Dissertations / Theses on the topic 'Venenosos'

Purifica la isoforma ácida presente en el veneno de Bothrops pictus mediante el uso de dos pasos cromatográficos: CM Sephadex C-50 seguido de Superdex 75 10/300 GL, lográndose un rendimiento de 7.5% y un factor de purificación de 19.8 veces. Se obtiene una sola banda con un peso molecular de 16.6 kDa en condiciones reductoras y 15.2 kDa en condiciones no reductoras empleando la técnica de PAGE-SDS. Se determina el peso molecular en solución mediante la técnica de dynamic light scattering obteniéndose una única población de proteínas monodispersa de radio hidrodinámico de 4.254 ± 0.778 (nm) correspondiente a un peso molecular de 19.7 ± 3.7 kDa. La enzima BpicPLA2ácida es altamente termoestable debido a que mantiene casi intacta su actividad incluso después de incubarla por 10 min a 100 ⁰C. El ion que incrementa en mayor medida su actividad es el calcio y el agente con mayor inhibición es el ditiotreitol. Los estudios de dicroísmo circular demostraron que la estructura secundaria predominante en la BpicPLA2ácida son las α hélices. La secuencia de aminoácidos de BpicPLA2ácida tomada del GenBank muestra la presencia de un sitio catalítico (His48, Asp49, Tyr52 y Asp99) conservado, mientras que el sitio de unión a calcio no es completamente conservado, debido a una mutación en la posición 28 de la tirosina por fenilalanina. El modelo de la estructura tridimensional reportado, demuestra que la isoforma BpicPLA2ácida es una enzima que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 de la clase II y que además presenta una mayor relación evolutiva con otras PLA2 ácidas.
Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Describe la purificación y caracterización bioquímica, estructural y funcional del principio coagulante del veneno de la serpiente endémica del Perú Bothrops pictus, denominada pictobina. La enzima es purificada por la combinación de tres pasos cromatográficos, empleando intercambio catiónico CM-Sephadex C-50 seguida de dos pasos de filtración molecular en Sephadex G-100 y Sephadex G-75 respectivamente. La Pictobina es una glicoproteína monomérica con una masa molecular de 49 kDa medida por PAGE-SDS bajo condiciones reductoras y de 41 kDa por MALDI-TOF-TOF. El contenido de carbohidratos es de aproximadamente 45% de la masa y pueden ser removidos por deglicosilación con PNGasa F. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25.76%), hexosaminas (13.12%) y ácido siálico (0.76%). La secuencia N-terminal (VIGGDECNINEHRFLAFTYS) muestra semejanza con las enzimas similares a trombina. La Pictobina tiene actividad coagulante sobre plasma humano y fibrinógeno humano y bovino. La actividad coagulante específica de la enzima es equivalente a 131.1 NIH U/mg de trombina liberando solo el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano y tuvo un efecto defibrinogenante en roedores. La enzima produce una malla de fibrina porosa visualizada por microscopía electrónica de barrido, así como agregación plaquetaria. La Pictobina posee actividad catalítica sobre los sustratos sintéticos BApNA, S-2266, S-2302, S-2160 y S-2238. El tripéptido sintético D-Val-Leu-Arg-pNa el cual es considerado como el mejor sustrato. La actividad amidolítica es inhibida por PMSF, DTT y 2-β mercaptoetanol. La enzima muestra estabilidad a diferentes temperaturas (25 a 55°C), valores de pH (5.0 a 11.0) o en presencia de iones (Mg+2, Mn+2, Ca+2, Na+ y K+) pero es inhibida por el Zn+2. La enzima interacciona con el inhibidor endógeno α:2-macroglobulina y con el suero antibotrópico polivalente. La deglicosilación de la enzima produjo alteración en la actividad y el reconocimiento del antiveneno. El cDNA de la Pictobina (760 pb) codifica una proteína madura de 233 aminoácidos que conserva dominios estructurales con otras enzimas similares a trombina como el sitio catalítico (His40, Asp89 y Ser179) y los sitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Se identifican tres motivos para la N glicosilación. El modelamiento de la Pictobina revela un plegamiento tipo quimotripsina presentando un bolsillo hidrofóbico sobre su superficie, involucrado en el reconocimiento del sustrato y un importante bucle 90’s clave en la restricción del sitio catalítico. Los análisis de interacción molecular revelan que los residuos Phe194 y Trp195 de la Pictobina forman una interacción estable con los residuos Gly13, Gly14 y Val15 del fibrinopéptido A posicionando el puente de los residuos Arg16 y Gly17 del sustrato para el clivaje en el sitio catalítico. Tomando en conjunto estos resultados, se concluye que Pictobina es una enzima similar a trombina presente en el veneno de la serpiente Bothrops pictus.
Tesis

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops pictus “Jergón de costa” (BpicLAAO), mediante cromatografía de filtración molecular sobre Sephadex G-100, seguida de una cromatografía de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 22,02 veces con una actividad específica de 4,25 U/mg. La pureza de la proteína fue evaluada por HPLC en fase reversa y mediante PAGE-SDS. Es una proteína ácida conteniendo 18,7 % de carbohidratos asociados, con un peso molecular de 132,27 kDa, por cromatografía de filtración y de 65,2 y 58,6 kDa por PAGESDS bajo condiciones reductoras y no reductoras respectivamente, evidenciando que se trata de una enzima homodimérica con al menos un puente disulfuro intracatenario, el cual es importante para su actividad. El peso de la enzima disminuyó a 47 kDa después del tratamiento con PNGasa F. La enzima mostró un pH óptimo de 8,5 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; tolera hasta los 55 ºC. La actividad enzimática disminuyó considerablemente en presencia de Zn2+, glutatión y 2-mercaptoetanol, lo que sugiere la presencia de por lo menos un puente disulfuro intracatenario para su actividad. BpicLAAO presenta actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos siendo la dosis hemorrágica mínima de 2,79 μg de proteína, produce edema, habiéndose calculado la dosis edemática mínima en 7,80 μg de proteína; también inhibe la agregación plaquetaria inducida por ADP de una manera dosis dependiente. El efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció sobre cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, observándose que las Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Se demostró la antigenicidad de la enzima por inmunodifusión e inmunoelectroforesis, usando suero antibotrópico polivalente. Asímismo mediante el análisis molecular a partir de las secuencias de cDNA de LAAO de B. pictus se obtuvo una secuencia de 1494 pb que codifica un péptido señal y una proteína madura de 487 residuos aminoacìdicos. BpicLAAO, muestra homología con otras enzimas similares de venenos de serpientes habiéndose identificado los aminoácidos correspondientes a los dominios de unión al FAD, de unión al substrato y el dominio helicoidal. Encontrándose además dos motivos para N-glicosilación. Palabras clave: enzima, flavoproteína, N-glicosilación, secuencia nucleotídica, serpiente, veneno.
