Dissertations / Theses: 'Vésicules extracellulaire'

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Clement, Emily. "Rôle des vésicules extracellulaires sécrétées par les adipocytes dans la progression du mélanome : impact de l'obésité." Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30276.

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Abstract:

La progression tumorale dépend d'un dialogue entre les cellules cancéreuses et leur environnement. Parmi les cellules du microenvironnement du mélanome, les adipocytes ont longtemps été ignorés. Pourtant, ces cellules sont le composant majeur de l'hypoderme, la couche la plus profonde de la peau. Ainsi, elles sont proches du mélanome lors de la tumorigenèse et, lorsque la tumeur envahi les couches profondes de la peau, les deux types cellulaires entrent en contact. Il est donc important de comprendre l'impact des adipocytes sur la progression du mélanome, d'autant plus que des études épidémiologiques montrent que l'obésité est un facteur de mauvais pronostic pour ce cancer. Le surpoids et l'obésité sont en hausse constante avec près d'un tiers de la population mondiale affectée, faisant du lien entre l'obésité et le cancer un enjeu de santé publique majeur. Parmi les différents moyens de communication cellulaire, les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle important dans le cancer. Les VE régulent la communication entre les cellules cancéreuses mais aussi entre les composants du microenvironnement et la tumeur. Les VE sécrétées par les adipocytes sont peu caractérisées et leur rôle sur la progression tumorale reste à élucider. Les VE adipocytaires pourraient être modifiées qualitativement et quantitativement en obésité car différents stress (inflammation, hypoxie...), connus pour modifier les VE, sont retrouvées dans le tissu adipeux d'individus obèses. Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était de caractériser les VE adipocytaires et déterminer leur impact sur le mélanome dans un contexte normopondéral et d'obésité. Les résultats obtenus montrent que ces VE favorisent la migration et l'invasion des cellules de mélanome. Une analyse protéomique a révélé une signature spécifique dans ces VE, fortement enrichies en protéines du métabolisme des acides gras (AG).[...] It is now clear that tumor progression is the result of a permanent dialog between cancer cells and the tumor microenvironment (TME). Among the cells found within the melanoma microenvironment, adipocytes had long been ignored. However, adipocytes are the main component of the hypodermis, the deepest skin layer, and are therefore close to melanoma from tumorigenesis and, as the tumor becomes aggressive and invades the deeper skin layers, the two cell types come into contact. Thus, understanding how adipocytes influence melanoma progression is of major importance, especially since epidemiological studies show that obesity is a poor prognosis factor for melanoma. As overweight and obesity are constantly rising and affect around a third of the World's population, the link between obesity and cancer is a major public health issue. Among the different ways in which cells communicate, extracellular vesicles (EV) play a particularly important role in cancer. Moreover, not only can tumor cells communicate with each other through EV, but the cellular components of the TME also use EV to communicate with cancer cells. Adipocyte-derived EV are poorly characterized and their role in tumor progression remains to be determined. In obesity, adipocyte EV may be qualitatively and quantitatively altered since various stresses (inflammation, hypoxia etc.), which are known to modify EV, are found in the adipose tissue of obese individuals. In this context, the first aim of my thesis was to characterize adipocyte EV and their impact on melanoma in lean and obese individuals. The results obtained show that EV secreted by adipocytes promote migration and invasion of melanoma cells. Analysis of their proteome revealed a protein signature specific to adipocyte EV, which was highly associated with fatty acid (FA) metabolism, a metabolic pathway involved in tumor aggressiveness. In melanoma treated with adipocyte EV, fatty acid oxidation (FAO) is increased and FAO inhibitors reverse their pro-invasive effect. Moreover, adipocytes secrete increased numbers of EV in obesity and, using equal numbers of EV from lean or obese subjects, their effect on tumor aggressiveness is increased and remains dependent on FAO. T[...]

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Yin, Min. "Vésicules extracellulaires et régulation de la réponse inflammatoire dans les pathologies cardiovasculaires." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2015. http://www.theses.fr/2015PA05S009.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires telles que les microvésicules et les exosomes sont libérées lors de l’apoptose ou de l’activation cellulaire. Ce sont des médiateurs importants dans la communication intercellulaire, suggérant que ces vésicules pourraient jouer un rôle physiopathologique, en particulier dans les maladies cardiovasculaires. L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique de la paroi artérielle qui résulte de l’interaction entre les lipoprotéines, les cellules inflammatoires, et les cellules vasculaires. L'infarctus du myocarde est une complication aiguë et grave de l'athérosclérose. La réaction inflammatoire post-infarctus joue un rôle central dans la formation de néovaisseaux sanguins et la cicatrisation. Cependant, les mécanismes de l’inflammation sont encore mal connus dans ces pathologies. Mon travail de thèse a porté sur les effets des vésicules extracellulaires isolées de tissus pathologiques sur les cellules inflammatoires. Nous avons montré dans un premier travail que les microvésicules s’accumulant dans les lésions d’athérosclérose humaines contribuent à la surcharge en cholestérol et en triglycérides des macrophages et facilitent la formation de cellules spumeuses. L’accumulation des lipides intracellulaires induite par ces microvésicules est contrebalancée par une augmentation de l’efflux du cholestérol associée à une activation d’ABCA1. Dans un deuxième travail, nous avons examiné les effets des vésicules produites dans le cœur post-infarctus sur la réponse inflammatoire. Nos résultats montrent : 1- une augmentation de la libération in situ des microvésicules majoritairement d’origine cardiomyocytaire et des exosomes 15 heures après infarctus ; 2- la stimulation de la production de VEGF monocytaire par les vésicules extracellulaires ; 3- l’incapacité en ce qui concerne les vésicules isolées de cœur diabétique infarci à reproduire cet effet sur les monocytes des souris contrôles. Afin de clarifier les déterminants de l’angiogenèse post-ischémique, nous avons également étudié les profils de miARNs des vésicules contrôles et diabétiques. Après infarctus du myocarde, l’expression de miR-126-3p et de miR-92a-3p est significativement diminuée dans les vésicules diabétiques en comparaison avec les vésicules contrôles. Par ailleurs, nous avons observé une augmentation de miR-126-3p et de miR-92a-3p respectivement dans les microvésicules et les exosomes chez les souris contrôles post-infarctus. En conclusion, ce travail apporte des éléments nouveaux sur les fonctions des vésicules extracellulaires générées localement dans les tissus inflammatoires, en particulier leur capacité à promouvoir la transformation des macrophages en cellules spumeuses dans la plaque. Par ailleurs, les vésicules isolées du cœur ischémique pourraient favoriser l’angiogenèse post-infarctus en stimulant la production de VEGF monocytaire. La disparition de cet effet bénéfique dans le diabète pourrait être associée à des modifications d’adressage des miARNs dans les vésicules extracellulaires au cours de cette pathologie Extracellular vesicles, such as microvesicles and exosomes, are released during cell apoptosis or activation. They are important mediators of intercellular communication, suggesting that these vesicles could play a pathophysiological role, especially in cardiovascular diseases. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the arterial wall which results from the interaction between lipoproteins, inflammatory cells, and vascular cells. Myocardial infarction is an acute and severe complication of atherosclerosis. The postinfarction inflammatory response plays a central role in the formation of new blood vessels and scarring. However, the mechanisms of inflammation are still poorly known in these pathologies. My thesis concerned the effects of extracellular vesicles isolated from pathological tissues on inflammatory cells. We showed in the first work that microvesicles accumulating in human atherosclerotic lesions contribute to cholesterol and triglyceride overload in macrophages and facilitate foam cell formation. The accumulation of the intracellular lipids induced by those microvesicles is offset by an increase in cholesterol efflux associated with activation of ABCA1. In the second study, we examined the effect of vesicles produced in the infarcted heart on the inflammatory response. Our results showed : 1- an increased release in situ of microvesicles mostly of cardiomyocyte origin and exosomes 15 hours after infarction ; 2- the stimulation of monocyte VEGF production by extracellular vesicles ; 3- the incapacity of diabetic vesicles isolated from infarcted heart to reproduce that effect on control mice monocytes. In order to clarify the determinants of postischemic angiogenesis, we also studied miRNA profiles of control and diabetic vesicles. After myocardial infarction, the expression level of miR-126-3p and miR-92a-3p was significantly decreased in diabetic vesicles compared to control vesicles. Furthermore, we observed an increased expression of miR-126-3p and miR-92a-3p respectively in the microvesicles and the exosomes isolated from control mice heart after myocardial infarction. In conclusion, this work provides new information on the functions of extracellular vesicles locally generated in inflamed tissues, particularly in promoting macrophage transformation into foam cells in the atherosclerotic plaque. Furthermore, vesicles isolated from ischemic heart could enhance postinfarction angiogenesis by stimulating monocyte VEGF production. The loss of this beneficial effect in diabetes may be associated with changes of miRNA cargo in extracellular vesicles in this pathology

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Le, Saux Sarah. "Exploration du potentiel des vésicules extracellulaires en tant que vecteurs de protéines thérapeutiques." Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT055.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nano-vésicules produites par les cellules : elles jouent un rôle clé dans la communication intercellulaire en délivrant des molécules, acides nucléiques et protéines. Grâce à ces propriétés naturelles, les VE ont émergé en tant que nouveaux vecteurs. La délivrance intracellulaire de protéines est particulièrement difficile, et les systèmes existants présentent des défauts (biocompatibilité, sûreté) : les VE pourraient être des candidats singulièrement intéressants. Mon objectif de thèse était d’évaluer le potentiel des VE pour la délivrance intracellulaire de fragment d’anticorps, en utilisant des processus de chargement physico-chimiques sur des VE après production. Le premier objectif était de produire, caractériser et conserver les VE. Les VE ont été isolés à partir de cellules souches mésenchymateuses murines par ultracentrifugation. Ils ont été caractérisés de façon exhaustive : les VE étaient sphériques, de 94±10 nm de diamètre, possédaient des protéines (TSG101, CD81) et des lipides (cholestérol, sphingomyélines, céramides) spécifiques de VE de petite taille. Les VE étaient davantage internalisés que les liposomes (standards, HSPC/Cholestérol) in vitro et ils suivent des voies d’endocytose différentes. Congeler les VE dans du trehalose (25 mM) avec inhibiteurs de protéase assurait une conservation optimale. Le deuxième objectif était d’utiliser des processus physico-chimiques pour charger dans les VE un fragment d’anticorps single-chain variable (scFv) avec un tag GFP et ciblant la tubuline humaine, et de parvenir à délivrer un scFv fonctionnel en intracellulaire. Différentes méthodes ont été évaluées : extrusion, sonication avec une sonde, bain à ultrasons, lyophilisation, cycles de congélation/décongélation, et des combinaisons de ces méthodes. Nous avons identifié des protocoles de chargement résultant en des pertes de VE et scFv inférieures à 20%. Pour certains procédés combinatoires, un léger marquage tubuline a été observé in vitro, ce qui implique que les complexes VE-scFv ont été internalisés, ont échappé à la dégradation endosomale et ont atteint la tubuline dans le cytoplasme. Ces résultats devront être confirmés, mais nous concluons que les VE semblent prometteurs en tant que système pour la délivrance intracellulaire d’anticorps fonctionnels, ce qui n’a jamais été décrit auparavant Extracellular vesicles (EVs) are nano-vesicles produced by cells: they play a key role in intercellular communication by delivering molecules, nucleic acids or proteins. Because of these natural features, EVs have emerged as novel vectors. Intracellular protein delivery is particularly challenging, and existing systems have shortcomings (biocompatibility, safety): EVs could be an especially interesting candidate. My objective for this PhD was to evaluate the potential of EVs for antibody fragment intracellular delivery, using physico-chemical loading processes on EVs once isolated. The first goal was to isolate, characterise and store nanosized EVs. EVs were isolated from murine mesenchymal stem cells by ultracentrifugation. They were thoroughly characterized: EVs were spherical, 94±10 nm, possessed proteins (TSG101, CD81) and lipids (cholesterol, sphingomyelins, ceramides) specific of small EVs. EVs were internalised to a greater extent than their liposomal counterparts (HSPC/Cholesterol standards) in vitro and follow different endocytic routes. Freezing EVs at -80°C in trehalose 25 mM with protease inhibitors ensured optimal EV storage. The second goal was to use physico-chemical processes to load EVs with an anti-tubulin GFP-tagged single-chain antibody fragment (scFv) and achieve intracellular delivery of functional scFv. Different methods were evaluated: extrusion, probe sonication, bath sonication, freeze drying, freeze-thaw cycles and combinations of these methods. We identified loading protocols leading to less than 20% loss of EVs and scFv. For some combinatory processes, a slight tubulin staining was observed in vitro, implying scFv-EV complexes were internalised, escaped from endosomes and reached tubulin in the cytoplasm. These results will need to be confirmed, but we conclude EVs show promise for the intracellular delivery of functional antibody, which has never been described before

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Lamontagne-Proulx, Jérôme. "Vésicules extracellulaires : biomarqueurs et véhicules de propagation de protéinopathies." Master's thesis, Université Laval, 2018. http://hdl.handle.net/20.500.11794/29627.

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Abstract:

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative invalidante pour laquelle le diagnostic ne peut être donné qu’une fois la dégénérescence neuronale bien entamée, rendant impérative la découverte d’un biomarqueur ; un outil biologique permettant de prédire l’apparition de la pathologie ou d’évaluer sa progression. Mon projet de maîtrise visait donc l’étude des vésicules extracellulaires (VE) issues du sang comme test diagnostique ou comme marqueur de la progression de la MP. La quantification des VE effectuée par cytométrie de flux à haute sensibilité a révélé une augmentation spécifique des VE dérivées d’érythrocytes (VEE) chez les parkinsoniens comparés à leurs contrôles, ainsi qu’une forte corrélation avec la progression de la maladie. L’analyse quantitative de l’alphasynucléine (α-Syn), principale protéine impliquée dans la pathologie de la maladie, a montré un niveau similaire entre les individus. Cependant, l’analyse protéomique des VEE a révélé une modulation de certaines protéines entre les patients et les donneurs sains. Nos résultats suggèrent que les VEE pourraient conduire au développement d’un marqueur pour suivre l’évolution de la maladie ainsi que l’effet de nouvelles thérapies. 341812 Parkinson’s disease (PD) is a debilitating neurodegenerative disease for which the diagnosis can only be confirmed once the degeneration state is very advanced, making imperative the discovery of a biomarker: a biological tool to predict the onset of pathology or its progression. My master’s project was designed to study extracellular vesicles (EV) from the blood in order to discover if they could be used as a diagnostic test or as a marker of disease progression. Quantification of EV performed by high-sensitivity flow cytometry demonstrated an increase in PD patients compared to their controls and a strong correlation with the progression of the disease only in EV derived from erythrocytes (EEV). Quantitative analysis of α-Syn, the main protein involved into PD pathogenesis, showed a similar level between individuals. However, analysis of the EEV proteome reveals a modulation of some proteins between patients and healthy donors. Our results suggest that EEV have the potential to lead to the development of a marker abled to track disease course as well as measuring the effect of new therapies.

