analyse des formes virales parasites produites." Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO10312.
Full textAbstract:
Le laboratoire a developpe, a partir de retrovirus aviaires de type alsv, des lignees transcomplementantes productrices de particules vecteurs en condition helper-free. Nous avons ici recherche a augmenter le titre en particules produites par ces lignees transcomplementantes et analyse les formes virales recombinantes generees par ces systemes. L'introduction du genome vecteur dans la lignee d'empaquetage par infection plutot que par transfection a permis d'accroitre les titres des stocks de vecteurs retroviraux a des valeurs de 10#6 efu-(expressing forming unit)/ml. En revanche, le systeme ping-pong decrit pour les vecteurs retroviraux murins n'a pas permis d'obtenir l'amplification escomptee des titres en virus vecteurs. En outre, dans de telles cocultures, il apparait un virus competent pour la replication, qui porte les fonctions trans des genomes transcomplementants et les fonctions cis du genome vecteur. Les genomes transcomplementants sont deletes de la sequence d'encapsidation et de sequences necessaires a la transcription inverse et l'integration. Cependant, des arn transcrits a partir de ces genomes peuvent etre encapsides, retrotranscrits et s'integrer dans l'adn de la cellule cible. Ce transfert parasite, de l'ordre de 1 particule pour 10#5 particules vecteurs, peut etre explique par des evenements de recombinaison retrovirale entre le genome transcomplementant et le genome vecteur coencapsides. Ces formes virales parasites defectives pour la replication pourraient conduire, apres plusieurs cycles de replication successifs, a l'emergence de formes virales completes, comme celles observees dans le surnageant des cocultures decrites ci-dessus. Le genome des cellules de poule contient des sequences dites endogenes dont la structure est proche de celle des retrovirus. Lorsque les cellules lmh de leghorn noire sont utilisees pour la construction de lignees transcomplementantes, la presence de l'endogene ev3 conduit a la generation de formes virales parasites defectives pour la replication. Celles-ci representent 1% des particules virales produites. Ces resultats permettent d'obtenir une meilleure connaissance des systemes de production de vecteurs retroviraux
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Wittmann, Sandrine. "Etude des glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales aviaires et modification du tropisme d'infection de vecteurs rétroviraux aviaires." Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO10037.
Full textAbstract:
Les vecteurs retroviraux recombinants constituent a l'heure actuelle, un des outils les plus performants pour le transfert de genes dans les cellules non quiescentes. Dans une perspective de maitrise de l'infection retrovirale, nous nous sommes proposes, d'une part, d'effectuer une etude theorique et fonctionnelle des glycoproteines d'enveloppe retrovirales aviaires, qui regissent la specificite d'infection, et d'autre part, de modifier la specificite d'infection de vecteurs retroviraux aviaires par insection de ligands dans les glycoproteines d'enveloppe. Les etudes theoriques et fonctionnelles des glycoproteines d'enveloppe retrovirales ont permis l'identification de quatre regions du domaine de reconnaissance (appelees 1, 2, 3 et 4) peu conservees et structurees, particulierement flexibles, accessibles et hydrophiles, potentiellement favorables a l'insertion de ligands. Les resultats obtenus mettent en evidence que l'insertion d'un peptide de 16 acides amines (correspondant a un ligand des integrines) en position 2 du gene d'enveloppe permet la production de particules virales recombinantes aviaires ayant conserve leur tropisme initial aviaire, mais qui acquierent la capacite d'infecter specifiquement des cellules mammiferes grace a l'utilisation du nouveau recepteur
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Aubert, Denise. "Analyse moléculaire de la différenciation érythrocytique aviaire par transfert de gènes au moyen de vecteurs rétroviraux." Lyon 1, 1991. http://www.theses.fr/1991LYO10222.