Tesis

Submitted by Isac Macêdo (isac@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-26T13:34:50Z No. of bitstreams: 1 MP 2007 - Juliana Meira Diniz - 04 de março.pdf: 1082388 bytes, checksum: 914fea0032d3c3bd3ebfe321b616cf2a (MD5)
Made available in DSpace on 2013-09-26T13:34:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MP 2007 - Juliana Meira Diniz - 04 de março.pdf: 1082388 bytes, checksum: 914fea0032d3c3bd3ebfe321b616cf2a (MD5)
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Os jogos pedagógicos têm atualmente grande importância na área de divulgação do conhecimento. Neste trabalho propomos uma atividade lúdica na forma de um jogo denominado "Na trilha com os Peçonhentos" para ser utilizada na abordagem do tema animais peçonhentos e de temas centrais da biologia em turmas do ensino médio. O jogo foi produzido com base nos saberes iniciais de estudantes do ensino médio e na abordagem do tema presente em livros didáticos de biologia. O objetivo principal do jogo é apresentar o conteúdo a partir dos saberes dos alunos entrevistados. O jogo é apresentado no formato de tabuleiro com cartas contendo as perguntas a serem respondidas e situações de sorte e azar. A dinâmica planejada envolve a participação do professor e situações da vida cotidiana nos quais os estudantes respondem perguntas, mas também correm o risco de encontrarem um animal peçonhento/venenoso. A avaliação in loco com estudantes do ensino médio de faixa etária entre 16 e 18 anos mostrou que a maioria não sabe a definição correta do tema, mas tem grande interesse pelo mesmo. A utilização desse material lúdico como instrumento poderá ocasionar o desenvolvimento de habilidades, favorecendo a aquisição de novos conhecimentos de importância médica e social sobre o tema.
The didactical games are of great importance in the field of Science. In this work we propose a playful activity in a form of a game named “Na trilha com os peçonhentos” (In the path with venomous) to approach the theme of as well as other biology key themes for the high school education. The game was constructed based on previous high school student’s conceptions and in Biology´s didactic books theme approach. The main purpose of the game is to fulfill the difficulties related to the main topic and to perform a revision about this high school biology concept whereas the student participates.. The game is presented in the tray format with letters contends the questions to be answered and situations of luck and bad luck. The planned dynamics involves the participation of the teacher and situations of the daily life in which the students answer questions, but also runs the risk to find venomous animals. The in loco evaluation with 16-18 years high school students showed that most do not know the theme correct definition but has great interest on it. The use of this playful material as instrument may lead to the abilities development also favoring the acquisition of new knowledge about the medical and social importance about the theme.

Reporta un estudio a nivel bioquímico, biológico, funcional y estructural de la enzima hialuronidasa del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergon de la selva”, denominada, Hyal-Ba. Se utilizaron tres pasos cromatográficos para purificar esta enzima, empleando como primer paso una columna de intercambio iónico sobre DEAE Sephadex A-50 seguido de una columna de exclusión molecular sobre Sephadex G-100 y finalmente una columna de Sephadex G-75, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0.05 M pH 5. El rendimiento de la actividad de Hyal-Ba fue de 29.59 % con un incremento de 36 veces la actividad específica. La enzima representa el 0.86% del contenido total de proteínas en el veneno de B. atrox. Los análisis de SDSPAGE, HPLC y N- Terminal confirman el alto grado de pureza de la enzima. Mediante PAGE-SDS esta enzima mostró 1 banda principal de 69 kDa de peso molecular y su pH óptimo fue de 6.0. A temperatura ambiente la actividad enzimática llega ser nula a las 144 horas. La actividad enzimática se incrementó un 40 % por la adición del ion magnesio (150 mM) y fue inhibida en un 97 y 88 % por EDTA y TLCK (12 mM) respectivamente. En las pruebas biológicas de toxicidad, hemorrágica y edemática se observa que la enzima carece de actividad tóxica, pero incrementa la acción hemorrágica del veneno total sobre la piel de los ratones albinos, no obstante, Hyal-Ba bajo la actividad edemática al disminuir significativamente el edema cuando fue agregada junto con la LAAO. También se midió su inmunoreactividad frente al antiveneno botrópico polivalente por inmunodifusión. Para el análisis de la secuencia nucleotídica de Hyal-Ba se realizaron protocolos de extracción, purificación y obtención de mRNA a partir de veneno fresco, luego su conversión en cDNA y su posterior amplificación por PCR. Los estudios moleculares in silico identificaron una secuencia de 2020 pb que codifica una proteína madura de 429 aminoácidos. Adicionalmente el análisis de su estructura primaria reveló 50 kDa como peso molecular y 9.19 como punto isoeléctrico. Se encontró además 6 probables sitios de N-glicosilación (Asn67, Asn103, Asn111, Asn153, Asn357y Asn401).
Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú), según contrato N° 131-FINCyT-IB-2013. Perú. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado de la UNMSM - Código de proyecto: B18100531
Tesis

En la presente investigación se estudian las propiedades, bioquímicas, biológicas, inmunológicas y moleculares de una isoforma básica de Fosfolipasa A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta(PLA2básicaL.muta). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración y de alta performance; la enzima fue purificada 41,2 veces con un rendimiento de 64%. Se obtuvo una única banda proteica de 14,7 kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrando ser una proteína monomérica. Su pH óptimo es de 7,8 y es fuertemente inhibida por el PMSF, EDTA y glutatión. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo la dosis hemolítica media (DH50) en 4,35µg, la dosis miotóxica mínima (DMM) en 18,96µg/ml y la dosis edemática mínima (DEM) 23,56μg. La enzima no mostró actividad hemorrágica ni acción anticoagulante. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2básicaL.muta es reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilachésico (INSPerú). Empleando la metodología de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa del cDNA de PLA2básicaL.muta, con 445 pb; análisis bioinformáticos indican que la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleótidos que codifica un péptido señal de 16 aminoácidos y una proteína madura de 122 residuos, el peso molecular fue de 13,86 kDa y un pI de 8,316. La secuencia aminoacídica, contiene residuos conservados para el sitio catalítico, His48, Asp49, Tyr52 así como para unión al Ca+2, Tyr18, Gly30 y Gly32. El modelaje tridimensional de la PLA2, muestra que está formada por tres hélices-, una lámina- y un lazo de unión al Ca+2. PLA2básicaL.muta mostró alta homología estructural con otras sPLA2 de venenos de serpientes. Finalmente, los estudios revelan que la PLA2básicaL.muta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] básicas de bajo peso molecular. Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y función de una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana. Palabras claves: Fosfolipasa A2, Isoenzima, Lachesis muta, sitio farmacológico, transcrito.
--- In the present research the biochemical, biological, immunological, as well as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicL.muta), were studied. This enzyme was purified using ion exchange, filtration and high performance chromatographical steps, respectively. The enzyme was purified 41,2 times with a yield of 64%. SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 14,7 kDa under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single polypeptide chain. Furthermore, the enzyme had a optimal pH of 7,8 and was inhibited by PMSF, EDTA and glutation. In relation to its biologic activity, a Medium Hemolytic Doses (DH50) of 4,35µg/tube, Minimum Miotoxic Doses (MMD) of 18,96µg/ml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 91,5μg were obtained. For another hand, the PLA2 didn´t show either hemorrhagic or anticoagulant activities, and was recognized and partially inhibited by monovalent antilachesic serum (INS-Perú) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Using RT-PCR methodology and bioinformátics analysis the complete cDNA sequence of PLA2basicL.muta with 445 bp and an open reading frames of 414 nucleotides, were obtained, which encodes a peptide signal of 16 amino acids and a matured protein of 122 residues with 13, 86 kDa and a pI value of 8,3, calculated by in silico analysis. The amino acidic sequence contains conserved residues of His48, Asp49, Tyr52 in the catalytic site, as well as Tyr18, Gly30 y Gly32 in the Ca+2 -binding site. Three-dimensional model of PLA2basicL.muta showed that was conformed by three α-helix, one β-sheet and one Ca+2 -binding ribbon. PLA2basicL.muta shows a high structural homology with other snake venom phospholipases. Finally, studies reveal that PLA2basicL.muta belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49]. This work is the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom enzyme. Key words: Phospholipase A2, Isoenzyme, Lachesis muta, pharmacologic site, transcript.