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Millard, Marie. "Optimisation de la thérapie photodynamique par la nanovectorisation du photosensibilisateur mTHPC à l’aide de vésicules extracellulaires." Thesis, Université de Lorraine, 2018. http://www.theses.fr/2018LORR0246.

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Abstract:

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement alternatif à la chirurgie en oncologie utilisant un photosensibilisateur (PS), la lumière visible et l’oxygène moléculaire. La méta-tétra(hydroxyphényl)chlorine (mTHPC) est l’un des PS de deuxième génération les plus utilisés en clinique en raison de son absorption dans le rouge lointain et d’un rendement quantique en 1O2 élevé. De par sa nature hydrophobe, la mTHPC est partiellement agrégée dans la circulation sanguine diminuant sa biodistribution. Dans le but d’améliorer la sélectivité tumorale de la mTHPC, différentes stratégies de vectorisation ont été développées. La formulation liposomale de mTHPC non PEGylée (Foslip®) améliore la biodistribution ainsi que les propriétés pharmacocinétiques de la mTHPC. Cependant, une rapide destruction des liposomes en circulation ainsi qu’une rapide libération de la mTHPC sont des inconvénients majeurs. Une alternative possible est l’utilisation de vésicules extracellulaires (VE). Dérivées des cellules, les VE possèdent une stabilité naturelle dans la circulation sanguine et une capacité à transporter et délivrer leur contenu de manière spécifique aux cellules cancéreuses. Cette vectorisation est intéressante en PDT en raison d’une importante capacité d’encapsulation des porphyrines. Le but de cette étude était d’évaluer l’intérêt des VE en tant que nanovecteur de la mTHPC dans divers modèles précliniques comparé au Foslip®. Contrairement au Foslip®, l’intégrité membranaire des VE est conservée en présence de 20% de plasma. In vitro, les mTHPC-VE ont montré une internalisation cellulaire par un mécanisme actif d’endocytose. Dans un modèle cellulaire en 3D de sphéroïdes multicellulaires, les mTHPC-VE ont permis d’accroitre l’accumulation cellulaire, la diffusion au sein de ce modèle ainsi que l’efficacité PDT. In vivo, les mTHPC-VE apparaissent plus efficace au niveau PDT avec un retard de croissance tumorale significativement augmenté. En conclusion, l’intégration de la mTHPC au sein des VE améliore l’efficacité PDT dans les différents modèles d’étude. Le suivi des mTHPC-VE à l’aide d’un traceur radioactif chez la souris ainsi que l’étude du ciblage de la vascularisation tumorale seront étudiés dans la suite du travail Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment to surgery in oncology using photosensitizer (PS), light and oxygen. Meta-tetra(hydroxylphenyl)chlorin (mTHPC) is one of the most used PS in clinics due to its high absorption in the deep red and high 1O2 quantum yield. In order to improve the mTHPC tumor selectivity different attempts of nanovectorisation were conducted. Non-PEGylated liposomal mTHPC (Foslip®) increase biodistribution and pharmacokinetic properties. However, the rapid liposome destruction during circulation and rapid mTHPC release are obvious shortcomings. Alternatively, mTHPC vectorization could be realized by extracellular vesicles (EVs). Derived from the cell, EVs possess a natural stability in bloodstream and ability to transport and deliver cargo molecules into cancer cells. This formulation is interesting for PDT due to the ability to encapsulate porphyrins. The aim of the present study was to determine the interest of EVs as mTHPC nanocarriers in various preclinical models compared to Foslip®. In contrast to Foslip®, membrane integrity of mTHPC-EVs was conserved in 20% of plasma. In vitro, mTHPC-EVs showed cellular internalization by an active endocytosis mechanism. In a 3D model of spheroids, mTHPC-EVs have improved cellular uptake, better diffusion inside spheroid and increased PDT efficacy. In vivo, mTHPC-EVs appeared to be more potent in terms of PDT efficacy, with a tumor growth delay significantly higher. In conclusion, integration of mTHPC in EVs improves PDT efficacy in various preclinical models. The tracking of mTHPC-EVs using a radioactive tracer in xenografted rodents as well as the study of vascularization targeting will be studied in the next step of this work

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Handala, Lynda. "Caractérisation du virus BK et rôle des vésicules extracellulaires sur sa pathogénicité." Thesis, Amiens, 2020. http://www.theses.fr/2020AMIE0005.

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Abstract:

Au cours de ces dernières années, le développement de nouveaux protocoles de traitements immunosuppresseurs de plus en plus puissants en transplantation rénale a permis une meilleure prévention des rejets d'allogreffes. Cependant, l'immunodéficience induite conduit à la réactivation de multiples agents viraux responsables de pathologies aux conséquences graves comme un rejet du greffon. Le virus BK (BKPyV) est un de ces virus opportunistes. Il se réplique chez un patient greffé sur deux au cours de la première année post-greffe tandi’s que plus de 80% de la population générale est porteuse asymptomatique. Malheureusement, ses mécanismes de persistance et d'échappement au système immunitaire demeurent encore incompris. En purifiant le virus, nous avons constaté que les cellules infectées relarguaient deux populations infectieuses de densités différentes, dont l'une co-sédimente avec les vésicules extracellulaires (VE). Cette population est par ailleurs moins sensible à l'action de protéases et, sous l'action du chloroforme, retrouve une densité similaire à celle des virions nus. La microscopie électronique nous a permis de confirmer que des VE pouvaient transporter une dizaine de virions. Nous avons alors constaté que les particules comprises dans les VE (eBKPyV), contrairement aux particules nues, ne sont plus hémagglutinantes et n'ont pas besoin des groupements de glycanes sialylés pour entrer dans les cellules. Cette dualité de formes permet donc une diversification des modes d'entrée. Nous avons aussi observé que virus nu et eBKPyV étaient sensibles à la neutralisation par des anticorps de patient infecté et par des immunoglobulines polyvalentes et que cette neutralisation avait lieu après endocytose. La présence du BKPyV au sein de VE, phénomène portant le nom de "transmission en bloc", pourrait finalement jouer un rôle critique au cours de l'infection primaire, de la persistance, mais aussi de la réactivation du virus et offrir une nouvelle cible dans le développement de nouvelles thérapies During the last years, development of new strong immunosuppressive treatment protocols used in renal transplantation has allowed a better prevention of allograft rejection. However, the induced immunodeficiency leads to the reactivation of multiple viral agents, causative of pathologies with potentially serious consequences such as transplant rejection. The BK virus (BKPyV) is one of these opportunistic viruses. It replicates among one in two transplant patients during the first year post-transplant while more than 80% of the general population is asymptomatic carrier. Unfortunately, its mechanisms of persistence and immune evasion remain misunderstood today. We purified the virus produced in cell culture on a iodixanol gradient and we found that infected cells released two infectious populations of different densities. One of them co-sedimented with extracellular vesicles (EV). This population was less sensitive to protease digestion and its treatment by chloroform leads to the the disappearance of the low-density BKPyV population whereas it increases the high-density population. Electron microscopy allowed us to confirm that EV could transport about ten virions. We also found that the particles included in the EV (eBKPyV), unlike naked particles, are no longer able to agglutinate red blood cells and don’t need sialylated glycan groups to infect cells. The existence of two BKPyV forms could allow diversification of its infection modes. Furthermore, we also observed that naked virus and eBKPyV were both sensitive to neutralization by antibodies from an infected patient and by polyvalent commercial immunoglobulins, with no significant difference, and that this neutralization occured after endocytosis. The presence of BKPyV in extracellular vesicles, a phenomenon called "transmission en bloc", could have a critical incidence during primary infection, persistence but also reactivation of the virus and could be a new target in the development of new therapies

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Sadoudi, Sihem. "Implication des vésicules extracellulaires d'érythrocytes dans la dysfonction vasculaire drépanocytaire." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCB161.

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Abstract:

L'hémolyse intravasculaire est la destruction prématurée et chronique des globules rouges. Elle est caractérisée par une libération accrue d’hème et de microvésicules (MV) membranaires dans la circulation sanguine. L'hémolyse chronique est une des caractéristiques de la drépanocytose. Elle joue un rôle très important dans la physiopathologie de la drépanocytose. La drépanocytose est associée à une agrégation des globules rouges dans la circulation, menant à des occlusions vasculaires et des crises vaso-occlusives extrêmement douloureuses. Les travaux précédents de l’équipe dans la drépanocytose, ont montré que les MV de globules rouges transfèrent de l’hème aux cellules endothéliales, participent à la dysfonction vasculaire et induisent des vaso-occlusions rénales dans un modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats nous ont incités à poursuivre l’étude des effets des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons émis l’hypothèse que les MV chargées en hème stimulent également l’inflammation dans la drépanocytose au de-là de la dysfonction endothéliale. Ce travail regroupe trois parties. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à l’effet pro-inflammatoire des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons démontré que les MV stimulent les neutrophiles qui libèrent leur ADN. Les taux plasmatiques d’ADN extracellulaire sont élevés dans la drépanocytose, comparés aux taux plasmatiques chez les individus sains, et augmentent encore durant les crises vaso-occlusives. Cet ADN, qui pourrait provenir en partie des pièges extracellulaires d’ADN (dits NETs), affecte l’hémorhéologie drépanocytaire en modifiant les propriétés d’agrégation et d’adhésion des globules rouges. Par ailleurs, nous avons constaté que le plasma des patients drépanocytaires était incapable de dégrader l’ADN in vitro, et présentait une activité DNase plasmatique réduite. La baisse de l’activité DNase dans la drépanocytose crée un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et son inhibiteur endogène. En contre partie, une supplémentation en DNase-I humaine recombinante par perfusion intraveineuse a libèré les vaso-occlusions rénales dans le modèle de souris drépanocytaire et a réduit l’excès d’agrégation et d’adhésion des globules rouges drépanocytaires. Ces résultats démontrent un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et l’activité DNase chez les patients drépanocytaires conduisant à une inflammation chronique, une forte agrégation des globules rouges et la survenue des vaso-occlusions. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux effets du remodelage et du remaniement membranaire des globules rouges dans la drépanocytose. Nous avons identifié que les globules rouges et leurs MV sont associés à une externalisation accrue de la phosphatidylsérine et que cette externalisation accrue ne résulte pas d’une composition lipidique modifiée de la membrane des globules rouges, mais, il s’agit principalement d'une externalisation exagérée de la phosphatidylsérine. L’externalisation de la phosphatidylsérine contribue aux occlusions vasculaires in vivo. La neutralisation de la phosphatidylsérine des MV et des globules rouges avec de l’annexine-A5 recombinante permet la libération des vaso-occlusions rénales induites par les MV de globules rouges dans le modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats démontrent le rôle de la phosphatidylsérine externalisée par les globules rouges et les MV dans les occlusions vasculaires in vivo et le potentiel thérapeutique de l’annexine-A5 pour restaurer l’hémorhéologie et la perfusion tissulaire durant les vaso-occlusions drépanocytaires. Dans une troisième partie, nous nous sommes intéressés aux annexines en tant qu’inhibiteurs endogènes de la phosphatidylsérine des membranes de globules rouges et de MV. Nous avons mis au point un nouveau test qui permet de quantifier la fonctionnalité de l’annexine-A5 et –A7. (...) Pas de résumé

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Vituret, Cyrielle. "Les vésicules extracellulaires comme vecteurs de macromolécules bioactives : modèle du transporteur ABCC7 (CFTR) et application à la biothérapie de la mucoviscidose." Thesis, Lyon 1, 2015. http://www.theses.fr/2015LYO10330/document.

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Abstract:

La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), conduisant à un défaut d'adressage de la protéine CFTR à la membrane apicale des cellules épithéliales, ou à un déficit de sa fonction de canal à ions chlorure. Ce travail a consisté à étudier les vésicules extracellulaires (EV), microvésicules (MV) et exosomes (Exo), comme vecteurs de la protéine CFTR et de son ARN messager. La preuve de concept du transfert de matériel biologique d'intérêt par l'intermédiaire d'EV, d'abord apportée sur un modèle de cellules animales (CHO), a été validée en cellules humaines. Les EV ont été isolées à partir de surnageant de Calu-3, cellules exprimant la protéine CFTR de manière endogène, et de A549 transduites par le vecteur adenoviral Ad5-GFP-CFTR, surexprimant la protéine de fusion GFP-CFTR. Les cellules cibles choisies, A549 et CF15, étaient déficientes en CFTR. Le transfert s'est révélé plus efficace en système homologue (A549/A549) qu'en système hétérologue (A549/CF15). Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs métaboliques suggère que les EV ne suivent pas une voie d'internalisation cellulaire unique, mais que plusieurs mécanismes sont mis en jeu, dont l'endocytose clathrine dépendante et la macropinocytose. Les deux types d'EV sont capables de rétablir la fonction canal associée au CFTR dans les cellules CF15 de façon dose-dépendante, mais avec un effet de seuil minimum. L'activité CFTR reste stable pendant 3 jours, et à un niveau encore détectable après 5 jours. Notre travail démontre l'intérêt potentiel des MV et Exo comme vecteurs de biothérapie de pathologies génétiques Cystic fibrosis is a genetic disease in which its prognosis depends on the lung damage. It is caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (CFTR), resulting in a dysfunctional CFTR protein normally located at the plasma membrane of epithelial cells. This thesis is a study of a novel therapeutic approach to use extracellular vesicles (EVs), microvesicles and exosomes, as transfer vectors for CFTR mRNA and protein to target cells. The proof of concept for the transfer of CFTR mRNA and protein was first done in the CHO hamster model. To validate this concept on human cells, we used human bronchial Calu-3 cells, which express the endogenous CFTR protein, and A549 lung epithelial cells transduced by the adenoviral vector Ad5-GFP-CFTR to overexpress the fusion exogenous protein GFP-CFTR. We show that EVs produced by these cells could transfer a new functionality to CF15 target cells carrying the CFTRdeltaF508 mutation and the transfer seems to be more efficient in a homologous cell system versus a heterologous system. Interestingly, the exosomes seem to be more efficient in CFTR transfer than the microvesicles. A study of the mechanism of EVs cellular uptake show that it is temperature dependent and that endocytosis and macropinocytosis are implicated. Collectively, this study demonstrates the potential application of EVs for CFTR transfer and functional correction of the genetic defect in human CF cells

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Fiore, Stephany. "Netrin-1 in extracellular vesicles : a new secretory pathway." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1263.