Full textAbstract:
Le role de trois proteines soupconnees intervenir dans le controle de la differenciation erythrocytique aviaire a ete etudie par le transfert de leur sequences codantes dans les cellules qui ne les expriment pas initialement. Pour cela, nous avons construit un nouveau vecteur retroviral capable de promouvoir le transfert et l'expression stable, elevee et eventuellement regulable, d'unites genetiques completes. L'originalite de ce vecteur, appele autoinactivable, reside dans la formation d'une deletion inhibant la transcription virale dans les cellules cibles du transfert. Le transfert et l'expression de l'histone h5 dans des fibroblastes en culture a permis de montrer que cette proteine provoque la condensation de la chromatine et consecutivement bloque la proliferation cellulaire. Nous avons de plus montre que cette fonction est inhibee par la phosphorylation de la proteine. Les deux autres proteines etudiees sont: l'anhydrase carbonique ii, dont l'expression dans les precurseurs erythrocytiques est induite par l'hormone thyroidienne t3, et un des recepteur de t3, c-erba. Nous suggerons un role pour ces proteines dans l'inhibition de la proliferation cellulaire. Enfin, nous avons construit diverses chimeres entre c-erba et son derive oncogenique v-erba et montre par le transfert et l'expression de ces sequences dans des fibroblastes, que les mutations de v-erba qui rendent la proteine incapable de fixer l'hormone t3, sont suffisantes pour expliquer la derive oncogenique, et l'activite transformante de v-erba
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Moreau-Gaudry, François. "Transfert de gènes à l'aide de vecteurs rétroviraux : la porphyrie érythropoi͏̈étique congénitale, modèle de thérapie génique." Bordeaux 2, 1996. http://www.theses.fr/1996BOR28398.
Full text
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Olayat, Sophie. "Utilisation de vecteurs rétroviraux aviaires pour l'étude de l'implication de gènes dans la resistance des oiseaux aux maladies viro-induites." Tours, 1996. http://www.theses.fr/1996TOUR3309.
Full text
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Lopez-Lastra, Marcello. "Mise en évidence de sites d'entrée directe des ribosomes (IRES) chez les rétrovirus et développement de vecteurs rétroviraux polycistroniques MLV-IRES pour la transgénèse." Lyon 1, 1999. http://www.theses.fr/1999LYO1T206.
Full text
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Molina, Rosa-Maria. "Facteurs influençant l'expression de vecteurs rétroviraux dérivés des virus ALSV in vitro : rôle des pseudotypes rétroviraux sur la spécificité tissulaire du transfert de gènes intraembryonnaire chez les oiseaux." Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO10097.
Full textAbstract:
Les animaux transgeniques constituent actuellement un modele particulierement adapte pour de nombreuses etudes in vivo tant en recherche fondamentale qu'en recherche appliquee. Les vecteurs mis au point dans notre laboratoire pour transferer des genes exogenes chez les oiseaux sont derives des retrovirus aviaires alsv et produits en condition helper-free. Ils infectent les cellules permissives et l'information genetique qu'ils vehiculent s'integre efficacement dans le genome cellulaire. Cependant, l'expression stable et efficace des genes transferes depend de multiples facteurs. Ce travail a montre que les sequences regulatrices de la transcription et de la traduction originaires des virus rav-1 et rav-2 autorisent une expression stable et efficace du gene marqueur lacz, introduit par infection retrovirale dans la lignee cellulaire qt6. De plus, la nature et le niveau de la selection appliquee sur les cellules qt6 infectees revelent une grande variabilite de l'efficacite et la stabilite d'expression du gene marqueur transfere. Par ailleurs, l'emploi de stocks viraux portant un genome vecteur identique mais des enveloppes appartenant a des sous-groupes viraux differents, et de titre eleve, permet de cibler l'infection de certains organes in vivo. Cependant, le tropisme d'expression du gene lacz varie egalement en fonction du stade embryonnaire au cours duquel est effectuee l'infection retrovirale. De plus, certains tissus, comme le foie et l'estomac, expriment rarement le gene marqueur bien qu'ils aient incorpore l'information genetique portee par les vecteurs retroviraux
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Boivin-Welch, Michael. "Construction d'un clone produisant des vecteurs rétroviraux s'auto-inactivant pour le traitement de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive par thérapie génique." Master's thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/34542.
Full textAbstract:
L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR.Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.
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Thoraval, Pierrick. "Utilisation de rétrovirus aviaires pour l'élaboration de vecteurs rétroviraux : applications à l'établissement d'une lignée cellulaire aviaire transcomplémentante et à l'action de l'oncogène cellulaire p53 sur les cellules aviaires." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO10144.