Tesis

Expresa y purifica anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) en Escherichia coli y evaluar su capacidad para neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción pesada del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox, en ratones de laboratorio. Se analizaron 18 Nb expresados y purificados en E. coli para determinar su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica empleando ratones de laboratorio. Para esto se realizó un fraccionamiento del veneno de serpiente Bothrops atrox por cromatografía de exclusión molecular sobre resina Sephadex G-100 y se seleccionó una fracción de alto peso molecular con actividad hemorrágica. Se evaluó la dosis hemorrágica mínima (DHM) en el veneno crudo (0.810 μg) y en la fracción (0.433 μg) la cual representó 1.87 veces superior a la del veneno crudo; luego se evaluó la dosis eficaz 50% (DE 50) para cada Nb usando como dosis reto 4 DHM. Se encontró que 6 Nb tienen capacidad neutralizante además uno de ellos tiene una dosis eficaz 50% contra el efecto hemorrágico muy efectivo de 2247 μL de antiveneno/mg de veneno. También se evaluó la neutralización de la citotoxicidad de algunos Nb. Se concluye que algunos de los anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) obtenidos en este estudio, son capaces de neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente peruana B. atrox. Hay Nb que pueden ser usados para la formulación de un antídoto recombinante efectivo y económico.
Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Bothrops brazili conocida como “jergón shushupe” es una serpiente que habita en la selva amazónica del Perú y países vecinos. En el veneno de esta serpiente se ha encontrado una proteína con actividad hialuronato glicanohidrolasa o hialuronidasa. La purificación se realizó en dos pasos cromatográficos utilizando columnas de Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50. Se obtuvo una purificación de 33 veces con un rendimiento de 54,5 % y una recuperación de proteína activa equivalente a 1,66 %. Esta enzima es una proteína básica monocatenaria con un peso molecular de 110 kDa y pH óptimo fue de 5,5. La actividad enzimática a temperatura ambiente, después de 72 horas, se mantuvo en 50 % y fue completamente inactivada a las 192 horas. La actividad de la hialuronidasa se incrementó un 38,9 % por la adición de iones magnesio (150 mM), en tanto que el EDTA, el iodoacetato y el aminoácido glicina produjeron fuertes inhibiciones. La hialuronidasa de B.brazili (HBra) es muy antigénica formando una sola línea de precipitación frente al antiveneno polivalente (INS-Perú). Se concluye que esta enzima es un factor difusor del veneno por su acción en los procesos hemolíticos y hemorrágicos ensayados in vitro e in vivo. La proteína carece de toxicidad y fue neutralizada tanto por el antiveneno botrópico polivalente como el lachésico monovalente.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2010
Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:50:07Z No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5)
Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5)
Made available in DSpace on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5)
As serpentes corais pertencentes ao gênero Micrurus possuem uma peçonha rica em proteínas e peptídeos biologicamente ativos. No entanto, estudos bioquímicos e farmacológicos com os componentes desses venenos são escassos devido à grande dificuldade de coleta, manutenção em cativeiro das serpentes e a pequena quantidade de veneno obtida em cada extração. O presente estudo descreve o isolamento, a determinação da massa molecular e o seqüenciamento completo e parcial de algumas moléculas biologicamente ativas presentes no veneno de Micrurus frontalis. Os componentes foram purificados após vários passos de fracionamento em cromatografia líquida de fase reversa. A pureza e as massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massa de tipo MALDI-TOF e electrospray (ESI). As sequências de aminoácidos dos componentes nativos e dos peptídeos gerados após proteólise foram determinadas por degradação de Edman e sequenciamento De novo. Foram identificadas toxinas da família de três-dígitos, PLA2 e waprinas. As toxinas do tipo três dígitos receberam o nome de Frontoxinas (FTx) I a VI. As FTx I, II, III e VI possuem 4 ligações dissulfeto conservadas e são estruturalmente similares às ?-neurotoxinas de cadeia curta. Já as FTx IV e V apresentaram alta similaridade com ?-neurotoxinas de cadeia longa, com 10 resíduos de cisteína conservados. Quando aplicadas em junção neuromuscular de rã, as FTx II, III e IV reduziram a amplitude dos potenciais de ação em miniatura de maneira tempo- e concentração-dependente, sugerindo que essas FTxs bloqueiam os receptores nicotínicos de acetilcolina. As PLA2 foram identificadas após o sequenciamento de fragmentos, os quais apresentaram alta similaridade com PLA2 de elapídeos. Uma nova família de proteínas ofídicas, a waprina, foi encontrada na peçonha de M. frontalis. Esta toxina, pouco abundante no veneno, possui quatro ligações dissulfeto conservadas e recebeu o nome de Miwaprina, em virtude da alta identidade com waprina de Naja nigricollis. As FTx I, V, VI, as PLA2s e a Miwaprina, não foram submetidas à testes biológicos devido à quantidade insuficiente de amostra purificada. Este trabalho corresponde ao primeiro estudo de caracterização da estrutura primária e biológica de componentes isolados a partir do veneno de M. frontalis, abrindo perspectivas não só para a identificação dos demais componentes, como também do provável papel dos mesmos na captura de presas e nos envenenamentos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT
Coral snakes (Micrurus genus) venoms contain a wide spectrum of biologically active proteins and peptides. The major obstacle to study Micrurus venoms is the small amount of material that can be collected. Therefore, the biochemistry and pharmacology of components from coral snakes venoms are mostly unknown. In this study we describe the isolation, molecular mass determination, complete and partial amino acid sequencing of short and long -chain three-finger toxins, PLA2 and waprin isolated from Micrurus frontalis venom. Components were purified using multiple steps of RP-HPLC. Molecular masses were determined by MALDI-TOF and ESI ion-trap mass spectrometry. The amino acid sequences of toxins were determined by sequencing of overlapping proteolytic fragments by Edman degradation and by De novo sequencing. The three-finger toxins were named Frontoxin (FTx) I-VI. The amino acid sequences of FTx I, II, III and VI predict 4 conserved disulphide bonds and structural similarity to previously reported short-chain -neurotoxins. FTx IV and V each contained 10 conserved cysteines and share high similarity with long-chain - neurotoxins. At the frog neuromuscular junction FTx II, III and IV reduced miniature endplate potential amplitudes in a time-and concentration-dependent manner suggesting Frontoxins block nicotinic acetylcholine receptors. Fragments of isolated PLA2 were determined and share high similarity scores with PLA2 from other Elapids. The waprin member possesses four conserved disulfide bonds and showed high identity with waprin from Naja nigricollis venom. Because of the significant sequence similarity with WAPs, the molecule was named Miwaprin. Due the insufficient amount of purified FTx I, V, VI, PLA2s and Miwaprin, these toxins were not submitted to the biological assays. These are the first complete primary structure characterization of M. frontalis snake venom toxins.