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Abstract:

Les récepteurs à dépendance (RD) sont une famille de récepteurs membranaires partageant une caractéristique fonctionnelle: ils induisent une signalisation dite « positive » en présence de leurs ligands et une signalisation « négative », conduisant à un mort cellulaire par apoptose en absence de leur ligand. Par conséquent, l’expression de ces récepteurs rend les cellules dépendantes de la présence du ligand pour leur survie. Les récepteurs à dépendance agissent donc comme des suppresseurs de tumeurs: les cellules cancéreuses surnuméraires se retrouvent en compétition pour fixer une quantité limitée de ligand et celles qui présentent un récepteur non lié sont éliminées par apoptose. Parmi les avantages sélectifs permettant d’échapper à cette mort cellulaire induite par les RD, la surexpression du ligand offre des possibilités thérapeutiques. Afin de bloquer la liaison ligand/récepteur un anticorps monoclonal dirigé contre un ligand de RD a été développé et est actuellement en cours d’essai clinique. Toutefois une question encore ouverte est comment sélectionner les patients présentant une tumeur avec une forte expression du ligand susceptible de répondre au traitement avec l’anticorps bloquant. Pour cela les vésicules extracellulaires représentent de bons candidats. En effet, les vésicules extracellulaires (VE) ont suscité un intérêt croissant lié à leur capacité à transférer du contenu biologique (protéines, acides nucléiques et lipides) entre cellules. Une fois relarguées dans l’espace extracellulaire, les VE circulent dans les différents fluides corporels (sang, lymphe, urine), représentant ainsi de possibles biomarqueurs liquides. Ce travail de thèse a démontré que les ligands de RD peuvent être présent dans les VE sécrétées par des cellules cancéreuses et ouvre la voie pour une étude plus approfondie sur les fonctions de ces VE dans le développement et la progression tumorale Dependence receptors (DRs) are a family of membrane receptors linked by common functional traits. The most notable is their ability to trigger two opposite signalling pathways: a ‘positive’ signalling when their ligand is present and a ‘negative’ signalling that induces cell death in the absence of the ligand. In the context of tumour progression these receptors act as conditional tumour suppressors by triggering cell death when unbound by their ligand. Consistent with this view, an overexpression of the ligand would represent a selective advantage for cancer cells and an appealing therapeutic strategy would be to block the ligand/receptor interaction. An antibody targeting a ligand of these DRs and inhibiting the interaction ligand/DRs has been generated and obtained promising results in the phase I clinical trial. Since extracellular vesicles (EVs) could be found in most body fluids and contain information related to its cell of origin, EVs might be used as cancer biomarker. In this thesis work preliminary data suggests that the ligand of these DRs is present in cancer associated extracellular vesicles while the discussion focuses on how these ligand-containing EVs may have a functional role in tumour development and progression

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Fleury, Audrey. "Caractérisation et fonction des vésicules extracellulaires sur le métabolisme adipocytaire : rôle du morphogène Sonic Hedgehog." Thesis, Angers, 2015. http://www.theses.fr/2015ANGE0079/document.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VE), incluant exosomes et microparticules (MP), vecteurs d’information biologique, peuvent moduler la fonction de cellules cibles. Une élévation du taux de VE circulantes est observée dans les pathologies cardiovasculaires dont l’obésité est l’un des facteurs de risque majeur. Cependant, il existe peu de données concernant la production de VE adipocytaires et leur capacité à moduler le métabolisme des adipocytes. Tout d’abord, nous avons caractérisé de manière morphologique et biochimique les MP et les exosomes adipocytaires. Nous montrons une production accrue de ces VE dans un contexte d’obésité murine. L’analyse protéomique des VE adipocytaires révèle un enrichissement spécifique des MP et des exosomes en protéines clé du métabolisme énergétique et de l’inflammation, respectivement. Dans une seconde partie, nous avons étudié l’effet de MP lymphocytaires portant le morphogène Hedgehog (MPHh+) sur la différenciation adipocytaire. A l’instar d’une activation classique de la voie de signalisation Hh, les MPHh+ inhibent l’adipogenèse. Bien que dépendant du récepteur Smoothened (Smo), cet effet inhibiteur est indépendant des facteurs de transcription Gli. Nous montrons que les MPHh+ activent un axe anti-adipogénique Smo/Lkb1/Ampk pouvant être stimulé par un nouvel agoniste de Smo, le GSA-10. Nos résultats démontrent, d’une part, la capacité des adipocytes à sécréter des VE, et d’autre part, le potentiel fonctionnel des MPHh+ à inhiber l’adipogenèse par une voie de signalisation Hhnon-canonique. Les VE pourraient contribuer aux dysfonctions métaboliques associées à l’obésité en véhiculant des messages métaboliques à l’échelle de l’organisme Extracellular vesicles (EV), including microparticles (MP) and exosomes, are able to modulate target cell function through exchange or transfer of biological material. Although EV are present in the blood of healthy individuals, an elevated quantity of circulating EV is associated with cardiovascular diseases, which obesity is a major cardiovascular risk factor. Nevertheless, few studies have reported the ability of adipocytes to release EV and their implication in adipose tissue metabolism. First of all, we could determine morphological and biochemical features of adipocyte-derived exosomes and MP through a combination of methods. We were able to demonstrate an increase in adipocyte EV production in a murine model of obesity. Proteomic analysis of adipocyte EV further revealed a specific enrichment of proteins crucial for glucose and lipid metabolism and related to inflammation in MP and exosomes respectively. We then evaluated the ability of lymphocytes-derived MP harboring the Sonic Hedgehog morphogen to control adipocyte differentiation. Activation of the Hedgehog canonical pathway inhibited adipogenesis, as did MPHh+. Surprisingly, although Smo dependent, inhibitory potential of such MP did not involve the Gli transcription factors. We show that MPHh+ inhibit adipocyte differentiation through a Smo/Lkb1/Ampk axis as does a new agonist of Smo, GSA-10. Our results demonstrate, on one hand, the ability of adipocyte to release EV and on the other hand, the capacity of MPHh+ to control adipogenesis through a non-canonical Hh signaling pathway. In conclusion, EV might contribute to obesity related metabolic dysfunctions through systemic regulation of metabolic pathways

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Van, Meteren Nettie. "Les vésicules extracellulaires dans l'hépatotoxicité des hydrocarbures aromatiques polycycliques : biomarqueurs et/ou vecteurs ?" Thesis, Rennes 1, 2020. http://www.theses.fr/2020REN1B018.

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Abstract:

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des toxiques de l’environnement, considérés pour certains comme hépatotoxiques. Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanostructures membranaires libérées par les cellules dans l’environnement extracellulaire, transportant des biomolécules pouvant être spécifiques de la cellule d’origine et du stress subi. Elles sont reconnues comme des acteurs majeurs de la communication intercellulaire et des médiateurs de la pathogénèse des maladies du foie. Concernant une exposition aux xénobiotiques, les VE apparaissent comme des biomarqueurs et des acteurs potentiels des dommages induits par les médicaments, mais à l’heure actuelle, rien n’est connu sur les maladies du foie liées à des toxiques chimiques. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à l’impact de trois HAP [benzo(a)pyrène (BP), dibenzo(a,h)anthracène (DBA), pyrène (PYR)] sur la libération de VE par deux types d’hépatocytes (de la lignée WIF-B9 et de rat en culture primaire) et au rôle de ces VE dans les dommages hépatiques, en prêtant une attention particulière à la mort cellulaire, caractéristique clé des maladies du foie liées à des toxiques. L’ensemble des trois HAP provoquent une mort des hépatocytes par apoptose, une augmentation de la libération de VE ainsi qu’une modification de leur contenu. L’augmentation de la production de VE est dépendante des mécanismes à l’origine de l’initiation de l’apoptose des hépatocytes par les HAP, à savoir l’activation des récepteurs aux xénobiotiques, le remodelage membranaire et le stress oxydant. Ces VE sont capables de provoquer la mort cellulaire par apoptose d’hépatocytes récepteurs non traités par les HAP, par un mécanisme impliquant l’endocytose des VE, le transfert de contenu pro-oxydant dont le fer, la génération d’un stress oxydant et une perméabilisation de la membrane des lysosomes Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are environmental toxicants, that are considered for some of them as hepatotoxicants. Extracellular vesicles (EVs) are membrane-surrounded nanostructures released by cells into the extracellular environment transporting biomolecules, that can reflect their cellular origin and stress. EV are now recognized as major actors of intercellular communication and as pathogenic mediators in several liver diseases. Regarding xenobiotic liver injury, EVs emerge as potential biomarkers and actors of drug induced liver injury, yet nothing is known concerning toxicant-associated liver diseases. In this context, we studied the effect of three PAH [benzo(a)pyrene (BP), dibenzo(a,h)anthracene (DBA) and pyrene (PYR)] on EV release by two hepatocytes models (WIF-B9 cells and primary rat hepatocytes) and the role of those EVs in liver damages with a special focus on cell death, key characteristic of toxicant-associated liver diseases. Exposure to any three PAH led to hepatocyte death by apoptosis, EV release and modified EV content. The increase in EV production was dependent on the mechanisms responsible for PAH-induced hepatocyte apoptosis namely activation of xenobiotic receptors, membrane remodelling and oxidative stress. Those EV were capable of causing apoptosis of recipient healthy hepatocytes by a mechanism involving EV endocytosis, transfer of pro-oxidant content including iron, oxidative stress generation and lysosome membrane permeabilization

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Perbet, Romain. "Rôle des vésicules extracellulaires dans la propagation de la protéine Tau." Thesis, Lille 2, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL2S023.

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Abstract:

L’agrégation de tau intra-neuronale est une caractéristique commune d’un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. Dans certaines d’entre elles, la pathologie affecte une région cérébrale avant de se propager à d’autres régions.Cette évolution stéréotypée dans le temps et dans l’espace est probablement liée à une propagation de type prion d’espèces de tau ayant des propriétés de recrutement. Ces espèces pathologiques de tau identifiées dans le liquide interstitiel cérébral (ISF) de souris transgéniques et dans le liquide céphalorachidien humain (LCR) peuvent être internalisées par des cellules et induire une agrégation intracellulaire de tau (Takeda et al., 2016). Ces espèces pathologiques sont encore mal caractérisées mais plusieurs mécanismes potentiellement impliqués dans leur propagation ont été démontrés. Parmi eux nous avons démontré que tau est sécrétée dans les vésicules extracellulaires (EV) (Dujardin et al., 2014).Dans ce contexte nous avons voulu : 1/ vérifier l’hypothèse selon laquelle la protéine Tau pathologique est présente dans les VE extraites de tissus de patients atteints de différentes Tauopathies et que ces dernières peuvent induire de la pathologie chez l’animal. 2/ détecter des espèces pathologiques de Tau dans les VE contenues dans le plasma et le LCR, potentiels biomarqueurs de Tauopathies. 3/déterminer si de la protéine Tau peut être transférée d’un neurone à un astrocyte et dans le cas échéant, de déterminer la/les voies de transfert.Afin de tester la présence de tau avec potentiel de recrutement dans les EV extraites d’ISF de patients atteints de tauopathie set de souris transgéniques nous avons utilisé un biosenseur biologique sensible et spécifique. Nos résultats démontrent que des EV extraites d’ISF de patients atteints de maladie d’Alzheimer, de paralysie supranucléaire progressive (PSP) et de souris Tau30 contiennent de la tau pro-nucléantes. Ces capacités de recrutement sont corrélées à la sévérité de la pathologie pour la MA (préfrontal>occipital>cervelet) et induisent de la pathologie chez la souris transgénique. La présence de tau dans ces VE supporte l’idée que les EV pourraient avoir un rôle dans la propagation de tau.Nous avons également démontré par différentes approches in-vitro que la protéine Tau peut être transférée de neurone à astrocyte. Ce transfert se fait principalement par les vésicules extracellulaires Intra-neuronal accumulation of tau protein aggregates is one of the common feature of a group of heterogeneous neurodegenerative diseases called tauopathies. In some of them, the pathology will first affect a region before spreading to other regions.This staging could be linked to the prion-like propagation of pathological seed-competent tau species. These seeds, identified in transgenic mice interstitial fluid (ISF) and in human cerebrospinal fluid (CSF) are uptaken by cells and induce subsequent intracellular tau aggregation (Takeda et al., 2016). The pathological species of tau which are spreading are not yet well characterized but several mechanisms mediating their transfer (secretion and capture) have been highlighted. Among them, we demonstrated that tau is secreted in extracellular vesicles (EV´s) (Dujardin et al., 2014). We also know that neurons are implicated in this transfer but the role of glial cells is unknown.In this context, we wanted to: 1 / demonstrate that pathological Tau protein is present in EVs extracted from brain of patients suffering from different Tauopathy and that those EVS induce pathology in animals. 2 / detect pathological Tau species in EVs extracted from plasma and CSF, potential biomarkers of Tauopathies. 3 / demonstrate that Tau protein can be transferred from neuron to astrocyte and, if so, to determine the transfer pathway.To test the seeding potential of EV’s containing in ISF derived from human brain of patient presenting tauopathies, and Tau 30 mouse brain we have used a sensitive and specific tau biosensor assay. Our results demonstrate that EVs isolated from ISF of AD patient, PSP patient and Tau 30 mouse contain seed prion-like properties. The ability of these seeds to recruit tau seems to be correlated to the severity of tau pathology (prefrontal>occipital>cerebellum) for AD. This might reflect the slight presence of neurofibrillary degeneration as well as extracellular tau in this pathology in comparison to AD. Finally, the presence of seeds-containing EV’s in the extracellular space supports the idea that these shuttles might be implied in the prion-like propagation of tau pathology in Humans. Additionally, tau pathology spreading is driven by EV’s rather than by free-floating tau species.We also demonstrated that tau can be transferred from neuron to astrocyte; this transfer is more efficient with EV’s than with free floating tau.These data open new avenues for therapeutic interventions that might targets the toxic and propagative species

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Lemaire, Quentin. "Étude des microARNs dans les vésicules extracellulaires microgliales : signatures et neuroprotection." Thesis, Lille 1, 2019. http://www.theses.fr/2019LIL1S105/document.

