Academic literature on the topic 'Vésicules enrobées de clathrine'

Les champignons sont les principaux agents pathogènes des plantes. Leur étude est donc essentielle pour contrôler les maladies et maintenir un bon rendement de production agricole. La nutrition de ces pathogènes est basée sur l'absorption de nutriments, préalablement dégradés par un arsenal d'enzymes lytiques secrétées. La sécrétion des protéines est assurée par le trafic intracellulaire mettant en jeu de nombreuses vésicules. Chez les champignons filamenteux, ces vésicules ont été visualisées en microscopie électronique mais le processus mis en jeu pour leur biogénèse n'est toujours pas élucidé. L'identification de ce mécanisme est un donc un prérequis pour comprendre la sécrétion de facteurs de virulence. Dans ce but, un mutant non pathogène altéré au niveau de l'expression du gène codant la chaine lourde de la clathrine a été sélectionné parmi une banque de mutants générés chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Le gène codant pour la chaine lourde de la clathrine est essentiel chez de nombreux organismes, ainsi un mutant dominant négatif de la chaine lourde de la clathrine a été généré et confirme la perte de pathogénicité. La caractérisation du mutant par une approche de protéomique a mis en évidence un défaut de sécrétion de 82 protéines incluant des facteurs de virulence connus. Un défaut de production de vésicules intracellulaires a également été constaté. Par ailleurs, le marquage de la clathrine à la GFP a permis de préciser sa localisation dans les cellules fongiques. Enfin, de façon surprenante, aucun défaut d'endocytose n'a été constaté au sein des mutants déficients en clathrine. Cette étude met en évidence pour la première fois le rôle essentiel de la clathrine dans le processus infectieux d'un champignon pathogène ainsi que son rôle dans a sécrétion de facteurs de virulence
Fungi are the most important plant pathogens on agricultural and horticultural crops. Study of fungal pathogens remains essential to understand pathogenic process and control plant diseases. These organisms secrete high amount of degrading enzymes involved in plant decomposition and they feed by absorption of degraded nutriments. Secretory proteins were described to be transported form Endoplasmic Reticulum and Golgi apparatus to extracellular space through intracellular vesicles. In filamentous fungi, intracellular vesicles were observed using electron microscopy but their biogenesis process is still unknown. Therefore, elucidation of the process and the identification of proteins involved in secretory vesicles biogenesis remains a challenge to understand virulence factors delivery. A nonpathogenic mutant altered in the expression of the gene coding for clathrin heavy chain was selected in a random mutant library generated in the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea,. This gene is essential in many organisms, thus a clathrin dominant negative mutant was generated and confirming the nonpathogenic phenotype observed on several host plant. In eukaryotic cells, clathrin heavy chain is mainly described to be involved in endocytosis, but it is also essential for high density secretory vesicles formation in yeast. Characterization of the mutants using a proteomic approach revealed a secretion defect of 82 proteins including known virulence factors, as Plant Cell Wall Degrading Enzymes and elicitors. Furthermore, the clathrin mutant revealed a strong reduction of intracellular vesicles production. Clathrin was also localized in living cells using fluorescent GFP-tag protein. Endocytosis was also studied and surprisingly, any observable defect was observed for clathrin mutants. This study demonstrated for the first time the essential role of clathrin in the infectious process of a fungal pathogen and its role in virulence factors secretion

Les récepteurs cystéinyl-leucotriène 1 et 2 font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G. Ces deux récepteurs partagent une homologie de séquence de 38%, cette homologie étant particulièrement faible dans la région C-terminale. Tout d'abord, nous avons étudié la localisation et l'internalisation des deux récepteurs chez des lignées cellulaires HEK293 exprimant de façon stable l'un ou l'autre des deux récepteurs. Le récepteur CysLT1, localisé principalement au niveau de la membrane plasmique, s'internalise fortement (60%) au cours de la première heure de stimulation au LTD[indice inférieur 4] (Leucotriène D4) et s'accumule dans la région péri-nucléaire. L'internalisation reste soutenue même après 4 heures de stimulation et est bloquée par le Montélukast, un antagoniste spécifique du récepteur CysLT1. Par contre, le récepteur CysLT2 est situé majoritairement à l'intérieur de la cellule et très faiblement à la surface cellulaire à l'état non-stimulé. Une faible internalisation, soit près de 5%, est observée à des temps de stimulation inférieurs à 1 heure. Toutefois, une augmentation de l'expression à la surface des cellules est observée lorsque les cellules sont stimulées pendant plus de 2 heures au LTC[indice inférieur 4] (Leucotriène C4). Ce phénomène d'externalisation étant intriguant, nous avons étudié la fonctionnalité des récepteurs à la surface via des essais de production d'inositol phosphates après 2 et 4 heures de prétraitement au LTC[indice inférieur 4]. Nous avons obtenu des hausses de 4 fois de la production des inositol phosphates après 2 et 4 heures de prétraitement au LTC[indice inférieur 4] comparativement à un ratio de 2 fois lorsque prétraité à l'EtOH. L'autre partie du projet consistait à mieux définir l'internalisation du récepteur CysLT1 ainsi que les molécules impliquées. Premièrement, nous avons observé que les acides aminés 304 à 321 de la queue C-terminale du CysLT1 étaient cruciaux pour l'internalisation du récepteur. La cotransfection de mutants et dominants négatifs d'arrestines 2 et 3 a suggéré l'indépendance des arrestines pour l'internalisation du récepteur CysLT1. Nous avons aussi montré que les GRK (kinases de RCPG) 2, 5 et 6, la PKA ainsi que la caséine kinase 2 ne semblent pas nécessaires pour l'internalisation du récepteur CysLT1 contrairement aux PKC et à la caséine kinase 1 qui sont importantes dans ce processus. Ensuite, nous avons démontré que la cotransfection d'un dominant négatif de la dynamine 1A (K44A) empêche l'internalisation du récepteur CysLT1. Étant donné que le potentiel de signalisation du récepteur peut dépendre de la voie d'internalisation empruntée, nous avons étudié les voies d'internalisation possibles. Des prétraitements avec le sucrose hyperosmotique et la concanavaline A ont inhibé l'internalisation du CysLT1 respectivement de 90% et 70%, indiquant la participation des vésicules de clathrine. La baisse d'internalisation induite par certains agents désorganisant le cholestérol membranaire a amené certaines évidences de la participation des radeaux lipidiques. De plus, nous avons démontré l'importance d'un réseau d'actine intact dans le processus d'internalisation du récepteur CysLT1 via des agents qui induisent la dépolymérisation de l'actine. Nous avons obtenu des baisses significatives de l'internalisation de 57% et 43% suite à des prétraitements avec respectivement la cytochalasine D et la latrunculine B. Finalement, la réexpression rapide à la surface des récepteurs CysLT1 suite au retrait de l'agoniste suggère un recyclage rapide des récepteurs via les endosomes précoces. Les résultats de ce mémoire exposent des divergences au niveau de la localisation et de l'internalisation des récepteurs CysLT1 et CysLT2. Nos résultats suggèrent également que l'internalisation du récepteur CysLT1 est dépendante de l'activité de la dynamine et du réseau d'actine et qu'elle s'effectue via les vésicules de clathrine et possiblement via les radeaux lipidiques.