La serpiente Bothrops atrox, la mayor responsable de los accidentes ofídicos en el Perú, desencadena una fisiopatología por envenenamiento que se ve caracterizada en gran parte por la miotoxicidad. Por ello, en la presente tesis se ha aislado al componente responsable de la miotoxicidad del veneno de B. atrox para estudiar sus principales características biológicas e inmunológicas. La proteína fue purificada en un paso cromatográfico, empleando una resina CM-Sephadex C-25, mediante una gradiente de NaCl 0.6 M. El análisis por SDS-PAGE, mostró una sola banda de aproximadamente 13 kDa bajo condiciones reductoras, mientras que una banda ancha de 24 kDa fue observada bajo condiciones no reductoras. La proteína aislada mostró actividad enzimática de fosfolipasa A2, tanto para retardo de coagulación de yema de huevo como para el ensayo espectrofotométrico de fosfatidilcolina. En cuanto a su dosis miotóxica mínima, esta fue 12.30±0.95 µg, mientras que para el veneno total, el valor fue 23.50±1.09 µg. La dosis edemática mínima fue de 26.00±1.15 µg. Además, la enzima presento actividad anticoagulante. Por otro lado, se logró obtener un suero anti-miotoxina de B. atrox, producido en conejos, con un título de 16 000. Al realizar los ensayos de neutralización del suero anti-miotoxina, un suero anti-B.atrox y el suero antibotrópico del INS, se obtuvieron como dosis efectiva media 0.34 mL de suero/mg de miotoxina, 0.93 mL de suero/mg de miotoxina y 0.1 mL de suero/mg de miotoxina, respectivamente. Finalmente, los anticuerpos anti-miotoxina reaccionaron de forma cruzada con los venenos de B. atrox (1:8000), Bothrops brazili (1:10 000), Bothrops pictus (1:4000) Lachesis muta (1:2000) y Crotalus durissus (1:1000). De esta forma, se logró purificar y caracterizar funcionalmente una fosfolipasa miotóxica del veneno de B. atrox, así como obtener anticuerpos a partir de esta para obtener más información acerca de su inmunogenicidad.
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. PCONFIGIB-17101271.
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. PCONFIGI-B18100081
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). N°168-FONDECYT-2017

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Logra aislar el mRNA que codifica la proteína PLA 2, utilizando una técnica simple. Esto es, amplificando el cDNA que codifica la PLA 2 D49 a través de RT-PCR. El análisis del cDNA codificador de PLA 2 muestra que esta tiene un marco de lectura abierto de 414 pares de bases que codifican un polipéptido de 138 aminoácidos, con un péptido señal de 16 residuos de aminoácidos, seguido de una secuencia polipeptídica de 122 aminoácidos que corresponden a la PLA 2. El análisis también muestra que la proteína está compuesta por 33 aminoácidos con carga: 11 aminoácidos ácidos, 22 aminoácidos básicos, 44 aminoácidos polares y 28 aminoácidos hidrofóbicos, con un punto isoeléctrico de 8.58 y una masa molecular de 14312.52 Da. El análisis de homología y árbol filogenético muestran que esta PLA 2 presenta un alto grado de homología y forma parte de las PLA 2 básicas N6F24D49. Además, se logró purificar dos isoformas de PLA 2 (fracciones V y VI) empleando cromatografía en HPLC de fase reversa con un alto grado de pureza, según lo revelado por la SDS-PAGE. Al realizar la repurificación de la fracción V, esta se muestra como un monómero, pues el espectro revela la presencia de una sola cadena polipeptídica con una masa molecular de 14238.71 Da. Según el análisis biológico, la PLA 2 V es capaz de elevar los niveles de CK plasmáticos cuando es inyectada por vía intramuscular y por vía intravenosa.
Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Purifica la isoforma ácida presente en el veneno de Bothrops pictus mediante el uso de dos pasos cromatográficos: CM Sephadex C-50 seguido de Superdex 75 10/300 GL, lográndose un rendimiento de 7.5% y un factor de purificación de 19.8 veces. Se obtiene una sola banda con un peso molecular de 16.6 kDa en condiciones reductoras y 15.2 kDa en condiciones no reductoras empleando la técnica de PAGE-SDS. Se determina el peso molecular en solución mediante la técnica de dynamic light scattering obteniéndose una única población de proteínas monodispersa de radio hidrodinámico de 4.254 ± 0.778 (nm) correspondiente a un peso molecular de 19.7 ± 3.7 kDa. La enzima BpicPLA2ácida es altamente termoestable debido a que mantiene casi intacta su actividad incluso después de incubarla por 10 min a 100 ⁰C. El ion que incrementa en mayor medida su actividad es el calcio y el agente con mayor inhibición es el ditiotreitol. Los estudios de dicroísmo circular demostraron que la estructura secundaria predominante en la BpicPLA2ácida son las α hélices. La secuencia de aminoácidos de BpicPLA2ácida tomada del GenBank muestra la presencia de un sitio catalítico (His48, Asp49, Tyr52 y Asp99) conservado, mientras que el sitio de unión a calcio no es completamente conservado, debido a una mutación en la posición 28 de la tirosina por fenilalanina. El modelo de la estructura tridimensional reportado, demuestra que la isoforma BpicPLA2ácida es una enzima que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 de la clase II y que además presenta una mayor relación evolutiva con otras PLA2 ácidas.
Tesis

Neste trabalho avaliamos se as Natterinas (NTR), proteínas majoritárias presentes no veneno do peixe peçonhento T. nattereri, são as responsáveis pela a ação inibitória do recrutamento de leucócitos durante a inflamação e os mecanismos moleculares envolvidos neste processo. Utilizando análises de microscopia intravital tratamos os animais com as NTR e 6 h depois induzimos o rolamento de leucócitos com KC, LPS ou agonista de PAR-4 sobre a microcirculação. Os dados mostraram que o tratamento com as NTR inibem o rolamento e a migração de leucócitos induzido pela KC e pelo LPS. Além disso, o efeito inibitório das NTR depende parcialmente da sua atividade proteásica e não está relacionado com a clivagem proteolítica da quimiocina KC ou com a indução de reguladores endógenos como IL-10, corticóides, a enzima HO-1 ou IL-1Ra. O efeito inibitório parece ser dependente da ativação da sinalização TLR/MyD88 e PI3K e das proteínas serina/treonina fosfatases, contribuindo de forma significativa na sobrevida de animais induzidos a endotoxemia por LPS.
In this work we evaluated whether Natterins (NTR) the majority proteins present in the venom of Thalassophryne nattereri venomous fish are responsible for the inhibitory action of leukocyte recruitment during inflammation and the molecular mechanisms involved in this process. Using intravital microscopy analysis we treated the animals with NTR and 6 h after we induced the leukocyte rolling by topical of KC, LPS or agonist of PAR-4 on the microcirculation. The data showed that treatment with NTR inhibited the leukocyte rolling and migration induced by LPS and KC. Moreover, the inhibitory effect of NTR depends partly on its proteinase activity and is not related to the proteolytic cleavage of the chemokine or KC nor with the induction of endogenous regulators such as IL-10, corticoids, the HO-1 or IL-1Ra. The inhibitory effect is dependent on the activation of PI3K and TLR/MyD88 signaling and protein serine/threonine phosphatases, contributing significantly to the survival of animals endotoxemia induced by LPS.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Estudia la variabilidad en las características bioquímicas y biológicas de venenos de ejemplares de B. atrox procedentes de los departamentos de Amazonas, Ucayali y Junín. A los venenos se les realizó el análisis del contenido proteico y el número de bandas por PAGE-SDS, así como las actividades de fosfolipasa A2, hemolítica indirecta, amidolítica, coagulante, hemorrágica y proteolítica sobre caseína y mediante zimografía; además se hicieron ensayos de inmunodifusión y neutralización in vitro con el suero antibotrópico polivalente del INS-Perú. Las actividades amidolítica, coagulante, y proteolítica mediante zimograma, evidenciaron variabilidad tanto entre muestras de diferentes regiones como dentro de una misma región. La actividad fosfolipasa A2 y hemolítica indirecta evidenciaron una mayor actividad en los venenos de Amazonas y una menor en los venenos de Junín. En los demás ensayos no se observaron diferencias resaltantes en las características del veneno. Con respecto a las pruebas de neutralización, ½ dosis del antiveneno fue suficiente para neutralizar con eficacia las actividades coagulante y fosfolipasa A2 de todos los venenos. Nuestros resultados indican que algunas de las propiedades del veneno de la serpiente B. atrox son variables, sin que ello afecte la capacidad neutralizante del suero antibotrópico polivalente producido por el INS.