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Abstract:

Dans le Système Nerveux Central (SNC), les cellules gliales influencent les activités neuronales. Les cellules microgliales, cellules immunitaires résidentes du SNC, contrôlent grandement l’état neuroinflammatoire. Ce contrôle est particulièrement important dans les fonctions physiologiques et s’avère souvent défectueux dans les neuropathologies. Les cellules microgliales sont en relation avec le microenvironnement cérébral et communiquent avec les autres types cellulaires (astrocytes, oligodendrocytes et neurones) afin de contrôler l’état neuroinflammatoire. Parmi les différents modes de communication intercellulaire au sein du SNC, les vésicules extracellulaires (VEs) interviennent largement dans les processus physiologiques (développement, homéostasie…) et pathologiques (maladies neurodégénératives…). C’est pourquoi, ce mode de communication a été étudié dans le dialogue entre la microglie et les neurones chez la sangsue Hirudo medicinalis. Cet annélide est un modèle intéressant de neurobiologie grâce à la structure linéaire de son système nerveux et à l’organisation de ses types cellulaires. Il permet l’étude du dialogue entre les cellules microgliales et les neurones au niveau d’une lésion expérimentale. Dans un premier temps, les résultats ont montré que les cellules microgliales interagissent avec les neurones lors d’une lésion du SNC et que des VEs sont libérées au niveau de cette lésion. De plus, les cellules microgliales produisent des VEs qui interagissent avec les neurones et délivrent un effet neurotrophique in vitro sur des neurones de sangsue et de rat. Dans un deuxième temps, la complexité des composés vésiculaires ainsi que des impératifs d’efficacité liés aux méthodes d’isolement nous ont conduits à développer l’analyse protéomique non ciblée et à grande échelle afin de valider les fractions positives en VEs mais aussi identifier leurs signatures protéiques biologiquement actives. Dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés aux microARNs (miARNs) contenus dans les VEs microgliales. Les résultats ont permis l’identification de 6 miARNs dans les VEs microgliales, dont un seul, miR-146a, est décrit à ce jour dans le SNC chez les mammifères. Dans un contexte de dialogue neuroprotecteur entre VEs microgliales et neurones, les analyses neuronales ont prédit des ARNm potentiellement régulés par les miARNs contenus dans les VEs. Ces 6 miARNs ont également été identifiés dans les VEs issues de microglie de souris, de rat et humaine. Dans leur ensemble, les résultats montrent que les cellules microgliales chez la sangsue produisent des VEs, ayant un effet neurotrophique sur les neurones, y compris des neurones de rat. L’identification des molécules présentes dans ces VEs (protéines et miARNs) a permis de soulever des perspectives sur les mécanismes neuroprotecteurs supportant ce dialogue microglie-neurone qu’il sera intéressant d’examiner chez les mammifères dans un contexte de lésion nerveuse In the Central Nervous System (CNS), the glial cells influence neuronal activities. The microglial cells, resident immune cells of the CNS, greatly control the neuroinflammatory state. This control is particularly important in physiological functions and is often defective in neuropathologies. The microglial cell activities depend on the brain microenvironment and they communicate with other cell types (astrocytes, oligodendrocytes and neurons) to control the neuroinflammatory state. Among the different mechanisms of intercellular communication within the CNS, extracellular vesicles (EVs) play a major role in physiological processes (development, homeostasis, etc.) and pathological processes (neurodegenerative diseases, etc.). Therefore, this mode of communication was studied in the dialogue between microglia and neurons in the leech Hirudo medicinalis. This annelid is an interesting model of neurobiology thanks to the linear structure of its nervous system and the organization of its cell types. It allows the study of the dialogue between microglial cells and neurons at the level of an experimental lesion. At first, the results showed that microglial cells interact with neurons during CNS injury and that EVs are released at the level of this lesion. In addition, microglial cells produce EVs that interact with neurons and deliver a neurotrophic effect in vitro on leech and rat neurons. In a second step, the complexity of the vesicular compounds as well as efficiency requirements related to the isolation methods led us to develop the non-targeted proteomic analysis on a large scale in order to validate the positive EV fractions but also to identify their biologically active protein signatures. In a last part, we were interested in the microRNAs (miRNAs) contained in microglial EVs. The results allowed the identification of 6 miRNAs in microglial EVs, of which only one, miR-146a, is described to date in the mammalian CNS. In a context of neuroprotective dialogue between microglial EVs and neurons, the analysis of neuronal protein signatures predicted mRNAs potentially regulated by miRNAs contained in EVs. These 6 miRNAs were also identified in EVs derived from mouse, rat and human microglia. Overall, the results show that microglial cells in the leech produce EVs, exerting a neurotrophic effect on neurons, including rat neurons. The identification of the molecules present in these microglial EVs (proteins and miRNAs) made it possible to raise perspectives on the neuroprotective mechanisms supporting this microglia-neuron dialogue that will be interesting to examine in mammals in a context of nerve injury

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Kowal, Joanna. "Comprehensive molecular characterization of extracellular vesicles : an approach to resolve their biogenetic and functional diversity." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCB012.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (EVs) participent à la communication intercellulaire. Dans la littérature actuelle, elles sont divisées en deux classes principales selon leur origine intracellulaire. En premier lieu, les exosomes sont formés à l'intérieur des endosomes multivésiculaires et sont libérés lors de la fusion de ces compartiments avec la membrane plasmique (MP). La taille des exosomes est contrôlée au cours de leur biogenèse et varie de 50 à 150 nm. Deuxièmement, les EVs sont formées par bourgeonnement direct et sécrétion à partir de la MP. Ces EVs sont plus hétérogènes et leur taille varie de 50 à 1000 nm. Malgré le fait que la nature hétérogène de EVs soit clairement documentée dans la littérature, la composition en protéines et les mécanismes exacts de la biogenèse des différentes EVs restent un sujet de débat en cours. Le but principal de ce travail était de redéfinir autant de sous-types différents d’EVs que possible, en trouvant des marqueurs protéiques spécifiques, et d'étudier les outils possibles pour affecter spécifiquement leur sécrétion. Dans ce projet, nous avons mis en place plusieurs outils utiles pour la caractérisation d’EVs. Tout d'abord, mes principaux efforts ont été concentrés sur la mise en place de plusieurs protocoles d'isolation et d'analyse d’EVs. Cela a conduit à la production d'une cartographie des protéines vésiculaires, qui si elle est appliquée pour caractériser les EVs, permettra de mieux les identifier par leur composition. Deuxièmement, j'ai étudié la façon dont la sécrétion de ces sous-populations d’EVs peut être modulée par l'inhibition de quelques protéines de la famille RAB et par certaines drogues. Enfin, grâce à une collaboration établie au sein de l'unité, j'ai eu l'occasion de participer à une comparaison des propriétés fonctionnelles entre les EVs et les virus sécrétés simultanément par les cellules infectées. Mes résultats confirment l'hypothèse selon laquelle l'origine intracellulaire des EVs sera reflétée dans leur composition. Les résultats présentés confirment la coexistence de plusieurs classes d'EVs et donnent un aperçu sur les moyens de les caractériser dans une préparation d’EVs donnée. En outre, nous fournissons un exemple de l'application de notre ensemble de protéines dans les études portant sur la biogenèse des EVs Extracellular vesicles (EVs) are participating in intercellular communication. Classically, in the current literature, they are divided into two main classes depending on their intracellular origin. Firstly, exosomes are formed within multivesicular endosomes and released upon fusion of these compartments with plasma membrane. The size of exosomes is controlled during their biogenesis and ranges from 50 to 150 nm. Secondly, EVs are formed by direct budding and pinching off from the plasma membrane. These EVs are more heterogeneous and their size varies from 50 to 1000 nm. Despite the fact that a heterogeneous nature of EVs is clearly documented in the literature, the exact protein content and biogenesis mechanisms of different EVs remain a matter of on-going debate. The principal goal of this work was to re-define as many different subtypes of EVs as possible, by finding specific protein markers, and investigate possible tools to affect specifically their secretion. In this project, we set up several tools useful for EV characterization. Firstly, my main efforts were concentrated on establishment of several protocols to isolate and analyse EVs. This led to the foundation of a vesicle protein cartography, which if applied to characterize EVs, will allow better understanding of the composition of the studied EVs. Secondly, I investigated how secretion of these EV subpopulations might be modulated by inhibition of a few RAB proteins and by some drugs. Finally, thanks to a collaboration established within the unit, I had the opportunity to participate in a comparison of the functional properties between EVs and viruses secreted simultaneously by infected cells. My results confirmed the hypothesis that the intracellular origin of EVs will be reflected in their composition. The results presented in this study point at the coexistence of several EV classes and provide insights on how to demonstrate their presence in a given EV preparation. In addition, we provide an example of the application of our set of proteins in studies addressing EV biogenesis

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Pariset, Eloïse. "Développement d'un dispositif microfluidique de Déplacement Latéral Déterministe (DLD) pour la préparation d'échantillons biologiques, en vue de l'extraction de vésicules extracellulaires." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018GREAY027/document.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (EVs) apparaissent depuis une dizaine d'années comme de nouveaux biomarqueurs à fort potentiel pour des applications de biopsie liquide. En effet, les EVs portent la signature de leurs cellules émettrices, par le transport de matériel génétique et protéique cellulaire, qui peut être exploité comme outil de diagnostic précoce. L’une des principales limitations actuelles à l'utilisation clinique des EVs est la difficulté à extraire ces nano-objets à partir de biofluides complexes et à standardiser les protocoles de préparation d'échantillon. En effet, de nouvelles technologies sont requises pour effectuer un isolement efficace, bas coût et rapide de sous-populations d'EVs, sans altérer leur intégrité et à partir de faibles volumes d'échantillon. La technique microfluidique de Déplacement Latéral Déterministe (DLD) apparaît comme une des technologies prometteuses pour atteindre ces performances grâce à une purification passive et sans marquage. Les dispositifs de DLD mettent en oeuvre un réseau de piliers générant un tri en taille des particules, et dont les paramètres géométriques permettent de contrôler précisément le diamètre de séparation. Parmi les nombreuses applications de cette technologie dans le secteur biomédical, aucune ne permet pour le moment de réaliser l'extraction complète d'EVs directement à partir du biofluide d'intérêt, sans étapes de purification intermédiaires par centrifugation par exemple. Dans cette perspective, nos développements technologiques ont pour but d'améliorer la fiablilité, l'efficacité et l'intégration des dispositifs de DLD. A partir d'études numériques et expérimentales, nous proposons ici de nouveaux modèles pour anticiper au mieux le comportement des particules lors de la conception de réseaux de DLD. Par ailleurs, dans une approche orientée système, nous proposons également un packaging fluidique des dispositifs de DLD. Plusieurs étapes de tri étant généralement requises pour la purification d’échantillons biologiques, nos développements portent également sur la façon d’interconnecter ces modules au sein d'une configuration en série. Deux applications biologiques sont adressées et démontrent la versatilité de la technologie de DLD : l'isolement de bactéries E. coli à partir de prélèvements sanguins humains - en vue du diagnostic du sepsis - et l'extraction d'EVs dans des milieux de culture cellulaires - avec en perspective la détection d'EVs spécifiques par biopsie liquide. L'étape de préparation d'échantillon ne peut être dissociée de l'étape de caractérisation. C'est pourquoi, l'isolement des EVs devra dans un second temps être couplé à leur analyse au sein d'un dispositif intégré, portable et autonome, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives vers l'application clinique des recherches actuelles sur les EVs Over the past decades, Extracellular Vesicles (EVs) have demonstrated strong potential as new biomarkers for liquid biopsy. Indeed, since EVs are fingerprints of parent cells, they can be exploited as early diagnostic tools. However, owing to their small size and high heterogeneity, EVs are challenging to extract from biofluids. In particular, reproducible and standardized protocols are required to perform fast, efficient, and cost-effective preparation of undamaged EV subpopulations from limited sample volumes. Deterministic Lateral Displacement (DLD) appears to be a promising microfluidic technology for this preparation by means of passive and label-free separation. DLD performs size-based separation of particles around a critical diameter that can be fine-tuned according to design parameters in an array of micropillars. Across the numerous biotechnological applications of DLD, none has yet successfully performed the complete extraction of EVs from unprocessed biofluids. This is the underlying motivation of this thesis, which outlines technological enhancements that make DLD separation more predictable, efficient, and easy-to-integrate. Based on both numerical and experimental developments, predictive models are proposed in order to anticipate particle behavior and to help in the design of efficient DLD devices. In addition to the optimization of single DLD devices, this thesis also addresses the issue of system integration. An innovative approach of serial connection between DLD modules is proposed to address the sequential sorting of particles from a complex biofluid and ensure that there is no loss of function of individual DLD devices when operated alone or in series. Two biological applications illustrate the potential of DLD-based sample preparation systems: the isolation of E. coli bacteria from human blood samples for sepsis diagnostics and the extraction of EVs from cell culture media with the perspective of liquid biopsy applications. And as sample preparation cannot be dissociated from detection or characterization, this thesis moreover highlights the potential integration of DLD in an all-in-one microfluidic device for both sample preparation and analysis of extracted EVs. Such a portable and autonomous device could overcome some of the current limitations with regard to the clinical use of EVs

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Castro, Cruz Monica del Carmen. "The impact of the syndecan-PDZ interactome on endosomal trafficking and extracellular vesicle composition." Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0302.

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Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologie Syndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease

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Le, Riche Alizée. "Etude fonctionnelle de vésicules extracellulaires sur la physiologie de la papille dermique." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC335.

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La papille dermique (DP) joue un rôle central dans la morphogenèse et le cycle du follicule pileux (FP) via des interactions épithélium-mésenchyme. Certains facteurs sont cruciaux dans le développement du FP comme les voies de la β-caténine et les bone morphogenetic proteins (BMP) ou encore les facteurs de croissance tels que les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou les facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF). Les DP intactes peuvent être greffées, avec des cellules épidermiques, pour reconstituer des FP chez la souris. Cependant, les cellules de DP (DPC) perdent rapidement leur capacité régénératrice en culture, sauf si elles sont cultivées en sphère. Cette reprogrammation par le micro-environnement permet la restauration partielle de la capacité des DPC à générer des FP. Notre objectif est d'étudier le dialogue entre le FP et son macroenvironnement à travers la sécrétion de vésicules extracellulaires (EVs) ainsi que leur potentiel à activer les DPC et à stimuler la croissance des FP. Pour récapituler l'activation des DPC in vitro,les fibroblastes dermiques humains (FHN) ont été stimulés à la fois par le bFGF et le PDGF-AApuis les EVs sécrétées ont été purifiées (2GF-EVs). Remarquablement, les 2GF-EVs augmentent la croissance des FP ex-vivo comparativement aux FP non traités ou traités avec les ctrl-EVs. De plus, les 2GF-EVs modulent des gènes dont l’expression a été restaurée par la formation de sphères, dont Norrin (NDP). L’augmentation de la sécrétion de Norrin, un agoniste de la voie wnt/β-caténine, parles DPC semble activer en retour cette voie dans les kératinocytes du follicule pileux (Kf) alors que les facteurs de croissance solubles ne le font pas. En conclusion, les EVs pourraient être un modulateur de l’activation des DPC et un outil précieux pour maintenir et restaurer, via la protéine Norrin, la capacité inductrice des DPC et le cycle des FP Dermal papilla (DP) displays a pivotal role in hair follicle (HF) morphogenesis andcycling through epithelial-mesenchymal interactions. Some factors are crucial in HF development like β-catenin and bone morphogenetic protein (BMP) pathways or also growth factors such as fibroblast growth factors (FGF) or platelet derived growth factor (PDGF). Intact DP can be engrafted with epidermal cells to reconstitute hair follicle (HF) on mice. However, DP cells (DPC) gradually lost their regenerative capacity after being passaged except if they are cultivated as spheres. This micro-environmental reprogramming partially restores the inductive ability of DPCto make HF. Our objective is to study the dialogue between HF and its macro-environment through secretion of extracellular vesicles (EVs) and their potential to activate DPC and stimulate HFgrowth. To recapitulate DPC activation in vitro, human dermal fibroblasts were stimulated by both bFGF and PDGF-AA and secreted EVs were purified (2GF-EVs). Remarkably, 2GF-EVs enhance the growth of HF cultivated ex-vivo as compared with no treated or treated with ctrl-EVs. Moreover, 2GF-EVs modulate genes whose expression was restored by sphere formation, including Norrin (NDP). The increase of Norrin secretion, an agonist of the wnt/β-catenin pathway, by DPC apparently activated this pathway in HF keratinocytes whereas the soluble growth factors did not. In conclusion, EVs could be a modulator of DPC activation and a valuable tool to maintain and restore, via the protein Norrin, DPC inductive ability and HF cycling

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Marcoux, Geneviève. "Étude du potentiel inflammatoire et immunitaire des vésicules extracellulaires dérivées des plaquettes." Doctoral thesis, Université Laval, 2021. http://hdl.handle.net/20.500.11794/69305.