Full textAbstract:
Construction de vecteurs a partir de virus defectifs de l'erythroblastose aviaire chez lequel les oncogenes u-erb a et u-erb b sont deletes. Ces vecteurs permettent de vehiculer deux genes exogenes dont l'expression est dirigee par les promoteurs retroviraux. Developpement d'une lignee cellulaire aviaire permettant l'obtention de virus defectifs. Etude de l'expression du gene p53 aviaire a partir de cultures de fibroblastes d'embryon de poulet. L'etude de cet oncogene est en effet necessaire pour l'obtention de lignees cellulaires immortelles. Le gene p53 possede une action positive sur la multiplication cellulaire qui s'avere toutefois insuffisante pour perenniser les cellules infectees
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Chambonnet, Frédérique. "Utilisation de vecteurs rétroviraux dérivés de l'AEV (Avian Erythroblastosis Virus) pour le transfert de gènes in vivo chez le poulet." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO10041.
Full textAbstract:
Les proprietes d'infection et d'integration des retrovirus sont utilisees pour transferer des informations genetiques exogenes in vivo afin de determiner les conditions d'obtention de poulets transgenique. Deux strategies d'infection ont ete developpees: 1) inoculation de suspension virale dans les embryons apres 24 heures d'incubation, 2) injection intratesticulaire chez les coqs reproducteurs. Identification d'arn et de sequences d'adn specifiques des genes inseres chez des embryons de 9 jours et dans les organes de poussins eclos
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Mallet, François. "Transfert de gènes par des vecteurs rétroviraux aviaires dérivés de l'AEV ES4 (Avian Erythroblastosis virus) : rôle de la position du gène inséré et de son contexte traductionnel sur l'efficacité des vecteurs." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO10112.
Full textAbstract:
Le virus de l'erythroblastose aviaire (aev es4) est un virus defectif leucenogene comportant deux oncogenes v-erba et v-erbb. Construction de vecteurs retroviraus derives du genone de l'aev. Les retrovirus recombinants recoltes ont servi a infecter des fibroblastes d'embryon de poulet (cef) ou des fibroblastes immortalises de caille (qtg). Construction de vecteurs a double expression genique, regulation de l'epissage
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Roux, Pierre. "Ciblage cellulaire à l'aide de vecteurs rétroviraux et étude du contrôle de la translocation nucléaire de la protéine codée par l'oncogène fos." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20003.
Full textAbstract:
Nous avons pu montrer que le ciblage cellulaire in vitro a l'aide de vecteurs retroviraux recombinants etait possible en utilisant une methode de pontage entre le virus et sa cible. Cette technique nous a permis d'infecter par des retrovirus murins ecotropes, certains types de cellules humaines normalement non infectables par ce type de virus. Dans un second temps, le clonage et la caracterisation d'un adnc fos humain nous ont permis de mettre en evidence que la translocation nucleaire de la proteine codee par le proto-oncogene c-fos est un mecanisme hautement regule par des facteurs extra-cellulaires. La perte de ce controle par les homologues viraux de c-fos constitue une nouvelle contribution potentielle a l'activite oncogene des proteines v-fos
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Ronfort, Corinne. "Etude des structures rétrovirales endogènes dans des cellules de poules et d'un exemple d'interaction avec des vecteurs rétroviraux dérivés des ASLV (Avian Sarcoma Leukemia Viruses)." Lyon 1, 1992. http://www.theses.fr/1992LYO10214.
Full textAbstract:
Les structures retrovirales endogenes (ou ev) sont des sequences retrovirales integrees dans les genomes cellulaires et qui se transmettent a la descendance des sujets comme des genes cellulaires. Le travail de these a consiste, en premier lieu, a etudier les loci ev qui sont presents au sein d'une souche de poules leghorn doree. Par cartographie de restriction, 4 loci endogenes ont ete identifies, 2 d'entre eux representent des formes non encore decrites. Tous sont deletes pour une partie plus ou moins importante de leur genome et aucun n'est capable de produire des particules virales infectieuses. Certaines regions (genes env, ltr) ont ete sequencees. Les resultats montrent une homogeneite importante entre les divers ev indiquant que l'infection et la stabilisation de retrovirus dans les lignees germinales de poulet est limitee a une categorie de retrovirus le sous-groupe e. Une seconde partie du travail a consiste a determiner les formes virales nouvelles generees suite a des interactions entre des genomes endogenes et des vecteurs retroviraux (vr). Les vr sont utilises dans le cadre d'experiences de transfert de genes; il s'agit de formes virales modifiees de sorte a ce qu'elles transportent, dans le genome d'une cellule cible, le gene que l'on souhaite y apporter. Les particules virales vecteurs sont obtenues sur des lignees transcomplementantes aptes a les produire, en absence de formes virales replicatives. A partir de cellules transcomplementantes pourvues de loci ev, il a ete observe l'emergence de formes virales non souhaitees, formes non detectees dans des cellules depourvues de loci ev. Ces formes sont representees: a) par des particules renfermant des genomes endogenes capables de s'integrer dans l'adn d'une cellule cible et de s'y exprimer, b) par des formes virales competentes pour la replication generees par recombinaison entre genomes ev et vecteurs
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Zhao-Emonet, Jing Chao. "Etude de vecteurs rétroviraux contenant les séquences régulatrices du gène CD4 et permettant de contrôler une expression spécifique de transgènes dans les lymphocytes T." Paris, EPHE, 2000. http://www.theses.fr/2000EPHE3001.