Expone que se ha purificado la lectina verdadera aislada del veneno de Lachesis muta y se han determinado sus propiedades bioquímicas y biológicas. La purificación se logró utilizando como único paso cromatográfico una columna de DEAE-Sephadex A-50. La proteína no enzimática fue reconocida debido a su capacidad para aglutinar glóbulos rojos humanos. La purificación obtenida fue de 3,6 veces y la lectina representó el 3,5 % respecto a la proteína total. El análisis por PAGE-SDS, demostró que la lectina de L. muta tiene un peso molecular de 27,5 kDa en su forma dimérica y 14,3 kDa en su forma monomérica. La lectina tuvo mayor afinidad por la lactosa, seguida de galactosa, arabinosa, sacarosa y glucosa. Por otro lado, no puede reconocer residuos de maltosa, manosa ni fructosa. La lectina de L. muta ha sido clasificada dentro de las lectinas tipo C debido a que fue inhibida por EDTA, DTT y 2β-ME y la inhibición causada por 0,125 - 0,5 mM de EDTA fue anulada por los iones calcio, magnesio y manganeso. Se trata de una proteína estable al pH y a la temperatura, ya que se une a los glóbulos rojos a diferentes valores de pH (4 a 9) y tolera temperatura desde 30 hasta 70 °C. Por último, se trata de un componente no tóxico para ratones albinos, no interviene en la coagulación sanguínea, pero es reconocida por el antiveneno lachésico monovalente (INS, Lima-Perú) y por lo tanto, antigénica.
Tesis

Las PLA2s homólogas (también conocidas como miotoxinas Lys49 o PLA2s K49) son las principales miotoxinas en los venenos de las serpientes del género Bothrops a pesar de presentar nula o ínfima actividad catalítica. En este trabajo, se identificaron tres nuevos transcritos codificantes de las PLA2s homólogas K49 en venenos de las especies Bothrops pictus (“jergón de la costa”), Bothrops brazili (“jergónshushupe”) y Bothrops atrox (“jergón de la selva”) que habitan en el Perú y se clonaron en células de Escherichia coli. Como primer paso, el RNA total fue aislado de venenos frescos y liofilizados, así como de tejido glandular. El rendimiento del RNA obtenido fue aproximadamente 5.0 ng/mg de veneno y 40.0 ng/mg de glándula. La cantidad y calidad de los transcritos fueron suficientes para la eficiente síntesis y amplificación del cDNA. La secuencia aminoacídica deducida de los transcritos se compone de 121/122 residuos de ~ 14.0 kDa y posee un punto isoeléctrico teórico (pI) de ~ 9.0. Los homólogos de PLA2 identificados en B. pictus, B. brazili y B. atrox se nombraron como pictoxina, brazilixina y batroxina, respectivamente, los cuales fueron clonados en células deE. coli TOP10 dentro del vector pCR2.1-TOPO con una eficiencia de transformación de 2.9 x 109 UFC/µg de DNA plasmídico. En relación con estudios transcriptómicos, la batroxina es una variante poblacional en venenos peruanos de una miotoxina encontrada en venenos brasileños con una única mutación nucleotídica que origina la sustitución D13E. La pictoxina corresponde a la PLA2 básica detectada previamente en el veneno de B. pictus. La brazilixina se diferencia considerablemente de otras miotoxinas encontradas en el veneno de B. brazili; por lo que es propuesta como una nueva proteoforma. Asimismo, las tres miotoxinas presentan mutaciones peculiares a nivel de la región C- terminal, loop de unión a calcio e interfaces proteína-membrana y proteína-proteína. Este es el primer estudio de clonación de las PLA2 básicas del género Bothrops de Perú y constituye el cimiento para dar inicio a las actividades de la tecnología recombinante para una caracterización funcional con miras a su aplicabilidad.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). N° 168-FONDECYT-2017
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. B17100041, 19100184

Orientadores: Maria Alice da Cruz-Hofling, Lea Rodrigues-Simioni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-07-24T21:59:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_PatriciaDourado_M.pdf: 12162774 bytes, checksum: bc20d738d02786ba6422eeb6cadaf073 (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: Várias são as motivações que levam ao estudo de substâncias naturais podendo ser citadas, a caracterização dos seus princípios ativos e dos seus efeitos biológicos. Dentre estas, ocupam lugar de destaque os venenos ofídicos, uma vez que é freqüente o envenenamento acidental causado por picada de serpentes, nos países de clima tropical. No Brasil, os acidentes ofídicos representam problema de Saúde Pública, sendo o gênero Bothrops responsável por cerca de 90% dos casos. Dentre os efeitos sistêmicos e locais, destaca-se a mionecrose que se manifesta rapidamente, é de difícil controle e merece atenção especial nas estratégias de tratamento. A mionecrose é provocada por proteínas miotóxicas que atuam especificamente no sítio da picada. Frente à escassez de estudos quanto à ação biológica do veneno da serpente Bothrops pirajai ("jararacussu da Bahia") uma espécie rara e exclusiva do estado da Bahia e nordeste de Minas Gerais, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de investigar as possíveis atividades miotóxica e neurotóxica do seu veneno total e de suas frações isoladas, Piratoxina-I (prTX- I) e Piratoxina-III (PrTX-III). Para o estudo, foram utilizadas preparações neuromusculares, nervo frênico-diafragma (NFD) e extensor longo dos dedos (EDL) de camundongos. Os parâmetros utilizados foram a técnica miográfica, a determinação de creatinoquinase (CK), análise histológica e ultraestrutural. O veneno total e a fração PrTX-III nas doses de 10, 25 e 50 µg/ml causaram bloqueio dose-dependente da resposta contrátil do músculo EDL, alterações morfológicas e ultraestrututais com elevada liberação da enzima creatinoquinase (CK) na cuba. A miotoxina PrTX-I provocou bloqueio dose-dependente (doses de 5, 10 e 20 µg/ml) da resposta contrátil do músculo diafragma de camundongo e severa mionecrose constatada pela análise histológica do tecido. No entanto, esta fração não provocou alterações miográficas ou histológicas no músculo EDL. Essas diferenças quanto à sensibilidade foram provavelmente devidas às diferenças entre o EDL e o diafragma, que diferem quanto às quantidades de fibras de contração rápida e lenta. Nossos resultados sugerem que a miotoxina PrTX-I e a fração PrTX-III do veneno total de B. pirajai seriam os componentes responsáveis pela atividade miotóxica do veneno, muito embora haja evidência de que seus modos de ação podem ser distintos. Além disso, os resultados preliminares com a fração PrTX-III apontam para uma potente ação neurotóxica, fato observado também com o veneno total.