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Abstract:

Les plaquettes sont très abondantes dans le sang où elles ont un rôle dans l'hémostase, l’inflammation et l’immunité. Activées, elles vont subir un changement de conformation qui permet la libération de nombreuses molécules effectrices ainsi que la production de vésicules extracellulaires (EV). Les EV sont formées par le bourgeonnement de la plaquette et emportent une partie de son contenu, incluant des acides nucléiques, des protéines de surface et des organelles. Hétérogène, le contenu diversifié des EV de plaquettes suggère qu’elles peuvent exercer de nombreuses fonctions. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à l’utilisation de l’algorithme SPADE couplé à la cytométrie en flux pour améliorer la détection d’EV et mieux apprécier leur hétérogénéité dans des concentrés plaquettaires (PC) servant à la transfusion. Nous avons aussi évalué l’utilisation de cette approche pour le développement de biomarqueurs dans le cadre de l’analyse d’EV dans le liquide synovial de patients arthritiques. Cette étude a révélé que l’utilisation d’algorithmes couplés à la cytométrie en flux tels que SPADE pourrait faciliter la compréhension des fonctions des EV et le développement de leur étude comme biomarqueurs. Nous nous sommes ensuite intéressés à une première sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent des mitochondries (mito+EV). Nous avons émis l'hypothèse que ces mito+EV représentent un réservoir d'ADN mitochondrial, signal de danger (motifs moléculaires associés aux dommages, DAMP) reconnu et présent dans de nombreuses conditions inflammatoires, et qu’elles pourraient être impliquées dans les réactions transfusionnelles. Nous avons observé que les mito+EV étaient plus abondantes dans les PC impliqués dans des réactions transfusionnelles et qu’elles corrèlent significativement avec l’ADN mitochondrial. Comme la majorité de l’ADN mitochondrial est encapsulée dans des EV, cette étude suggère que les EV peuvent être un biomarqueur utile pour la prédiction du risque potentiel de réactions transfusionnelles, bien que des investigations soient iii nécessaires pour déterminer s'il existe un rôle pathogène causal du DAMP mitochondrial encapsulé dans les EV par opposition à l'ADN mitochondrial en solution. Nous nous sommes enfin intéressés à une seconde sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent du protéasome. Les plaquettes contiennent un protéasome actif et présentent des antigènes par l'intermédiaire du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) ce qui leur confère une fonction dans l’immunité adaptative. Étant donné qu’il n’a jamais été examiné si le protéasome est également transféré dans les EV de plaquettes auparavant, nous avons émis l'hypothèse qu'une machinerie fonctionnelle pour l'apprêtement et la présentation de l'antigène est transférée aux EV de plaquettes. En utilisant une combinaison d'analyses moléculaires et fonctionnelles, nous avons montré la présence d'un protéasome 20S actif dans diverses conditions où les plaquettes sont activées, ainsi que du CMH I et des molécules de coactivation des lymphocytes. L’incubation d’EV de plaquettes avec l’ovalbumine (OVA) a mis en évidence, par l'activation et la prolifération des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène OVA, qu’elles peuvent apprêter et présenter efficacement l’antigène. Ces résultats suggèrent que les EV de plaquettes contribuent à l'immunité adaptative. Dans l’ensemble, nous avons montré que les EV de plaquettes ont un rôle dans l’inflammation et l’immunité avec leur contenu en mitochondries et en protéasome. Elles sont hétérogènes et peuvent être utilisées comme biomarqueurs dans différents contextes. Platelets are very abundant in the blood where they play a role in hemostasis, inflammation and immunity. Activated, platelets will undergo a change of conformation which allows the release of numerous effector molecules as well as the production of extracellular vesicles (EVs). EVs are formed by the budding of the platelet and bring some of its contents, including nucleic acids, surface proteins and organelles. Heterogeneous, the diverse content of platelet EVs suggests that they can perform many functions. As part of this thesis, we first looked at the use of the SPADE algorithm coupled with flow cytometry to improve the detection of EVs and allow a better appreciation of their heterogeneity in platelet concentrates (PC) used for transfusion. We also evaluated the use of this approach for the development of biomarkers in the analysis of EVs in the synovial fluid of arthritis patients. This study revealed that the use of algorithms such as SPADE coupled with flow cytometry could facilitate the understanding of the functions of EVs and the development of their studies as biomarkers. We then looked at a first subcategory of platelet EV, those that contain mitochondria (mito+EVs). We hypothesized that these mito+EVs represent a reservoir of mitochondrial DNA, a damage-associated molecular pattern (DAMP) recognized and present in many inflammatory conditions, and that they could be involved in transfusion reactions. We observed that mito+EVs were more abundant in PCs involved in transfusion reactions and that they correlate significantly with mitochondrial DNA. As the majority of mitochondrial DNA is encapsulated in EVs, this study suggests that EVs may be a useful biomarker for predicting the potential risk of transfusion reactions, although further investigation is needed to determine if there is a pathogenic role of mitochondrial DAMP encapsulated in EVs as opposed to mitochondrial DNA in solution. We finally focused on a second subcategory of platelet EVs, those that contain proteasome. Platelets contain an active proteasome and present antigens through the major histocompatibility complex I (MHC I), which gives them an important function in adaptive immunity. Whether the proteasome is also transferred into the v platelet EVs has never been examined. We hypothesized that a functioning machinery for the processing and presentation of the antigen is transferred to the platelet EVs. Using a combination of molecular and functional assays, we have demonstrated the presence of an active 20 S proteasome under various conditions where platelets are activated, as well as MHC I and lymphocyte coactivation molecules. Demonstrated by activation and proliferation of ovalbumin (OVA) antigen specific CD8 + T lymphocytes, EVs from platelets incubated with OVA can efficiently prepare and present antigen. These results suggest that platelet EVs contribute to adaptive immunity. Overall, we have shown that platelet EVs have a role in inflammation and immunity with their mitochondria and proteasome content. They are heterogeneous and can be used as biomarkers in different contexts.

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Vallier, Loris. "Activités procoagulante et fibrinolytique des microvésicules : de leur rôle dans la physiopathologie du sepsis au développement de nouveaux tests de diagnostic in vitro en hémostase." Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://www.theses.fr/2019AIXM0666.

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Abstract:

Les microvésicules (MV) sont des vésicules extracellulaires submicroniques libérées à la suite du réarrangement des phospholipides membranaires en réponse à un stimulus extérieur ou à l'apoptose. Les MV sont des vecteurs bioactifs dont le rôle dans l'hémostase et la réponse inflammatoire est bien décrit à ce jour. La vision initiale attribuant aux MV une activité uniquement procoagulante a été récemment élargie par la démonstration d'une activité fibrinolytique. Cette thèse comporte deux volets, le premier s’intéresse à la mesure de l’activité procoagulante des MV (MV-FT), en optimisant les performances analytiques de la mesure de l’activité du facteur tissulaire des MV et un deuxième volet de cette thèse s’est intéressé à un nouveau mécanisme reliant la génération de plasmine des MV de granulocytes (Gran-MV) au pronostic des patients en choc septique (CS). Cette activité fibrinolytique implique le complexe entre l’urokinase (uPA) et son récepteur porté par les Gran-MV jouant un rôle de vecteur d'activité fibrinolytique. Cette activité thrombolytique s'intègre dans un rôle protecteur des MV capables de contrebalancer le risque de microthrombose systémique associé à la gravité dans le CS. Cette activité fibrinolytique identifie les MV non seulement comme biomarqueurs, mais également en tant qu’agent thérapeutiques potentielles. La maîtrise de ces tests fonctionnels d’activité de génération de plasmine des MV (MV-PGC) et d’activité MV-FT, utilisant les MV comme biomarqueurs dans l’évaluation du statut hémostatique du patient, est une étape essentielle pour accélérer le transfert de ces innovations diagnostiques et thérapeutiques au chevet du patient Microvesicles (MV) are submicron extracellular vesicles released following the rearrangement of membrane phospholipids in response to an external stimulus or apoptosis. MV are bioactive vectors whose role in hemostasis and inflammatory response has been well described to date. The initial vision attributing to MV only procoagulant activity has recently been widened by the demonstration of fibrinolytic activity. This thesis has two parts, the first part focuses on the measurement of procoagulant activity of MV (MV-FT), by optimizing the analytical performance of measuring the activity of tissue factor on MV and a second part of this thesis was interested in a new mechanism linking the plasmin generation activity of MV from granulocytes (Gran-MV) to the prognosis of patients with septic shock (CS). This fibrinolytic activity involves urokinase (uPA) and its receptor carried by Gran-MV playing a role of vector of fibrinolytic activity. This thrombolytic activity is part of a protective role for MV capable of counterbalancing the risk of systemic microthrombosis associated with severity in CS. This fibrinolytic activity identifies MV not only as biomarkers, but also as potential therapeutic agents. These functional tests of MV plasmin generation activity (MV-PGC) and MV-FT activity, using MV as biomarkers in the evaluation of the patient's hemostatic status, is an essential step to accelerate the transfer of these diagnostic and therapeutic innovations to the bedside

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Galvanin, Adeline. "Use of high-throughput sequencing for the characterization of extracellular RNA and to study the dynamics of bacterial RNA modification." Thesis, Université de Lorraine, 2019. http://www.theses.fr/2019LORR0095/document.

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Abstract:

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated

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Kervadec, Anaïs. "Évaluation des vésicules extracellulaires dérivées de cellules cardiaques humaines comme une alternative à la greffe des cellules : applications dans un modèle d'insuffisance cardiaque chronique." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCB015/document.

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Abstract:

L’insuffisance cardiaque (IC) est un problème majeur de santé publique. La pénurie des greffons cardiaques et la résistance de nombreux patients aux traitements conventionnels ont poussé les chercheurs à développer de nouvelles thérapeutiques dont la thérapie cellulaire. Bien que l’idée initiale de la thérapie cellulaire ait été de repeupler la partie nécrosée du cœur par l’administration de cellules viables et fonctionnelles, leur disparition rapide alors que les bénéfices perdurent dans le temps a conduit à l’hypothèse que les cellules agiraient via un mécanisme paracrine. Les vésicules extracellulaires (VE), incluant les exosomes et les microparticules, seraient principalement impliquées dans ce processus. Elles agiraient ainsi comme de véritables navettes transportant des biomolécules actives permettant d’activer des voies de réparation endogènes dans le tissu traité. Ce projet de thèse a pu mettre en évidence : 1) La non-infériorité des VE issues de progéniteurs cardiovasculaires (Pg) dérivés de cellules souches embryonnaires humaines par rapport à leurs cellules d’origine dans un modèle murin d’IC chronique (ICC). Ces VE activeraient des voies de signalisation endogènes impliquées dans la stimulation de la prolifération cellulaire, la survie cellulaire, la réparation de l’ADN et la diminution de la fibrose. Leur contenu moléculaire spécifique, et notamment les microARN, pourrait être impliqué dans ces phénomènes. 2) L’importance du choix du type cellulaire dans la production de VE efficaces sur le plan thérapeutique puisque ni les VE dérivées de cardiomyocytes matures ni celles de cellules souches mésenchymateuses n’ont eu d’effets bénéfiques sur la fonction cardiaque de souris en ICC. 3) L’implication des VE dans l’effet paracrine des cellules, confirmée par l’amélioration de la fonction cardiaque chez des souris présentant une ICC traitées avec des VE issues de Pg dérivés d’iPS. Des tests fonctionnels in vitro ont montré que les VE auraient un rôle pro-angiogénique, pro-prolifératif et amélioreraient la survie des cellules. Une thérapie a-cellulaire aurait une réelle pertinence clinique en réglant une partie des problèmes techniques, immunologiques et sécuritaires associés aux greffes de cellules. Si cette hypothèse est confirmée, il pourrait en résulter une simplification des problèmes réglementaires, une diminution des coûts de production et de ce fait une plus grande diffusion clinique de la méthode Heart failure (HF) is a major public health concern. The lack of donor hearts and the resistance of numerous patients to conventional treatments has led scientists to develop new therapies such as cell therapy. The initial goal of cell therapy was to repopulate the infarcted heart by directly injecting viable and functional cells. However, the rapid disappearance of the transplanted cells contrasts with their long term, ongoing functional benefits, suggesting that cells may act through a paracrine mechanism. Extracellular vesicles (EV), including exosomes and microparticles, may be key to this process, acting as shuttles to transport bioactive macromolecules that stimulate endogenous repair pathways in the host tissue. This PhD project demonstrates: 1) The non-inferiority of EV secreted by cardiovascular progenitors (Pg) derived from human embryonic stem cells as compared to their parent cells in a mouse model of chronic HF (CHF). These EV could act by the activation of endogenous signaling pathways implicated in cell proliferation, survival, DNA repair and decreased fibrosis. Their specific content, such as miRNA, could be involved in these benefits. 2) The importance of the cell type in the production of therapeutically effective EV, since EV derived from mature cardiomyocytes and mesenchymal stem cells did not improve cardiac function in mice with CHF. 3) The importance of EV in paracrine effects of cells, confirmed by the improvement of cardiac function in mice with CHF treated with EV secreted by Pg derived from iPS cells. In vitro data shows that EV might have pro-angiogenic, pro-proliferative and pro-survival effects. An acellular therapy should be clinically relevant by reducing technical, immunological and safety problems associated with cell transplantation. If this hypothesis is confirmed, regulatory concerns would be simplified and production costs reduced, facilitating large-scale production