Full textAbstract:
Dans de nombreux protocoles de thérapie génique, le transfert de gène est effectué au moyen de vecteurs rétroviraux. Nous avons choisi de développer un vecteur rétroviral spécifique de cellules T, et plus particulièrement la sous-population lymphocytaire CD4+, afin de restreindre l'expression in vivo du gène thérapeutique dans les cellules cibles. A cette fin, nous avons d'abord défini un promoteur minimal du gène CD4 humain qui contient tous les éléments régulateurs nécessaires à une activité forte et une spécificité lymphocytaire T. Nous avons testé la fonctionnalité tissu-spécifique d'une minicassette transcriptionnelle combinant ce promoteur minimal et l'enhancer proximal CD4 murin dans des cellules en culture. Nous avons également défini un répresseur du gène CD4 humain, qui est responsable de l'expression du gène rapporteur restreinte aux lymphocytes T matures CD4+, absente dans les lymphocytes T CD8+ chez la souris transgénique. Par la suite, nous avons utilisé la minicassette transcriptionnelle du gène CD4 dans différents vecteurs rétroviraux, dérivés du rétrovirus de la leucémie murine de Moloney, en testant diverses configurations. Nos résultats ont montré que, dans l'une de ces configurations, le vecteur rétroviral comportant la séquence régulatrice du gène CD4 présente une activité restreinte aux cellules T humain en culture et aux lymphocytes du sang périphérique CD3+; de plus, un bon titre viral a été obtenu, comparable à celui obtenu avec le vecteur contrôle positif, comprenant le LTR sauvage. En outre, nos résultats suggèrent que des séquences virales situées en dehors des LTRs (la partie 5' de la phase ouverte de lecture de gag ou la partie du leader) sont capables d'influencer la spécificité tissulaire de la séquence régulatrice du gène CD4.
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Maurice, Marielle. "Modification de la glycoprotéine portée par les vecteurs rétroviraux pour favoriser le transfert de gènes dans les cellules quiescentes et le ciblage cellulaire." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10274.
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Gaillet, Bruno. "Utilisation de vecteurs viraux et du système inductible au cumate pour la production de protéines recombinantes avec les cellules cho." Thesis, Université Laval, 2010. http://www.theses.ulaval.ca/2010/27416/27416.pdf.
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Afanassieff, Marielle. "Transfert de gènes chez le poulet : analyse des intégrations provirales lors d'injections intratesticulaires ou intraembryonnaires de vecteurs rétroviraux dérivés des ALSV (Avian Leukemia Sarcoma Viruses)." Lyon 1, 1991. http://www.theses.fr/1991LYO10230.