Abstract: Several reasons can be cited which motivate the study of natural substances such as the characterization of the active principles and its biological effects. Among them, the ophidic venoms stand out because it is common the occurrence of accidental envenomation after snake bites in tropical countries. In Brazil, ophidic accidents account for a major part in the context of Public Health were the genus Bothrops is responsable for about 90% of them. Myonecrosis is one ofthe local effects whose rapid onset is difficult to control and deserves special attention in the treatment approaches after envenomation. Myonecrosis is triggred by myotoxic proteins specifical1y acting in muscle fibers at the bite site. Due to the scarcity of studies about the biological actions of Bothrops pirajai (li jararacussu of Bahia") snake venom, arare and exclusive specimen living in Bahia and northeastrn of Minas Gerais, the present work was proposed viewing to investigate miotoxic and neurotoxic activities of crude venom and its fractions Piratoxin-I (PrTX-I) and Piratoxin-III (PrTX-III). The studies were performed in mice isolated muscle preparations of the extensor'digitorum longus (EDL) and phrenic nerve-diaphragm (PND) muscles through myographic, histological and ultrastructural analysis and determination of creatinokinase (CK) in the incubation bath. The venom and the fraction PrTX-III (10, 25 and 50 µg/ml) caused a dose-dependent twitch-tension blockade of the EDL muscle fibers, histological and ultrastructural changes of muscle cells and nerve endings culminating in complete necrosis of both and increased CK release in the bath. PrTX-I caused a dose dependent blockade (5, 10 and 20 µg/ml) onhe twitch tension in PND muscle fibers and severe myonecrosis. However, PrTX-I did not affect muscle fibers nor caused alter(!.tions on the twitch tension responses in EDL. These differences could be accounted for a distinct sensitivity of EDL and PND muscle fibers to the venom and PrTX-I possibly related to the amount of slow- and fast-contracting fibers present in each one. Our results suggest that PrTX-I and PrTX-III of B. pirajai venom would be the components accounting for the myotoxic activity of venom despite a distinct mechanism of action could be implied. Additionally, these preliminary results suggest a potent neurotoxic activity, also observed with the whole venom.
Mestrado
Farmacologia
Mestre em Ciências

Orientador: Sergio Marangoni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-04T01:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_DanieladeOliveira_D.pdf: 11046039 bytes, checksum: b59847c8c17a448c14ff005914cccd57 (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: Nesta tese foram apresentados os resultados da purificação de várias proteínas biologicamente ativas do veneno de serpentes crotálicas (CrotaJus durissus temfjcus, Crotalus durissus cascavel Ia, Crotalus durissus ruruima e CrotaJus durissus colliJineatus); botrópica (Bothrops pirajal) e coral (Mícrurus dumerilíi carínícauda). Muitas destas frações foram purificadas e caracterizadas do ponto de vista biológico, bioquímico e farmacológico. FraçOes como: crotamina, fosfolipase A2 (PLA2), crotapotinas e outras mostraram uma significativa atividade antibacteriana contra bactérias frtopatogênicas e patogênicas. As análises ultraestruturais e outros dados bioquímicos indicam que estas frações exercem essa atividade de formas diferenciadas. Foram observados quatro mecanismos de ação: 1.interação das frações com a membrana bacteriana, induzindo a ruptura e desorganização da mesma com posterior lise celular, 2. desorganização citoplasmática através da entrada das frações por poros na membrana causando lise celular, 3. digestão da membrana com posterior extravasamento do conteúdo interno bacteriano com lise celular, 4.1ise da membrana através dos radicais livres gerados pela reação enzimática do veneno com a membrana bacteriana. Durante o desenvolvimento da tese foram publicados e submetidos à publicação os seguintes artigos: 1.0liveira et aI., 2002 apresentaram o fracionamento do veneno de CrotaJus durissus terrificus em HPLC de fase reversa, com obtenção das frações: crotapotinas (F5 e F7) e PLA2 (F15, F16 e F17). As frações apresentaram atividade antibacteriana contra Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. A fração F17 apresentou atividade anticoagulante e foi seqüenciada apresentando uma homologia estrutural com outras PLA2 em tomo de 60-90%. Sua massa molecular de 14,6kDa foi determinada através de tricina SDS-PAGE, eletroforese de duas dimensões e MALDI TOFF. 2. T oyama at aI., 2003 verificaram a atividade enzimática, neurotóxica e antibacteriana da fração PLA2 (F15) isolada do veneno de CrotaJus dirissus teTTificus. 3.0liveira et aI., 2003 isolaram, purificaram, seqüenciaram a fração crotapotina, um componente ácido da crotoxina do veneno de Crotalus duríssus cascavel Ia, e realizaram testes para verificar a atividade antibacteriana em bactérias fitopatogênicas Gram-positivas e Gram-negativas, além de testes inflamatórios e nefrotóxicos. 4.Havt et aI., 2005 isolaram uma nova lectina tipo C (BPL) de Bothrops pirajai que foi caracterizada biológica e bioquimicamente. Esta fração também mostrou um efeito nefrotóxico em perfusão em rins isolados de ratos. 5. Toyama et al.,2004 isolaram, purificaram e caracterizaram bioquimicamente uma nova crotamina símile do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Foram identificados os peptídeos biologicamente ativos da crotamina, os quais foram responsáveis pela estimulação de secreção de insulina. . 6.Gandhi et aI., 2004 purificaram uma nova lectina tipo C (crotacetin), obtida do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Esta nova lectina induziu a agregação plaquetária, a aglutinação eritrocitária e também mostrou uma atividade antibacteriana. 7. Cavada et aI., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova lectina da semente de Lonchocarpus sericeus, com alta especificidade por N-acetilglicosamina. 8. Cháriston et ai, 2004 isolaram e determinaram a estrutura primária de uma nova PLA2 de Micrurus dumerilli carinicauda. 9.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova isoforma da crotamina do veneno de Crotalus durissus ruruima e mostraram seu efeito antibacteriano. 10.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova PLA2 do veneno de Crotalus durissus collilineatus. Nestes trabalhos foram determinadas as regiões moleculares responsáveis pela atividade antibacteriana. 11. Toyama et a/., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova L-amino oxidase do veneno de Crotalus durissus cascavel Ia (Casca LAO) através de exclusão molecular e HPLC de troca iônica. Casca LAO apresentou uma grande inibição bacteriana em bactérias Gram-negativas (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae) e Gram-positivas (Streptococcus mutans). Os estudos destas frações apresentam perspectivas futuras na aplicação terapêutica, como agentes antibacterianos, de novos peptídeos sintéticos ou naturais