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Amosse, Jérémy. "Etude et caractérisation des vésicules extracellulaires dans un contexte d’obésité Phenotyping of circulating extracellular vesicles (EVs) in obesity identifies large EVs as functional conveyors of Macrophage Migration Inhibitory Factor Extracellular vesicles and cardiovascular disease therapy." Thesis, Angers, 2019. http://www.theses.fr/2019ANGE0037.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanovésicules dérivées de la membrane cellulaire reconnues comme des vecteurs de communication intercellulaire participant ainsi à de nombreux processus physiopathologiques. Deux sous-types de VEs peuvent être distingués sur la base de leur origine subcellulaire et leur taille : les grosses vésicules/microvésicules (ou lEVs) et les exosomes (ou sEVs). Dans un contexte d’obésité, les VEs ont été impliquées dans le développement des complications métaboliques, notamment l’insulino-résistance. Une étude plus approfondie reste nécessaire pour identifier les acteurs moléculaires impliqués dans ces mécanismes, dans un but thérapeutique ou pour l’identification des VEs adipeuses à des fins de biomarqueurs. Mon projet de thèse a consisté à caractériser les sous-types de VE adipeuses, à évaluer leur sécrétion et leur proportion dans la circulation sanguine ou encore leurs effets métaboliques respectifs sur des cellules/tissus cibles. Dans un premier temps, nous avons évalué la contribution des VEs circulantes dans le transport des adipokines connus pour participer à la mise en place des dysfonctions métaboliques. Nous montrons qu’une majorité du facteur MIF (Macrophage migration Inhibitory Factor) circule associé aux grosses VEs dans le sang identifiant une nouvelle voie de sécrétion pour cette protéine. MIF associé aux lEVs est fonctionnel et utilise son activité tautomérase pour activer la voie ERK, révélant un mécanisme d’activation de l’inflammation différent de celui utilisé par le MIF soluble. La forme de MIF associée aux VEs pourrait ainsi participer aux effets inflammatoires induits par ce facteur. Dans un second temps, nous souhaitions quantifier la proportion de VEs dérivées du TA se retrouvant dans la circulation sanguine. La caractérisation des VEs sécrétées par les différents dépôts adipeux murins dans un contexte sain et d’obésité a révélé la forte présence d’adiponectine, très enrichie dans les sEVs, sous la forme d’oligomères métaboliquement actifs. Le contenu en adiponectine des VEs est significativement diminué avec l’obésité, à l’image de l’adiponectinémie, et nous révélons une adsorption aspécifique de l’hormone adipocytaire sur la surface des VEs. Sur la base de ces résultats, nous concluons au manque de fiabilité de l’utilisation de l’adiponectine comme marqueur phénotypique des VEs adipocytaires circulantes. Dans une dernière partie, nous avons étudié les effets des sEVs et lEVs dérivées de tissus adipeux (TA) de souris témoins ou obèses sur le métabolisme et le phénotype adipeux de souris. Nos premières expériences confirment la capacité des sEVs obèses à induire une insulinorésistance périphérique chez des souris saines, qui pourrait être liées à une moindre sensibilité à l’insuline des tissus adipeux (TA) inguinaux et musculaires. En outre, nous révélons la capacité de ces VEs à induire la beigisation du TA et à favoriser la fibrose tissulaire. Enfin, nos données révèlent des effets métaboliques différents selon le sous-type de VEs adipeuses étudié qui pourraient être liées à des capacités différentes à moduler l’inflammation tissulaire. Ainsi, les VEs dérivées du TA apparaissent comme de véritables acteurs de la communication intercellulaire participant aux dysfonctions métaboliques liées à l’obésité. Bien que les mécanismes sous-jacents à l’action de ces VEs restent encore à élucider, nos résultats apportent une meilleure caractérisation de ces vésicules et révèlent la nécessité de distinguer les sous-types de VEs qui produisent des effets métaboliques différents Extracellular vesicles (EVs) are nanovesicles derived from the cell membrane that are recognized as vectors of intercellular communication and thus participate in many physiopathological processes. Two subtypes of EVs can be distinguished according to their subcellular origin and size: large vesicles/microvesicles (or lEVs) and exosomes (or sEVs). In the context of obesity, EVs have been involved in the development of metabolic complications, including insulin resistance. Nonetheless, additionnal studes are still needed to identify the molecular actors involved in these mechanisms, for future therapeutic use or for the identification of fat-derived EVs for biomarker purposes. My thesis project aims to characterize adipose EV subtypes, to evaluate their secretion and proportion in the bloodstream as well as their respective metabolic effects on target cells/tissues. First, we evaluated the contribution of circulating EVs in the transport of adipokines known to participate to the development of obesity- associated metabolic dysfunctions. We demonstrate that the majority of MIF factor (Macrophage migration Inhibitory Factor) circulates within large EVs in the blood, therefore identifying a new secretion pathway for this protein. Large EVs-associated MIF is functional and uses its tautomerase activity to activate the ERK pathway, revealing a different inflammation activation mechanism from that used by soluble MIF. EV-associated MIF could thus contribute to the inflammatory effects induced by this factor. Second, we wanted to quantify the proportion of adipose tissue (AT)-derived EVs in the bloodstream. Through characterization of EVs secreted by murine adipose depots in healthy and obese context, we revealed adiponectin enrichment in sEVS, retrieved under high oligomeric active forms. However, EV-associated adiponectin is significantly decreased with obesity, paralleling adiponectinemia. We moreover reveal non-specific adsorption of this adipocyte hormone on EV surface. Based on these results, we conclude that the use of adiponectin as a phenotypic marker for identifying and quantifying adipocyte-derived EVs in blood samples is unreliable. Finally, we studied the metabolic effects of fat-derived lEVs and sEVs isolated from control or obese mice following their injection in lean mice. Our first experiments confirm the ability of obese fat-derived sEVs to induce peripherical insulin resistance in healthy mice, which may be related to reduced insulin sensitivity in inguinal AT and skeletal muscle. In addition, we reveal the ability of these EV subtype to induce AT beiging in the recipient mice and to promote AT fibrosis. By comparing metabolic effects of the different injected EV subtypes, we highlighted distinct metabolic effects that may be related to their different abilities to modulate AT inflammation. Thus, EVs derived from AT appear to be crucial players of AT intercellular communication with other organs and likely participate to metabolic dysfunctions related to obesity. Although the mechanisms underlying the action of AT-derived EVs remain to be elucidated, our results provide a better characterization of these vesicles and reveal the need to distinguish EV subtypes since their display different metabolic effects in target tissues

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Ribault, Alexandre. "Effets thérapeutiques des vésicules extracellulaires pour le traitement des lésions radio-induites musculo-cutanées." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS135.

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Abstract:

L’exposition à des doses élevées de rayonnements ionisants (RI), consécutive à un accident d’origine industrielle ou médicale, provoque des lésions ou syndromes aigus, et peut conduire à l’apparition de complications chroniques, jusqu’à plusieurs années après exposition. La recherche de biomarqueurs d’exposition aux RI constitue par conséquent un enjeu majeur de santé publique, dans le but d’améliorer la prise en charge des individus exposés. De plus, la prédiction de la sévérité des complications développées après exposition reste encore à ce jour mal maitrisée. Dans le cas du syndrome cutané d’irradiation localisée, la prise en charge des victimes fait appel à la thérapie cellulaire par injection de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) autologues, associée à la chirurgie (exérèse et autogreffe). Les recherches récentes chez l’animal ont montré que les CSM contribuent au contrôle de l’inflammation et favorisent la régénération tissulaire, principalement par leur activité paracrine. Celle-ci conduit notamment à la production de vésicules extracellulaires (VE), incluant exosomes et microvésicules (MV). Les VE sont des vecteurs d’information biologique intervenant dans la communication intercellulaire, et impliqués dans de nombreux phénomènes physiologiques et pathologiques. Plusieurs études ont démontré l’efficacité thérapeutique des VE (exosomes) dans divers modèles précliniques d’ischémie du rein et du cœur, ou de cicatrisation cutanée. D’autre part, de nombreux travaux suggèrent d’utiliser les VE comme biomarqueurs, notamment dans le contexte des maladies cardiovasculaires et des cancers. Les objectifs de cette thèse visent à démontrer le potentiel thérapeutique des VE pour le traitement des brûlures radiologiques, et à évaluer l’utilisation des VE en tant que biomarqueur pronostic de toxicité radio-induite consécutive à une radiothérapie. A l’aide d’un modèle préclinique de brûlure radiologique, nous avons mis en évidence le potentiel thérapeutique des exosomes issus de CSM humaines. En particulier, nos résultats montrent que : 1- les exosomes ont un effet bénéfique sur la réparation de la lésion cutanée radio-induite ; 2- les exosomes stimulent l’angiogenèse, notamment en rétablissant la perfusion cutanée et la densité vasculaire du membre irradié, et en augmentant les concentrations tissulaires et systémiques de facteurs pro-angiogéniques ; 3- les exosomes favorisent la mobilisation des monocytes sur le site lésé, qui participent à la reconstruction du réseau vasculaire. D’autre part, l’utilisation des VE comme biomarqueurs a été évaluée par une étude clinique sur une cohorte de patients traités pour un cancer de la prostate par radiothérapie. Nous avons montré que les MV, mais pas les exosomes, pourraient être utilisées en tant que biomarqueurs des complications tardives les plus graves. Nous montrons ainsi que : 1- le nombre de MV issues de plaquettes, de monocytes et de cellules endothéliales, est corrélé au risque de développer une toxicité sévère post-exposition ; 2- le contenu protéique des MV permet de distinguer les patients ayant développé les complications les plus sévères ; 3- les quantités de MV issues de plaquettes et de monocytes sont corrélées aux doses de RI reçues par les organes à risques (vessie, rectum, prostate antérieure). En conclusion, ce travail apporte des éléments nouveaux concernant le pronostic et le diagnostic d’individus exposés aux rayonnements ionisants. L’utilisation des VE pourrait permettre d’améliorer la rapidité et l’efficacité de leur prise en charge, tout en proposant une solution thérapeutique applicable à un large panel de victimes. De plus, cette étude permettrait d’envisager un transfert clinique pour le traitement de la brûlure cutanée radio-induite Exposure to high dose ionizing radiation (IR), consecutive to accidents of industrial or medical origin, results in acute syndromes or lesions, potentially leading to late chronic complications, appearing up to several years following IR exposure. Therefore searching for biomarkers of IR exposure represents a major public health challenge, in order to improve the medical management of exposed individuals. In addition, the prediction of the severity of complications developed following exposure still remains difficult and unreliable. In the context of the localized cutaneous radiation syndrome, the medical management of the victims involves cell therapy by injection of autologous mesenchymal stromal cells (MSCs), combined with surgery (exeresis and autograft). Recent research on animal models has shown that MSCs contribute to the control of inflammation, and promote tissue regeneration essentially owing to their paracrine activity. In particular, this activity leads to the production of extracellular vesicles (EVs), including microvesicles (MVs) and exosomes. EVs are carriers of biological information participating in intercellular communication, and involved in numerous physiological and pathological processes. A number of studies have demonstrated the therapeutic efficacy of EVs (exosomes) in different preclinical models of kidney and heart ischemia, or cutaneous wound healing. Moreover, several studies suggested that EVs could be used as biomarkers, in particular in the context of cardiovascular diseases and cancer. The objectives of this thesis project aim at demonstrating the therapeutic potential of EVs for the treatment of radiological burns, and evaluating the use of EVs as prognostic biomarkers of radiation-induced toxicity following radiotherapy. Owing to a preclinical model of radiological burn, we demonstrated the therapeutic potential of exosomes derived from human MSCs. Specifically, our results show that: 1- exosomes exert a beneficial effect on tissue repair of the radiation-induced cutaneous injury; 2- exosomes stimulate angiogenesis, in particular by restoring the cutaneous perfusion and the vascular density of the irradiated limb, and by increasing the tissue and systemic concentrations of pro-angiogenic factors; 3- exosomes promote the mobilization of monocytes toward the injury site, where they participate to rebuild the vascular network. Furthermore, the use of EVs as biomarkers was evaluated through a clinical study on a cohort of patients treated by radiotherapy against prostate cancer. We showed that circulating MVs, but not exosomes, could be used as biomarkers of late high grade toxicity. We indeed show that: 1- the number of MVs produced by platelets, monocytes and endothelial cells, is correlated with the risk of developing severe toxicity following RI exposure; 2- the protein content of MVs allows to discriminate patients with highest toxicity grade; 3- the amount of platelet- and monocyte-derived MVs correlates with IR doses received by the organs at risk (bladder, rectum, anterior prostate). In conclusion, this work brings new insights regarding the prognostic and diagnostic of individuals exposed to ionizing radiations. The use of EVs could allow a faster and more effective medical management of these patients, while offering a therapeutic solution applicable to a large panel of victims. In addition, this study allows to consider the possibility of a clinical transfer for the treatment of radiation-induced cutaneous burn

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Heliot, Amélie. "Étude de la réponse cellulaire et des Vésicules Extracellulaires produites par des macrophages primaires exposés aux particules fines (PM₂.₅)." Thesis, Littoral, 2018. http://www.theses.fr/2018DUNK0522.

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Abstract:

La pollution atmosphérique est un problème de santé publique. En 2013, le Centre International de Recherche sur le Cancer a classé la pollution de l'air, ainsi que les particules fines (PM₂.₅), de taille inférieure à 2,5 µm, comme cancérogène de groupe I pour l'homme. Les PM₂.₅ ont la capacité de pénétrer en profondeur dans l'appareil respiratoire. En se déposant au niveau des alvéoles pulmonaires, elles entraînent une réponse inflammatoire importante notamment via la libération de médiateurs de l'inflammation et des vésicules extracellulaires (EV) par les cellules immunitaires infiltrantes ou résidentes. Dans ce contexte, ce projet de thèse comportait deux objectifs majeurs : i) déterminer les caractéristiques chimiques des PM₂.₅ collectées en milieu industrialo-urbain, en identifier les origines et la variabilité saisonnière de leur composition chimique ; ii) étudier la réponse et les EV produites par les macrophages suite à l'exposition aux PM₂.₅ et observer les effets des EV sur les cellules pulmonaires.Pour cela, des macrophages primaires ont été exposés aux PM₂.₅ prélevées à Dunkerque et leur réponse cellulaire (stress oxydant, inflammation, polarisation, miARN) a été mesurée. Les EV produites en réponse à cette exposition ont été isolées et caractérisées. Enfin, des cellules épithéliales pulmonaires, les BEAS-2B, ont été exposées aux EV libérées en réponse à l'exposition aux PM₂.₅ et les effets de cette exposition (inflammatoire, stress oxydant, miARN) ont été mesurés. Nous avons mis en évidence une inflammation et une réponse anti-oxydante dans les macrophages, ainsi qu'une modification de leur polarisation. Les PM₂.₅ entrainent une libération plus importante d'EV Air pollution is a major public health problem. In 2013, The International Agency for Research on Cancer classified air pollution and fine particle (PM₂.₅), with size lower than 2.5 µm, as carcinogenic to humans (group I). PM₂.₅ are able to penetrate deeply in lungs. When PM₂.₅ settle in pulmonary alveolar, they lead to strong inflammatory response, with inflammatory mediators ans extracellular vesicles release by infiltrating or resident immune cells. In this context, this thesis included two major aims : i) evaluate the physico-chemical characteristics of PM₂.₅ sampled in an industrial-urban site, identify their origin and study the seasonal variability of their composition ; ii) investigate the cellular response and EV produced by macrophages in response to PM₂.₅ and study EV's effects on epithelial cells. To achieve this, macrophages are exposed to PM₂.₅ collected in Dunkerque, and cellular response (oxidative stress, inflammation, polarization, miRNA) was quantified. EV released in response to PM₂.₅ exposition was isolated and characterized. Finally, epithelial cells, BEAS-2B, are exposed to EV released by exposed and non exposed macrophages to evaluate effects from this exposure (inflammation, oxidative stress, miRNA). We observed inflammation and anti-oxidant response in macrophages after PM₂.₅ exposure, as well as polarization modification. PM₂.₅ lead to increased number of EV by macrophages

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Tessandier, Nicolas. "La circulation lymphatique véhicule des vésicules extracellulaires au cours de la polyarthrite rhumatoïde." Doctoral thesis, Université Laval, 2020. http://hdl.handle.net/20.500.11794/69020.