Full textAbstract:
Le programme de transfert de genes chez les oiseaux aborde dans notre laboratoire vise a integrer de nouvelles informations genetiques dans la lignee germinale du poulet, au moyen de vecteurs retroviraux derives des alsv (avian leukemia sarcoma viruses). Le travail presente dans ce memoire s'inscrit dans cette direction, en etudiant deux protocoles de transfert de genes in vivo, l'un par injections de retrovirus dans les testicules de coqs adultes, l'autre par injections de retrovirus dans des embryons de 0 ou 24 heures. Dans un premier temps, ce travail a consiste a obtenir un troupeau de poulets de la souche leghorn doree homogene et bien caracterise pour ses structures endogenes. En effet, la connaissance des loci endogenes des animaux utilises est indispensable pour distinguer, lors des manipulations de transgenese, les structures virales exogenes integrees des endovirus. Dans un second temps, les deux protocoles de transfert de genes ont ete analyses, en utilisant des vecteurs retroviraux vehiculant des genes modeles produits soit en systeme helper-vecteur en association avec le rav-1 (rous associated virus type 1), soit en systeme helper free a partir de lignees transcomplementantes aviaires. Les injections de retrovirus dans les testicules de coqs adultes permettent d'obtenir une infection des gonades qui reste cependant insuffisante pour aboutir a un transfert de genes. En effet, la reaction immunitaire des animaux semble intervenir pour eliminer les cellules infectees puisqu'aucune integration provirale n'est detectee dans l'adn extrait des cellules spermatiques des coqs traites. En revanche, les resultats obtenus par injections de retrovirus dans des embryons de 0 ou 24 heures sont beaucoup plus prometteurs pour obtenir a un transfert de genes. En effet, le taux d'infection embryonnaire obtenu est notable, puisqu'avec un systeme helper free au minimum une cellule sur 75 presente une integration provirale. On peut donc supposer que parmi les cellules infectees se trouvent des cellules germinales souches. Afin de verifier la possibilite d'un transfert germinal, des poussins issus d'injections intraembryonnaires de vecteurs retroviraux helper free ont ete obtenus. La reproduction de ces animaux potentiellement mosaiques permettra de definir le taux de transmission genetique des vecteurs integres
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Hatziioannou, Théodora. "Modification des particules rétrovirales du virus de la leucémie murine et incorporation virale de protéines hétérologues pour le développement de vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique in vivo." Lyon 1, 1999. http://www.theses.fr/1999LYO1T125.
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Thomas, Jean-Luc. "Transfert de gènes chez le poulet à l'aide des vecteurs rétroviraux aviaires dérivés des ALV : études de l'expression des gènes transférés chez l'embryon à un stade précoce de développement." Lyon 1, 1991. http://www.theses.fr/1991LYO10167.
Full textAbstract:
Le travail presente dans cette these s'inscrit dans un projet de transgenese chez le poulet a l'aide de vecteurs retroviraux aviaires. Les resultats obtenus concernent specifiquement l'etude de l'expression retrovirale chez l'embryon de poulet inocule a un stade precoce du developpement (0 h et 24 h d'incubation). L'etude par immunocytochimie anti-cap27 (proteine majoritaire de la capside) de l'expression du virus rav-1 (rous associated virus type 1) chez des embryons de 6 jours et de 72 h inocules a 24 h a permis de constater, entre ces deux stades de developpement, une large diffusion de l'expression virale a un grand nombre de tissus issus des 3 feuillets embryonnaires initiaux (ectoderme, mesoderme, endoderme). Seul le systeme nerveux exprime le virus de facon tres circonscrite. La cinetique de viroproduction a partir des broyats d'embryons met en evidence un phenomene d'extinction de la viroproduction a 96 h d'incubation ce qui rejoint un resultat d'howlett et al. (1987). Le meme cadre d'etude a ensuite ete adopte avec des vecteurs retroviraux defectifs portant le gene marqueur d'expression lacz (vecteur nl). L'etude de l'expression de ces vecteurs helper-free (absence de virus assistants) nl portant les sequences regulatrices issues des rav (rous associated virus) et de l'aev (avian erythroblastosis virus) montre une faible efficacite d'infection des embryons de 0 h et 24 h d'incubation. L'expression de 3 types de vecteurs, les nla, nlb et nl53 porteurs des ltr de rav-1, rav-2 et aev respectivement, ne semble pas restreinte a un tissu somatique particulier. En ce qui concerne la lignee germinale, nous n'avons pu clairement determiner s'il existait un marquage des cellules germinales d'embryons de 72 h ou d'embryon de 96 h, bien que ceci ne puisse etre exclu. Le vecteur nla montre un tropisme d'expression preferentiel pour le cur par rapport aux 2 autres vecteurs alors que le vecteur nlb montre plutot un tropisme pour le tissu nerveux, aucun tropisme particulier ne peut etre mis en evidence pour le nl53. Cette particularite pourrait etre lie a la nature des la ltr. Des differences de sequences existent au niveau des sequences enhancer qui pourraient suffire a expliquer ce phenomene. Il semble egalement exister une regulation de l'expression des vecteurs au cours du developpement embryonnaire
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Rivière, Isabelle. "Construction et expression de vecteurs rétroviraux portant l'ADNc du gène de l'adénosine déaminase (ADA) humaine et l'ADNc du gène de l'IFN-beta murin pour le développement et l'amélioration de stratégies de thérapies géniques." Paris 11, 1993. http://www.theses.fr/1993PA112035.