Abstract: In this dissertation we present the results of purification of several biologically active protein from the crotalic rattlesnake venom (Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavel/a, Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus collilineatus); from bothropic (Bothrops piraja) and coral (Micrurus dumerilli camicauda). Many of these fractions were purified and biochemical, biologically and pharmacologically characterized, some were reported and other submitted for publication in specialized joumals. Some fraction as crotamine, phospholipase A2 (PLA2), crotapotins and other showed a significant antibacterial activity against phytopatogenical and pathogenic bacterium. Ultra structural and biochemical analyses suggest that this fraction exert this antibacterial activity by different ways, which are grouped according to the mode action into four different mechanisms: 1.interaction of some fractions with the bacterial membrane inducing cellular Iyses by membrane rupture and disorganization. 2. Bacterial cell Iyses by action of fraction from the venom that form pore on the membrane and consequently cytoplasmatic disorganization and membrane rupture. 3. Membrane cell digestion induced by protein from the venom and consequently lost of cytoplasmatic content and cellular Iyses. 4. Membrane cel! Iyses induced by free radical generated by enzymatic action of protein form the venom. During the development of this thesis we reported and submitted some articles listed below: 1. Oliveira et aI., 2002 presents the purification of crotapotins (F5 and F7) and PLA2 (F15, F16 and F17)from the Crotalus durissus terrificus venom by reverse phase HPLC. These fraction showed significant antibacterial activity against Xanthomonas axonopodis pv. Passiflorae. Fraction F17 also showed an anticoagulant activity and its amino acid sequence showed high amino acid sequence identity with.60-90% with other PLA2 from different sources. Its molecular mass was 14,6kDa determined by Tricine PAGE-SDS, two dimensional electrophoresis and MALDI TOFF. 2. Toyama et aI., 2003 showed the enzymatic, neurotoxic and antibacterial activities of PLA2 isoform (F15) from the Crotalus durissus terrificus venom. 3. Oliveira et aI., 2003 isolated, purified and determined the amino acid sequence of crotapotin fraction, an acid compound of crotoxin from the Crotalus durissus cascavel/a, and detennined its antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative phytopathogenic baderium, intlammatory and nephrotoxicity. 4. Havt et aI., 2005 isolated a new type C-Iectin (SPL) trom the Bothrops pirajaithat was biologically and biochemical characterized. This fraction also showed a nephrotoxic effect on the isolated perfused kidney. 5. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized biochemical a new crotamine like from Crotalus durissus cascavella venom. In this work we identified the biologically active peptide from this crotamine, which were responsible for increasing insulin secretion. 6. Gandhi et aI., 2004 purified a new lectin type C (crotocetin) trom the Crotalus durissus cascavella venom. This lectin induced platelet aggregation, erythrocyte agglutination and also showed an antibacterial activity. 7. Cavada et aI., 2004 purified and characterized a new lectin from the Lonchocarpus serieus seed that showed high specific binding against N-acetyl glucosamine. 8. Cháriston et aI., 2004 isolated and determined the amino acid sequence of new PLA2 from Micrurus dumerilli carinicauda. 9. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized a new crotamine isofonn from the Crotalus durissus ruruima venom and showed its antibacterial activity. 10. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and charaderized a new PLA2 trom the Crotalus durissus collilineatus venom. In this work we determined the molecular region of the PLA2 responsible for the antibacterial activity. 11. Toyama et aI., 2004 purified and characterized a new L-amino acid oxidase from the Crotalus durissus cascavella whole venom (Casca LAAO) by molecular exdusion and cation exchange HPLC. Casca LAAO inhibited strongly the bacterial growth rate of Gram-negative (Xanthomonas axonopodis pv passiflorae) and Gram-positive (Streptococcus mutans). These studies presented here showed a future perspective to therapeutic application of these peptides, synthetical/y or natural/y obtained as potential antibacterial substances
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2018-09-28T18:12:13Z No. of bitstreams: 2 Marilia_Favalesso_2018.pdf: 1901703 bytes, checksum: 0d9b6ae60903ec7aa858792cf86a51f2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)
Made available in DSpace on 2018-09-28T18:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Marilia_Favalesso_2018.pdf: 1901703 bytes, checksum: 0d9b6ae60903ec7aa858792cf86a51f2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-19
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Lonomia obliqua Walker 1855 (Saturniidae: Hemileucinae) is a species of moth of sanitary interest in Brazil. Their larvae are etiological agents of lonomism, a form of erucism caused by the contact of the human beings with the stinging structures of the species. The most worrying symptoms of lonomism are the systemic hemorrhagic conditions that can lead to several outcomes, including death. The first official notifications of accidents with the species date back to the end of the 80s, in the state of Rio Grande do Sul. Since then, several accidents have been documented in Brazil, mainly in the south and southeast regions of the country. With the increase in the number of victims, health authorities in the state of São Paulo, represented by the “Instituto Butantã”, developed an anti-lonomic serum, which is distributed by the Ministry of Health in places with a higher prevalence of accidents. Hypotheses have been raised on the relation between the growth of the cases of lonomismo and the human occupation; however, little is known about the spatial distribution and ecological aspects of the species to enable the testing of these hypotheses. In view of the above, the present study aimed to produce a map for the potential geographical distribution of L. obliqua in Brazil, based on the combination of different ENM (Ecological Niche Modeling) algorithms. A total of 38 occurrence points were distributed across the geographic area of Brazil and Misiones, Argentina, which were partitioned for calibration and evaluation of the distribution model. Eight continuous climatic variables and only 16 previously considered variables were selected. Different ENM methodologies were tested and compared to TSS (True Skill Statistic) index values. The final model-map was composed of a combination of four algorithms (Gower, Mahalanobis, Maxent and SVM), with pseudo-absences outside a bioclimatic envelope and a number of pseudo-absences equal to that of presences. This model map was binarized from the Low Presence Threshold (LPT) and cut only for Brazil. According to this model map, the areas predicted as suitable for L. obliqua would be restricted to latitudes ~12° and ~32°, and longitudes ~39° and ~57°. When evaluating new sites of occurrence of the specie in Rio Grande do Sul, it was possible to verify that all the municipalities were in areas predicted by the model-map. A characterization of the abiotic variables related to the niche of the specie was also carried out, being these extracted from the area predicted as adequate the presence of the specie in the model map. To help characterize these variables, we also extract categorical descriptors of climate, soil and vegetation (in %). The percentage of land use classes was also extracted in order to contribute to the hypothesis that condition the increase of accidents due to human occupation. In this question, we find a large part of the area predicted within classes of agricultural soils in Brazil, which leads us to ratify the current hypotheses. Thus, the loss of habitat of the species for the agricultural enterprises increases the human contact with the specie, which should increase the number of notifications of the lonomism, generating greater epidemiological concern and habitat conservation for this specie.