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Mansour, Ali. "Mécanismes physiopathologiques de la calcification vasculaire : les vésicules extracellulaires comme cible thérapeutique potentielle." Thesis, Amiens, 2020. http://www.theses.fr/2020AMIE0029.

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Abstract:

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont classées en tête de liste parmi les principales causes de décès dans le monde. La calcification de la paroi vasculaire entraîne diverses conséquences cardiovasculaires critiques et explique les taux de mortalité élevés chez les patients atteints de nombreuses maladies comme le diabète, l'athérosclérose et la maladie rénale chronique (IRC). VC est un processus actif avec des caractéristiques de la physiologie osseuse et il est régulé par des processus inductifs et inhibiteurs multifactoriels. Au cours du processus de calcification, les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) subissent un processus ostéogénique actif pour devenir des cellules de type ostéoblaste et libérer des populations hétérogènes de Vésicules Extracellulaires (EV). Les VE agissent comme des foyers de nucléation pour la cristallisation grâce à leur interaction avec le collagène de type 1 (Col1) via les intégrines et leur teneur en protéines procalcifiantes soutient fortement la progression de la calcification. Parce que ces deux mécanismes sont cruciaux pour le développement de la VC, ils représentent finalement deux cibles thérapeutiques pour la régression de la VC. Notre objectif principal était d'identifier de nouvelles molécules naturelles ou synthétisées chimiquement pouvant inhiber la VC. Nous avons démontré la capacité d'un acide oligogalacturonique spécifique (DP8), extrait de graines de lin, à inhiber la calcification induite par Pi in vitro et ex vivo en diminuant l'expression des marqueurs ostéogéniques, masquant une répétition consensus des acides aminés trouvée dans Col1 (séquence: GFOGER) , et empêchant ainsi les VE de se lier. Nous avons également synthétisé chimiquement un peptide GFOGER et vérifié sa capacité à inhiber la calcification. Semblable à DP8, le peptide GFOGER a été capable d'inhiber la calcification induite par Pi in vitro et ex vivo en régulant à la baisse l'expression des marqueurs ostéogéniques et en modifiant la teneur en protéines des EV dérivés des VSMC. Par conséquent, nos travaux suggèrent deux nouvelles approches thérapeutiques pour la prévention de la CV Cardiovascular diseases (CVDs) are classified on top of the list among different death leading causes in the world. Calcification of the vessel wall leads to various critical cardiovascular consequences and accounts for high mortality rates in patients with many diseases like diabetes, atherosclerosis and chronic kidney disease (CKD). VC is an active process with features of bone physiology and it is regulated by multifactorial inductive and inhibitory processes. During the calcification process, Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) undergo active osteogenic process to become osteoblast-like cells and release heterogeneous populations of Extracellular Vesicles (EVs). EVs act as nucleating foci for crystallization through their interaction with type 1 collagen (Col1) via integrins and their procalcifying protein content strongly supports calcification progression. Because these two mechanisms are crucial for the development of VC, they eventually represent two therapeutic targets for VC regression. Our primary objective was to identify new natural or chemically synthesized molecules that can inhibit VC. We demonstrated the ability of a specific oligogalacturonic acid (DP8), extracted from flax seeds, to inhibit in vitro and ex-vivo Pi-induced calcification by diminishing osteogenic markers expression, masking a consensus amino acid repeat found in Col1 (sequence: GFOGER), and thus preventing EVs from binding. Also we chemically synthesized a GFOGER peptide and checked its ability to inhibit calcification. Similar to DP8, GFOGER peptide was able to inhibit in vitro and ex-vivo Pi-induced calcification by downregulating osteogenic markers expression and through modifying the protein content of VSMCs derived EVs. Therefore, our work suggests two novel therapeutic approaches for the prevention of VC

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Cherbonneau, Francois. "Development of new engineering methodologies for cell sequencing landscape : unbiased mRNA sampling of living cells by TRanscriptomic Analysis Captured in Extracellular vesicles (TRACE)." Thesis, Université de Paris (2019-....), 2021. https://wo.app.u-paris.fr/cgi-bin/WebObjects/TheseWeb.woa/wa/show?t=4387&f=28882.

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Abstract:

L’Hétérogénéité cellulaire et les expressions génétiques fluctuantes dans un microenvironnement spécifique restent mal comprises. Ainsi, afin d’apporter un début de réponse à toutes ces questions, beaucoup de paradigmes scientifiques ont été développés, permettant de toujours repousser plus loin les limites du possible. Ainsi, l'objectif de ce premier projet de thèse fut de développer une méthode innovante pour l'analyse épigénétique multiplexée de cellules à une résolution cellulaire unique. En reliant la protéine transposon Tn5 à des anticorps ciblant des facteurs épigénétiques clés, il pourrait être possible d'identifier le site de liaison de facteurs de transcription spécifiques à l'échelle du génome. Néanmoins, en raison de la relative concurrence dans le développement d’une nouvelle technologie dans ce domaine, cet outil très prometteur fut breveté par une autre entreprise et ce projet de thèse a donc été interrompu au profit d’un autre projet dans cette même thématique. Ainsi, beaucoup de progrès importants en biologie sont fortement corrélés avec de nouvelles méthodologies toujours plus innovantes et qui permettent de définir le destin cellulaire au niveau moléculaire. Mais une grande majorité d'entre elles nécessite l'utilisation de procédures destructrices. Pour ces raisons, nous avons développé une nouvelle technologie permettant une analyse transcriptomique dans le temps sans aucune destruction cellulaire. Nommée TRACE pour l'analyse «TRanslatomique» par capture dans des vésicules extracellulaires, elle est caractérisée par l’expression d’un transgène fournissant une translation d'une partie représentative du transcriptome cellulaire à l'intérieur des vésicules extracellulaires. Ainsi, ce «translatome» des cellules qui expriment TRACE peut être suivi dans le temps de manière non destructrice in vitro et in vivo, ce qui est un outil puissant pour de nombreux domaines de recherches fondamentale et translationnelle Cell heterogeneity and fluctuant genetic expression in specific microenvironments remain poorly understood. Thus, to address a beginning of answer to all of these general questions, a lot of new scientific paradigms were developed and enable to push the limits of the possible. Thus, the goal of this first thesis project was to develop a highly innovative method for multiplexed epigenetic analysis of cells at a single cell resolution. By linking the Tn5 transposon protein with antibodies targeting key epigenetic factors, it could be possible to identify the binding site of specific transcription factors at a genome wide level. Nevertheless, due to the relative competition to develop a new technology in the field, this very promising tool has been patented by another company, thus the decision was taken to abort this project and focus on another one. A lot of progress and discovery in Biology is strongly correlated with new methodologies that provide the ability to define cell fate at molecular level, but a large majority of them require the use of destructive procedures. For these reasons, the second research project was to develop a new technology allowing transcriptomic analysis over time without any cell destruction. Named TRACE for “TRanslatomic” Analysis Captured in Extracellular vesicles, it is characterized by a cell-type specific transgene expression providing a translation of a representative part of the cell transcriptome inside Extracellular vesicles. Thus, “Translatome” of cells which express TRACE can be followed over time by non-destructive manner in vitro as well as in vivo, which is a powerful tool for many fields of fundamental and translational research

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Wan, Bin. "Interactions Drosophiles-guêpes endoparasitoïdes : rôle des vésicules extracellulaires du venin de Leptopilina boulardi dans le transport de facteurs de virulence et la spécificité d’hôte." Thesis, Université Côte d'Azur (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017AZUR4143/document.

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Abstract:

Le développement larvaire de Leptopilina boulardi (guêpe endoparasitoïde) a lieu dans la larve de Drosophile hôte, principalement D. melanogaster. La réponse immunitaire de l’hôte est l’encapsulement, formation d’une capsule mélanisée formée de couches d’hémocytes spécialisés, les lamellocytes, autour de l’œuf du parasitoïde. Le succès de L. boulardi repose sur l’injection de venin qui bloque l’action des lamellocytes. Ce venin, contient des composants protéiques et des vésicules originales baptisées vénosomes. J’ai montré que deux facteurs de virulence (VFs), LbGAP et LbGAP2, s’intègrent aux vénosomes lors de leur assemblage qui semble se faire de façon extracellulaire dans le canal reliant la glande à venin au réservoir. La microinjection de vénosomes purifiés comme celle du venin inhibe l’encapsulement. Les vénosomes marqués par fluorescence et les VFs co-immunolocalisent dans les lamellocytes de l’hôte après injection, leur internalisation passe par une endocytose flotilline/raft-domaine dépendante. Le taux d’internalisation diffère fortement entre les espèces hôtes de Drosophile testées (D. melanogaster>D. simulans>D. yakuba>D. suzukii) et il est corrélé au taux de réussite parasitaire, suggérant l’existence d’un récepteur spécifique sur les lamellocytes de D. melanogaster. Grâce à la souche mutante HopTum-l qui produit des lamellocytes constitutivement, j’ai séparé ces cellules et entrepris l’analyse protéomique de leur membrane pour identifier des récepteurs candidats. Mes résultats démontrent que les vénosomes sont des véhicules de transport interespèces impliqués dans la virulence parasitaire et qu’ils représentent un nouveau niveau de spécificité d’hôte Endoparasitoid wasps, such as Leptopilina boulardi (Figitidae), develop inside Drosophila host larvae, mainly D. melanogaster. Egg oviposition normally results in a capsule formation by specialized haemocytes, the lamellocytes, associated with a melanization reaction. The parasitic success of L. boulardi relies on injection with the egg of venom that blocks the action of lamellocytes. This venom, synthesized at the level of a specialized gland and stored in a reservoir, contains protein components and original vesicles (venosomes). I have shown that two described virulence factors, LbGAP and LbGAP2 (VFs), are embedded in venosomes during their assembly which seems to occur extracellularly in the duct connecting the venom gland to the reservoir. Microinjection of purified venosomes protects the egg from encapsulation like venom injection. Fluorescently labelled venosomes and VFs co-immunolocalize in lamellocytes after injection and their internalization involves a flotillin/raft-domain-dependent endocytosis. The venosomes internalization rate differs significantly between the Drosophila host species tested (D. melanogaster>D. simulans>D. yakuba>D. suzukii) and is correlated with the parasite success rate, suggesting the existence of specific receptor on lamellocytes of D. melanogaster. Using the HopTum-1 mutant that constitutively produces lamellocytes, I have purified these cells and performed proteomic analysis of their membrane to identify candidate receptors. My results demonstrate that venosomes are interspecies transport vehicles involved in parasite virulence that represent a new level of host specificity

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Arab, Tanina. "Caractérisation des vésicules extracellulaires (VEs) d’origine microgliale et mise en évidence de leur effet neurotrophique." Thesis, Lille 1, 2019. http://www.theses.fr/2019LIL1S100/document.

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Abstract:

Les cellules microgliales sont considérées comme les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC). De nombreuses études ont démontré que ces cellules sont activées et recrutées sur le site de lésion. Les cellules microgliales de sangsue présentent un mode d’activation et de migration similaires post lésion expérimentale du SNC. Cette activation est accompagnée d'une libération massive de vésicules extracellulaires (VEs).Les VEs sont de petites particules produites par la plupart des types cellulaires et sont présentes dans plusieurs liquides biologiques, notamment la salive, l'urine, le lait maternel, le plasma et le liquide céphalo-rachidien ... Leur taille varie entre 30 nm et 1 µm de diamètre. Selon leur origine cellulaire, deux populations principales ont été décrites. Les exosomes qui sont connus comme des vésicules d'origine endosomales et les microvésicules qui sont générées suite au bourgeonnement de la membrane plasmique.Les travaux portent sur l'isolation de VEs libérées par des cellules microgliales en culture primaire. Chez la sangsue, ces dernières sont séparées des populations de neurones suite à la dissociation du SNC. Après quatre jours de culture, les VEs des cellules microgliales ont été isolées du milieu et leur contenu protéique a été analysé par spectrométrie de masse.D'autre part, les VEs isolées ont été également testées in vitro pour leur potentiel à induire une croissance neuritique à la fois sur les neurones de sangsue et des lignées cellulaires de neuroblastome de mammifères In Mammals, microglial cells are considered as the resident immune cells in central nervous system (CNS). Many studies demonstrated that, after injury, these cells are activated and recruited at the lesion site. Leech microglia presents a similar pattern of microglial activation and migration upon experimental lesion of its CNS. This activation is associated with the release of a large amount of Extracellular Vesicles (EVs). EVs are small particles produced by numerous cell types and found in several biological fluids including saliva, urine, breast milk, plasma and cerebrospinal fluid ... Their size fluctuates between 30 nm and 1 µm in diameter. Depending on their cell origin, two EVs populations are reported: exosomes are described to be endosomales vesicles, while microvesicles are generated after plasma membrane shedding. The main goal of this work was to isolate microglia EVs released in primery culture. For this purpose, microglial cells were separated from neurons after leech CNS dissociation. After four days, EVs were isolated from conditionned medium and their protein content was investigated by mass spectrometry analyses. In the other hand, EVs were assessed for their potential to induce neuritite outgrowth on both leech neurons and mammal neuroblastoma cell lines

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Vitry, Julien Pierre. "Caractérisation des vésicules extracellulaires plasmatiques dans une cohorte de patients infectés par le VIH-1." Master's thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27573.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle de communication intercellulaire pouvant réguler le système immunitaire. Les VE sont composées de différentes populations que l'on retrouve dans tous les fluides biologiques et constituent des biomarqueurs ainsi que des outils thérapeutiques dans diverses pathologies comme les cancers. Une étude dans notre laboratoire a révélé le potentiel de biomarqueur des vésicules extracellulaires plasmatiques (VEsp) chez des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1). Cette étude a montré un enrichissement des VE acétylcholinestérase positive (AChE+) et des marqueurs protéiques de la population des exosomes chez les patients infectés. Nous avons proposé comme hypothèse que la population de VEsp AChE+ serait des exosomes et que cette population constituerait un meilleur biomarqueur de l'infection par le VIH-1 que l'ensemble des VE. Les VEsp AChE+ d'une nouvelle cohorte de patients ont été caractérisées. Dans un premier temps, la purification des VEsp AChE+ a été optimisée afin de séparer les grosses vésicules des petites. Dans un deuxième temps nous avons validé que la population de VEsp AChE+ est une population homogène et spécifique dont le potentiel de biomarqueur de l'infection a été validé. Pour terminer la caractérisation de cette population, elle a été séparée dans un gradient de vélocité à l'iodixanol afin de valider que cette population de vésicules était des exosomes. Ce projet a permis de valider que la population d'exosomes AChE+ purifiées et caractérisées dans une cohorte de patients atteints du VIH-1+, représente un biomarqueur de l'évolution de l'infection par le VIH-1.

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Soula, Anaïs. "Rôle des microARNs cellulaires et vésiculaires dans la régulation transcriptomique du système nerveux." Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0794/document.