Full textAbstract:
Des stratégies de thérapie génique sont en cours d'étude pour le traitement de maladies humaines. Ce type de thérapie s'adresse en premier lieu aux anomalies héréditaires récessives causées par la déficience en un gène unique dont le traitement nécessite l'addition du gène normal, mais pourrait être utilise également pour le traitement de cancers, de leucémies ou de maladies infectieuses. Le recours aux modèles animaux est indispensable pour : 1) juger directement de l'efficacité du transfert de gènes in vivo; 2) explorer les effets biologiques et potentiellement thérapeutiques de molécules exprimées à des niveaux physiologiques ou non physiologiques; 3) améliorer la méthodologie qui sera finalement appliquée à l'homme. Nos travaux s'inscrivent précisément dans le cadre du développement et de l'amélioration de modèles animaux murins. Étant donné les propriétés antivirales de l'interféron (IFN), nous développons une approche de thérapie génique basée sur l'expression constitutive de l'IFN dans les cellules hématopoïétiques et dirigée contre les maladies virales fatales à évolution lente et chronique comme le sida. D'autre part, nous nous intéressons à une maladie génétique héréditaire causée par la déficience en un gène unique codant pour l'adénosine déaminase (ADA); le dysfonctionnement de ce gène entraine une immunodéficience combinée sévère (SCID) chez l'homme. Aussi, la seconde partie de nos travaux concerne l'amélioration de la technologie relative à l'expression du gène codant pour l'ADA humaine dans les cellules hématopoïétiques in vivo, dans un modèle murin. L’approche commune à ces deux projets repose sur l'expression des ADNc (ADN complémentaires) des gènes codant pour l'IFN-beta murin et l'ADA humaine dans les cellules hématopoïétiques par l'intermédiaire de vecteurs rétroviraux.
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Torne-Celer, Caroline. "Développement d'un nouveau type de vecteur rétroviral autodéletant pour l'étude de l'intégration rétrovirale et le transfert de gènes." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10114.
Full textAbstract:
Un systeme de transfert de genes est constitue de 2 composantes : un vecteur et une lignee transcomplementante qui permet sa production sous forme de particules retrovirales. Ce travail a eu pour principal objectif d'ameliorer la composante vecteur d'un systeme retroviral. Le vecteur etudie possede une sequence d'integration surnumeraire (sequence att) en position interne, entre 2 genes de selection (neo sous controle de la ltr et puro sous controle d'un promoteur interne). L'analyse de clones d'infection a mis en evidence un mecanisme d'integration atypique pour 31% des provirus (clivage imprecis des extremites virales, duplications de taille incorrecte et frequentes deletions d'adn genomique au cours de l'integration), qui pourrait resulter du clivage de la sequence att interne par l'integrase, bien que l'existence d'un precurseur att-ltr issu de la transcription inverse ne puisse etre exclue (1). D'autres provirus integres selon le mecanisme classique, par le biais des ltr, presentent des duplications de taille incorrecte qui pourraient s'expliquer par un mauvais positionnement de l'in du a des homologies de sequences entre adn viral et adn cellulaire (2). Le vecteur att presente des proprietes autodeletantes qui permettent de reduire le risque de mobilisation du vecteur en cas de surinfection. L'efficacite de ce processus d'autodeletion peut etre amelioree en augmentant la pression de selection sur le gene puro (75% des provirus sont bornes par la sequence att interne et la ltr3' et plus de 92% sont non mobilisables). La production du vecteur est augmentee d'un facteur 10 par la deletion du signal de polyadenylation du gene puro ou bien le retournement de la cassette de selection puro. L'efficacite de transduction du gene puro est amelioree par l'augmentation de la taille de la sequence att interne (3). Enfin, nous avons montre que le vecteur att conserve ses proprietes autodeletantes sur cellules humaines (4). Ces resultats presentent un nouveau type de vecteur autodeletant qui pourrait etre utilise pour des applications de transfert de genes ou de therapie genique.
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Rozoy, Brigitte. "Optimisation du transfert de gène dans les lymphocytes T à l'aide de rétrovirus recombinants non réplicatifs." Paris 5, 1997. http://www.theses.fr/1997PA05P071.
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Bachelot, Thomas. "Thérapie génique par transfert rétroviral dans les cellules souches hématopoïétiques : développement des vecteurs et application au contrôle de la néoangiogenèse tumorale." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2000. http://www.theses.fr/2000GRE10061.