Lonomia obliqua Walker 1855 (Saturniidae: Hemileucinae) é uma espécie de mariposa de interesse sanitário no Brasil. Suas larvas são agentes etiológicos do lonomismo, uma forma de erucismo causado pelo contato dos seres humanos com as estruturas urticantes da espécie. Os sintomas mais preocupantes do lonomismo são os quadros hemorrágicos sistêmicos que podem conduzir a diversos desfechos, inclusive o óbito. As primeiras notificações oficiais de acidentes com a espécie datam do final da década de 80, no estado do Rio Grande do Sul. A partir de então, diversos acidentes têm sido documentados no Brasil, principalmente nas regiões sul e sudeste do país. Com o aumento do número de vítimas, autoridades sanitárias do estado de São Paulo, representadas pelo do Instituto Butantã, desenvolveram um soro antilonômico, o qual é distribuído pelo Ministério da Saúde em localidades com maior prevalência de acidentes. Hipóteses têm sido levantadas sobre a relação entre o crescimento dos casos de lonomismo e a ocupação humana; contudo, pouco se conhece sobre a distribuição espacial e aspectos ecológicos da espécie para possibilitar os testes destas hipóteses. Diante do exposto, o presente estudo objetivou produzir um mapa para a distribuição geográfica potencial de L. obliqua no Brasil, baseando-se na combinação de diferentes algoritmos ENM (Ecological Niche Modeling). Foram utilizados 38 pontos de ocorrência distribuídos pela área geográfica do Brasil e região de Misiones, na Argentina, os quais foram particionados para calibração e avaliação do modelo de distribuição. Foram selecionadas oito variáveis contínuas climáticas e de solo entre 16 previamente cogitadas. Diferentes metodologias ENM foram testadas e confrontados quanto a valores de índice TSS (True Skill Statistic). O mapa-modelo final foi composto por uma combinação de quatro algoritmos (Gower, Mahalanobis, Maxent e SVM), com amostragens de pseudo-ausências fora de um envelope bioclimático e número de pseudo-ausências igual ao de presenças. Esse mapa-modelo foi binarizado a partir do limiar LPT (Lowest Presence Threshold) e recortado somente para o Brasil. Segundo este mapa-modelo, as áreas preditas como adequáveis a L. obliqua estariam restritas as latitudes ~12º e ~32º, e as longitudes ~39º e ~57º. Também foi realizada uma caracterização das variáveis abióticas relacionadas ao nicho da espécie, sendo essas extraídas da área predita como adequada a presença da espécie no mapa-modelo. O percentual de classes de uso da terra também foi extraído, a fim de contribuir com as hipóteses que condicionam o aumento de acidentes em função da ocupação humana. Neste quesito, encontramos grande parte da área predita dentro de classes de solos agrícolas no Brasil, o que nos leva a ratificar as hipóteses atuais. Assim, a perda de habitat da espécie para os empreendimentos agrícolas aumenta o contato humano com a espécie, o que deve aumentar o número de notificações do lonomismo, gerando maior preocupação a nível epidemiológico e de conservação de habitat para essa espécie.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes
Banca: Pedro de Magalhães Padilha
Banca: Leonardo de Castro Palmieri
Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) de veneno de serpente são uma das principais toxinas responsavéis pela miotoxicidade e necrose muscular observadas nos acidentes ofídicos. Essas toxinas podem ser separadas em Asp49-PLA2s, cujo mecanismo é catalítico e dependente de cálcio, e as PLA2s homólogas, cuja estrutura é semelhante, porém atividade em mecanismo não catalítico e independente de cálcio. Apesar de os detalhes deste mecanismo não serem bem conhecidos, estudos funcionais ressaltam importância da região do C-terminal e estudos cristalográficos propõem, mais especificamente, um sítio miotóxico composto por resíduos básicos e um hydrophobic knuckle composto por hidrofóbicos, ambos situados na região C-terminal da toxina. O presente trabalho tem objetivo de oferecer mais detalhes acerca do mecanismo de ação miotóxico independente de cálcio. Para tanto, realizamos estudos cristalográficos com miotoxinas botrópicas BthTX-II (uma Asp- PLA2s), BthTX-I e PrTX-I (duas PLA2s homólogas), em presença de íons relevantes para suas atividades. Recentemente, foi demonstrado que íons, tal como manganês, cálcio, zinco entre outros, interferem na atividade biológica de PLA2s e PLA2s homólogas. Assim, estudo cristalográfico da PrTX-I e BthTX-I com íons manganês e zinco foram elucidados no estado nativo e complexado. Experimentos in vivo indicam que tais íons promoveriam efeito inibitório da miotoxicidade. Enquanto os íons manganês não foram localizados no modelo cristalográfico, os íons zinco foram identificados interagindo apenas no modelo nativo com uma His48 e com as His120 de ambos monômeros. Estudos comparativos destas estruturas com a PrTX-II (PLA2s homóloga) com ácidos graxos foi desenvolvido e guiaram para elaboração de nova hipótese do mecanismo de ação independente de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venom are among the main toxins responsibles for miotoxicity and muscular necrosis observed in offidic accidents. These toxins can be separated in Asp49-PLA2s, whose catalytic mechanism of action is dependent of calcium, and in homologue PLA2s or PLA2s-like, whose terciary structure is similar, although its activity is not catalytic in a calcium independent mechanism of action. Despite the fact that this calcium independent mechanism is not well known, functional studies highlight the C-terminal region and structural studies points to a myotoxic site, composed by basic residues, and a hydrophobic knuckle, composed by aromatic and hydrophobic, in the C-terminal region. The present study aims to gather more knowledge about this myotoxic calcium independent mechanism of action. For this purpose, the botropic myotoxins BthTX-II (an Asp49- PLA2), BthTX-I and PrTX-I (homologue PLA2s) were studied in the presence of divalent ions by Xray crystallography. Recently, it was demonstrated divalent ions, such as manganese, zinc and calcium, interfere with the biological activity of these toxins. The crystallographic structure of PrTX-I and BthTX-I with manganese and zinc ions in a native and complexed form were elucidated. In vivo studies demonstrated that these ions inhibit the myotoxic activity of these proteins. Although manganese ions were not found in the structures, zinc ions were found interacting with His48 and the C-terminal residue His120. Comparative studies of this structure and PrTX-II (a homologue PLA2) complexed with stearic acid were performed and support a new hypothesis for the myotoxic mechanism of action for homologue PLA2s which includes both myotoxic site and hydrophobic knuckle and, for the first time, His120. Differently from most PLA2s of snake venom... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Las fosfolipasas A2 (PLA2) del veneno de las serpientes, son enzimas con una variedad de efectos biológicos, los cuales son atribuídos a sus diferentes isoformas ácidas y básicas. Algunas son: anticoagulantes, miotóxicas o neurotóxicas, siendo la miotoxicidad uno de los efectos más graves. Además, el clonamiento y expresión de una proteína recombinante es una herramienta importante para entender la estructura-función de una proteína, por ello, el objetivo de la presente investigación fue purificar, caracterizar y evaluar la actividad miotóxica de una isoforma nativa de PLA2 ácida (denominado BaPer-PLA2a) de B. atrox así como clonar y expresar su forma recombinante. Para ello, se purificó la proteína nativa en tres pasos cromatográficos usando DEAE-Sephadex-A50, Sephadex-G75 y un sistema cromatográfico automatizado líquido de presión media (MPLC). La enzima BaPerPLA2a tuvo una actividad específica de 34.1 U/mg y un peso molecular de ~14.5 kDa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Asimismo, se aisló el RNA total para la síntesis de cDNA y se obtuvo una longitud de 372 pb. Se dedujo de la secuencia de cDNA una proteína madura de 124 aminoácidos con un pI teórico de 4.41, evidenciando una isoforma ácida. La estructura primaria de esta proteína presenta regiones conservadas en el centro catalítico His48, Asp99, Tyr73 y Tyr52, en el loop de unión al Ca2+ Tyr28, Gly30, Gly32 y Asp49 y la presencia de siete enlaces disulfuro, perteneciendo por tanto a la clase D49PLA2. El modelo teórico estructural de la isoforma tiene una homología del 76.5 % con la PLA2 ácida de B. jararacussu (PDB: 1U73.1A). Asimismo, la BaPer-PLA2a no presenta actividad miotóxica, no obstante, al combinarla con la isoforma de PLA2 básica incrementó la actividad de esta última en 21.58 %. Adicionalmente, el gen fue insertado en el vector pPicZαA y se usó para la transformación y propagación a Escherichia coli, cepa Top10F´, llegando a obtener un inserto de rPLA2a de ~500 pb lo que indica que el clonamiento fue exitoso. Por otro lado, se usó a Pichia pastoris cepa GS115 en los ensayos de expresión de la proteína recombinante, lo cual no se evidenció debido a la optimización en algunos parámetros.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). Proyecto de investigación básica y aplicada. N° 168-2017-FONDECYT
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. Programa de Proyectos de Investigación para Grupos de Investigación. B18100081