Full textAbstract:
Malgre un investissement considerable, les resultats obtenus pour l'instant par la therapie genique sont encore tres modestes, principalement du fait de problemes de vectorisation. L'objectif de ce travail etait double : d'une part ameliorer les vecteurs utilises pour permettre le transfert de gene aux cellules souches hematopoietiques (csh) et, d'autre part, evaluer le potentiel antitumoral de la secretion systemique d'une molecule antiangiogenique naturelle a partir du systeme hematopoietique. Nous decrivons tout d'abord une technique originale de transduction retrovirale des cellules cd34+ humaines apres infection par un vecteur aav apportant l'adn complementaire du recepteur ecotrope. Ensuite, nous decrivons une serie de vecteurs permettant de transferer dans les csh un gene d'interet associe au gene de la green fluorescent protein (gfp) dans de bonnes conditions de titre et de stabilite. La selection par cytofluorimetrie de flux des csh transduites par ces vecteurs avant leur reinjection nous a permis d'obtenir des resultats remarquables en terme de taux de cellules hematopoietiques peripheriques finalement transformees et, exprimant le transgene a long terme. Nous decrivons leur application au transfert du gene de la -globine humaine chez la souris et a un modele preclinique de protoporphyrie hereditaire. Utilisant ces techniques avec un adnc codant pour une forme secretee de l'endostatine, nous avons obtenu, a long terme, des taux circulants de cette molecule 7 fois superieurs a la normale, sans toutefois observer d'effet antitumoral notable. Ces resultats constituent un net progres dans le cadre de la therapie genique appliquee au systeme hematopoietique. Pour ce qui est du controle de la neoangiogenese, nos resultats mettent en cause l'efficacite reelle de l'endostatine.
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Coquin, Youna. "Caractérisation de vecteurs lentiviraux pseudotypés par les syncytines murines et de leurs cibles cellulaires in vitro et in vivo." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLE039.
Full textAbstract:
Les vecteurs lentiviraux (LV) de thérapie génique sont des particules recombinantes qu'il est possible de pseudotyper avec diverses glycoprotéines d'enveloppe afin de modifier l'adressage cellulaire ou leurs propriétés immunogéniques. Mon travail de thèse a exploré l'hypothèse que la VSVG, la glycoprotéine d'enveloppe la plus utilisée pour pseudotyper les LV, puisse être remplacée par des protéines cellulaires afin d'obtenir des particules bien tolérées et administrables in vivo. J'ai utilisé les syncytines murines, qui sont des glycoprotéines d'origine rétrovirale endogène et qui ont des propriétés fusogéniques et un potentiel immunosuppressif. Mes résultats ont montré la possibilité de produire des LV pseudotypés par les syncytines murines A et B. Les particules ainsi produites (LV-SynA et LV-SynB) sont infectieuses en présence d'un adjuvant de transduction et présentent une forte capacité à transduire les lymphocytes B murins in vitro. Les vecteurs LV-Syn sont capables de transduire des lymphocytes B quiescents, ainsi que des cellules précurseurs des lymphocytes B issus de moelle osseuse de souris. L'administration de LV-SynA in vivo chez la souris par voie intraveineuse permet d'observer un transfert de gène stable. Un signal est observé dans la rate et plus particulièrement dans les lymphocytes B au niveau des centres germinatifs, en accord avec les résultats obtenus in vitro. Mes travaux confirment donc, et étendent, les observations préalables du laboratoire sur la transduction de lymphocytes B naïfs humains avec les syncytines humaines, et suggèrent un fort tropisme des syncytines en général pour les lymphocytes B. Par ailleurs, mes résultats montrent qu'in vivo, le poumon est également ciblé par les LV-SynA, en accord avec l'expression récemment identifiée du récepteur à la syncytine A, Ly6e, dans cet organe. Il semble que le transfert de gène puisse être obtenu dans l'épithélium alvéolaire et il est possible de transduire des cellules primaires épithéliales pulmonaires humaines avec les LV-Syn in vitro. Globalement, mes résultats montrent une nouvelle perspective d'interaction entre les syncytines et le système immunitaire à travers la transduction des lymphocytes B. Mes résultats permettent également d'envisager de nouvelles perspectives pour le transfert de gène dans le poumon in vivo et pour développer de nouvelles approches de thérapie génique par voie systémiqueLentiviral gene transfer vectors (LV) used in gene therapy are recombinant virus-like particles that can be pseudotyped with diverse envelope glycoproteins in order to modify their cellular targeting or their immunogenic properties. My thesis work explored the hypothesis that VSVG, the most-commonly-used viral envelope glycoproteins of LV, could by replaced by cellular glycoproteins to obtain well-tolerated particles that can be administered in vivo. I used murine syncytins which are glycoproteins of endogenous retroviral origin and which have fusogenic properties and immunosuppressive potential. My results showed the possibility of producing LV pseudotyped with murine syncytins A or B. The LV-SynA or LV-SynB particles produced were infectious in the presence of a transduction adjuvant and efficiently transduced murine B cells in vitro, including quiescent B cells and bone marrow B precursor cells. In vivo LV-SynA intravenous administration in mice enabled stable gene transfer. A positive signal was observed in the spleen, and especially in B cells at the level of the germinal centers, confirming in vitro observations. These results confirm and extend previous observations from the laboratory showing that human naive B cells can be transduced by LV pseudotyped with human syncytins, and emphasize the marked interactions between syncytins and B cells. Moreover, my results showed that in vivo in mice LV-SynA targets the lungs, possibly epithelial alveolar cells, in line with the recent findings of Syncytin A receptor Ly6e expression in the lung. Gene transfer was also obtained in human primary pulmonary epithelial cells in vitro with LV-Syn. Overall, my results reveal new interactions between syncytins and the immune system through the transduction of B cells. My results also provide novel perspectives for gene delivery in vivo in the lung and for designing new systemic gene therapy approaches
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Souchkova, Ouliana. "Expression et étude fonctionnelle du groupe miR-106-363 à l'aide des vecteurs rétroviraux." Mémoire, 2010. http://www.archipel.uqam.ca/3710/1/M11529.pdf.
Full textAbstract:
Récemment, notre laboratoire a identifié un nouveau site commun d'intégration rétrovirale sur le chromosome X chez la souris (S. Landais et al., 2005). Ce site a été associé à un nouveau gène, appelé Kaplan integration site 2 (Kis2), dont l'expression est augmentée dans les cellules tumorales. De façon surprenante, il ne code pour aucune protéine, et produit cinq transcrits d'ARN non codant comportant le précurseur (primiARN) du groupe de six micro-ARN (miARN): miR-106-363 (S. Landais et al., 2007). La compréhension de la fonction des produits de ce gène ainsi que les voies métaboliques dans lesquelles ils sont impliqués pourraient approfondir notre connaissance de la régulation de l'expression des miARN regroupés. L'expression transitoire de ce locus dans des vecteurs d'expression eucaryotes s'est avérée non fructueuse. Afin de contourner cet obstacle, nous avons eu recours à l'infection des cellules par les rétrovirus recombinants contenant le groupe miR-106-363 comme outil permettant l'expression stable du gène d'intérêt. Dans ce travail nous avons établi deux lignées cellulaires, NIH 3T3 (fibroblastes murins) et Ti6 (lymphocytes), qui expriment le gène Kis2 et le groupe miR-106-363 à l'aide de trois constructions rétrovirales. Grâce à la construction pMSCV-Kis2, nous avons surexprimé les miARN du groupe miR-106-363 dans les NIH 3T3 et les Ti6. La construction pLXSN-Kis2 a permis de produire l'un des plus grands transcrits du gène Kis2 (1.7 kb) dans la lignée Ti6. Le test d'indépendance d'ancrage réalisé sur les cellules exprimant le groupe miR-106-363 de façon stable a confirmé son implication dans la transformation maligne et a établi une corrélation entre le niveau d'expression des ces miARN et la gravité de la transformation. L'obtention d'un système d'expression efficace de Kis2/miR-106-363 nous permettra d'étudier plus en détail la fonction de ces miARN, d'identifier leurs cibles et leurs partenaires d'interaction ainsi que d'étudier leur rôle in vivo chez la souris. De plus, les cellules qui expriment le gène de manière stable seront la source infinie du matériel permettant de conduire les expériences à plus grande échelle y compris l'étude des molécules inhibitrices pour le traitement de la leucémie de type T.
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MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : oncogenèse, ARN non codant, miARN, système d'expression rétroviral.
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Courtemanche-Asselin, Philippe. "Conception d'une banque de nonapeptides exprimés constitutivement en cellules de mammifères pour l'étude in vivo d'interactions protéine-protéine." Thèse, 2005. http://hdl.handle.net/1866/15155.
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