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Abstract:

Ce travail consiste à étudier l’expression, le rôle et l’échange des microARNs (miARNs), dans le système nerveux (SN). Les microARNs (miARNs) sont des petits ARNs endogènes non-codants qui exercent une régulation négative sur l’expression desgènes, en s’hybridant sur la région 3’ non-codante des ARNm cibles.Dans un premier, nous avons dévoilé le rôle spécifique du miR-92a, dans lecontrôle de l’expression de la sous-unité GluA1 des récepteurs AMPA, dans un paradigme de plasticité synaptique homéostatique, dans lequel la plasticité synaptique est inhibée.Nous avons ensuite montré, par RNA-Seq que les miARNs sont différentiellement exprimés entre les structures du SN. Cette technologie nous a aussi permis de révéler la présence de nouvelles espèces de miARNs. De plus les résultats suggèrent que l’expression des miARNs (connus et nouveaux) participe à la signature transcriptomique singulière de chacune des structures.Dans un troisième temps, notre travail montre que les miARNs peuvent être échangés entre les cellules du système nerveux via les vésicules extracellulaires (EVs). Le contenu des EVs en miARNs varie en fonction de l’activité neuronale, et ces derniers ont pour cibles prédictives des protéines impliquées dans la régulation de la plasticité neuronale. Nos résultats suggèrent donc que l’échange de miARNs via les EVs est un nouveau mécanisme de modulation de la plasticité neuronale.Enfin, nous proposons un nouvel outil de purification des EVs, qui à l’avenir permettrait de purifier les EVs du SNC selon leur origine cellulaire.Pour conclure, ce travail apporte une meilleure compréhension du rôle des miARNs dans la régulation de la physiologie du SNC This work consists in stuying the expression, the role and the transport of microRNAs (miRNAs) in the central nervous system (CNS). microRNAs (miRNAs) are small endogenous non coding RNAs, exerting a negative regulation on gene expression.They inhibit protein translation by hybridization on the 3’ untranslated region of mRNA.First, we have revealed the specific role of miR-92a in the control of the expressionof GluA1, in an homeostatic plasticity paradigm in which the synaptic plasticity is inhibited.Second, by using RNA-Seq technology, we showed that miRNAs are differentially expressed in the different structures of the CNS. Moreover, we have discovered new species of miRNAs. Finally, our results suggest that the miRNA expression (of known and new miRNAs) participate in the singular transcriptomique signature of each structure.Third, we have shown that miRNAs are transported into EVs, and can be exchanged between the cells of the CNS. The miRNA content of EVs varies depending on neuronal activity. Target prediction of these miRNAs includes genes involved in the regulation of neuronal plasticity. Together, our results suggest that the exchange of miRNAs through EVs is a new mechanism involved in the modulation of neuronal plasticity. Finally, we propose a new tool for purifiying EVs depending on their cellular origin.To conclude, this study allows a better understanding of the role of miRNAs in the regulation of the physiology of the CNS

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Colasante, M. Cesare O. "Etude de la fusion exocytotique et du recyclage des vésicules synaptiques à la jonction neuromusculaire : analyse immunocytochimique." Paris 6, 1996. http://www.theses.fr/1996PA066088.

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Rannou, Alice. "Cellules souches adultes MuStem humaines : potentiel thérapeutique dans un contexte d’infarctus du myocarde et vésicules extracellulaires." Thesis, Nantes, 2019. http://www.theses.fr/2019NANT1026.

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Abstract:

L'insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique dans les pays industrialisés. Sur un plan médical, sa prise en charge reste imparfaite et ne permet qu’un ralentissement de l'évolution de la maladie. Sur la base des résultats précliniques et des enseignements tirés des premiers essais cliniques chez l’Homme, l’approche de thérapie cellulaire représente une proposition thérapeutique prometteuse. Cependant une faible viabilité et une absence de prise de greffe à moyen-long terme des différents candidats cellulaires ont été observées, limitant fortement les bénéfices structurels et fonctionnels sur le coeur infarci. Nous avons successivement décrit chez le Chien puis chez l'Homme une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique - nommées MuStem - qui présente une capacité à promouvoir la réparation des muscles squelettiques après leur administration en contexte lésionnel. Une amélioration du taux de survie, de la greffe à long terme et de la participation à la formation de fibres musculaires ont été mis en évidence comparativement aux myoblastes, premiers candidats testés en médecine réparatrice. Un remodelage tissulaire important et persistant ainsi que des bénéfices cliniques ont été décrits chez le chien dystrophique positionnant la population MuStem comme candidat thérapeutique prometteur pour les troubles musculo-squelettiques. Cependant, son potentiel thérapeutique pour les pathologies cardiaques reste inconnu, limitant la définition de son champ d'application. L'objectif général de mon projet a été de définir si les cellules souches hMuStem peuvent s’implanter dans le tissu cardiaque en contexte pathologique, interagir avec les cellules du tissu cardiaque et impacter positivement sur la fonction. Pour cela, un protocole d’induction d’infarctus a été réalisé sur un modèle de rat immunodéficient suivi d’un protocole de xénotransplantation une semaine après. Une exploration fonctionnelle (ECG /échocardiographique), moléculaire et histologique a été mise en place. Histologiquement, une réduction de la fibrose myocardique et une augmentation de l'angiogenèse ont été observées troissemaines après la transplantation. Elle est associée à la formation de fibres musculaires squelettiques et cardiaques au niveau du tissu infarci. Une grande proportion des cellules greffées a adopté une position de cellule de réserve dans la matrice conjonctive. Sur un plan fonctionnel, une atténuation de la dilatation ventriculaire gauche et une préservation considérable de la fonction contractile ont été mises en évidence. Collectivement, les résultats suggèrent que latransplantation intramyocardique de cellules hMuStem pourrait représenter une stratégie appropriée pour le traitement de l'infarctus du myocarde Myocardial infarction represents one of the leading causes of mortality and morbidity worldwide. From a medical point of view, its management remains imperfect and only allows a slowing down of the disease's course. Based on preclinical results and lessons learned from the first human clinical trials, the cell therapy approach represents a promising therapeutic proposal. However, weak viability and short-term engraftment were recorded when corresponding human cells were evaluated in clinical trials, highly limiting the structural and functional benefits of their administration in infarcted heart.We have successively described in the Dog then in the Man a type of skeletal muscle-derived stem cells – we named themMuStem cells – which exhibited an interesting ability to promote repair of muscle fibers following delivery into injured context. Enhanced survival rate, long-term engraftment and participation in muscle fiber formation were reported compared to myoblasts, the first candidates tested in regenerative medicine. This led to striking and persistent tissue remodeling as well as clinical benefits, positioning them as promising therapeutic candidate for skeletal muscle disorders. However, their ability to repair infarcted heart remained unknown, restricting their scope of application The general objective of my project was to define if hMuStem cells can be implanted in cardiac tissue in a pathological context, interact with cardiac tissue cells and positively impact on function. To do this, an infarction induction protocol was performed on an immunodeficient rat model followed by a xenotransplantation protocol one week later. A functional (electrocardiographic/echocardiographic), molecular and histological exploration was carried out. Histologically, a reduced myocardial fibrosis and an increased angiogenesis were observed three weeks post-transplantation. It was associated with skeletal and cardiac muscle fiberformation in the infarct site. A large proportion of engrafted cells adopted a reserve cell position in the conjunctive matrix.On a functional level, an attenuation of the left ventricle dilatation and a significant preservation of the contractile function have been highlighted. Overall, our results suggest that intramyocardial transplantation of hMuStem cells could represent a suitable strategy for the treatment of myocardial infarction

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Treps, Lucas. "Implication des vésicules extracellulaires des cellules initiatrices tumorales dans l’augmentation de la perméabilité vasculaire du glioblastome." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2015. http://www.theses.fr/2015PA05T018/document.

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Abstract:

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes

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Pluchart, Claire. "Etude des vésicules extracellulaires procoagulantes au cours du traitement d'induction des leucémies aigues lymphoblastiques de l'enfant. Vincristine induces procoagulant activity of the human lymphoblastic leukemia cell line Jurkat through the release of extracellular vesicles." Thesis, Reims, 2020. http://www.theses.fr/2020REIMM207.

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Abstract:

La leucémie aigue lymphoblastique (LAL) est le cancer le plus fréquent de l’enfant, représentant 25% des cancers pédiatriques. Les complications thromboemboliques veineuses sont des complications sévères et fréquentes, estimées à 6,1% dans une étude prospective récente. La pathogénie de cette complication n’est toujours pas complètement élucidée. Elle pourrait impliquer l’interaction des cellules circulantes et des vésicules extracellulaires (VEC) avec les chimiothérapies. Nous avons tout d’abord démontré via un modèle in vitro l’activité procoagulante des blastes lymphoïdes et des VEC blastiques, dépendante des phosphatidylsérines. Nous avons également observé dans cette même étude l’effet procoagulant inattendu de la vincristine. Nous avons ensuite réalisé une étude clinique portant sur l’analyse des VEC plasmatiques pendant le traitement d’induction. Nous avons observé que les VEC, majoritairement d’origine plasmatique augmentaient en nombre tout au long de l’induction. Elles présentent une activité procoagulante. Il existe une association significative entre leur nombre/ activité prooagulante et les taux de plaquettes et de leucocytes. Ces résultats sont en faveur d’une activation plaquettaire durant le traitement d’induction à l’origine de la production de VEC. De ce fait dans un troisième article nous avons étudié sur les mêmes patients l’évolution du taux plasmatique de P-sélectine, marqueur d’activation plaquettaire. Le taux de P-sélectine augmente pendant l’induction et le taux est corrélé au nombre des VEC et au taux de leucocytes et de plaquettes. De ce fait la P-sélectine apparait comme un potentiel biomarqueur de la thrombose dans les LAL de l’enfant Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is the most common childhood malignancy, representing 25% of all paediatric malignancies. Venous thromboembolism (VTE) is a common and severe complication of ALL treatment. The reported incidence rate of VTE in children is 6.1% in a recent prospective study. Pathogenesis of this complication is still not fully understood but may involve interactions between circulating cells and extracellular vesicles (EV) and chemotherapy. We first demonstrated in an in-vitro model that lymphoid blasts and derived EV could have a procoagulant activity through phospholipid exposure. Another result of this study was to show an unexpected procoagulant effect of Vincristine (VCR) on lymphoid blasts and EV. We next conducted a prospective clinical study on ALL in paediatric patients aiming at evaluating EV during induction treatment. We observed that EV were mainly from platelet origin. Their number increased during induction treatment. They showed a procoagulant activity. EV number and procoagulant activity were associated with leucocyte and platelet number. These results suggest a platelet activation during the induction treatment of ALL, leading to platelet EV generation. We next studied the level of P-selectin in the same group of patients. We observed that P-selectin level increased during the induction course and that its level was associated with EV, leucocyte and platelet number. P-selectin may be a potential biomarker in thrombosis in paediatric ALL

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Crompot, Emerence. "Caractérisation phénotypique et impact fonctionnel des vésicules extracellulaires issues de cellules stromales mésenchymateuses sur les lymphocytes B de Leucémie Lymphoïde Chronique." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2017. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/245872.

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Abstract:

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) est la leucémie la plus fréquente des pays occidentaux. Cette maladie est caractérisée par l’accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux (CD5+/CD19+/CD23+) dans le sang, la moelle et les organes lymphoïdes secondaires. Malgré d’importants progrès durant cette dernière décennie, la LLC reste incurable avec les traitements classiques. De manière intéressante, son évolution clinique est hétérogène :certains patients ne présenteront aucun symptôme alors que d’autres évolueront rapidement nécessitant une intervention thérapeutique. De nombreuses interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement (ME) médullaire, composé entre autres de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sécrétant une matrice extracellulaire, jouent un rôle important dans la survie cellulaire et la résistance à la chimiothérapie. Actuellement la nature des communications entre le clone leucémique et son ME n’est pas encore complétement élucidée. Notre objectif est d’étudier l’impact des vésicules extracellulaires (VEs abréviées ici EVs) (microparticules et exosomes) du ME, spécifiquement des CSM, sur les LB de LLC. Dans la 1ère partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des microparticules (MPs) par cytométrie en flux (CMF). Cette technique est un des meilleurs moyens de déterminer le phénotype des MPs, elle permet d’étudier les vésicules de 300 nm à 1 µm, excluant donc les exosomes, dont la taille est inférieure à 100 nm. Nous avons ainsi pu caractériser les MPs provenant de plaquettes et d’érythrocytes grâce à la présence respective des antigènes CD41/61 et du CD235a. Par contre, concernant les antigènes classiques des cellules mononucléées (CD3-14-19-20-56), aucun antigène n’a pu être détecté sur les MPs provenant des lymphocytes T (LT), des monocytes, des LB normaux et leucémiques et des cellules ‘’natural killer’’ (NK). Le signal positif obtenu dans certains cas était la conséquence d’un marquage aspécifique. Nous avons dès lors proposé un contrôle négatif supplémentaire qui ne se limite pas à l’utilisation d’isotypes mais qui se base sur des marquages croisés. Grâce à ce travail, nous avons démontré que les MPs dérivant de cellules positives pour un antigène donné n’étaient pas automatiquement positives pour ce dernier. Dans la seconde partie du travail, nous avons étudié les MPs et les exosomes provenant du ME médullaire, regroupés sous le terme EVs. Nous avons démontré que leur intégration dans les LB de LLC est très rapide et qu’elle permet une diminution de l’apoptose ainsi qu’une augmentation de la viabilité et de la migration des cellules leucémiques. Les EVs augmentent leur chimiorésistance vis-à-vis de différents agents leucémiques. A l’aide de la technologie Affymetrix, nous avons comparé les profils d’expression génique des LB leucémiques, ayant reçu ou non des EVs du ME. Ces analyses ont mis en évidence 805 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Une grande partie de la signature obtenue suite à l’intégration des EVs, partage de nombreuses similitudes avec des signatures de LB de LLC ayant eu un contact avec des cellules nourricières ou ayant reçu différents stimuli. Le point commun parmi ces différentes signatures est l’activation de la voie du ‘’B-cell receptor’’ (BCR) ;les EVs de CSM semblent en effet avoir la capacité d’induire dans les LB de LLC une réponse semblable à celle d’une activation BCR. Dans cette étude, nous avons démontré que le ME médullaire, en plus d’interagir par contact direct avec les LB de LLC et par la production de facteurs solubles, est également capable d’influencer le comportement des cellules leucémiques via la production d’EVs. Nos données suggèrent un rôle important des EVs dans la survie cellulaire et l’évolution de la LLC et ouvrent donc la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques. Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Obeid, Sameh. "Analyse quantitative et qualitative sur puce de vésicules extracellulaires en milieux complexes au sein d'une plateforme nanobioanalytique." Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2017. http://www.theses.fr/2017UBFCD009/document.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanovésicules circulantes (30 à 100nm de diamètre) libérées dans l'espace extracellulaire par la plupart des cellules humaines, suite à leur activation ou à leur apoptose. Les VEs se divisent en 3 grandes catégories ; les exosomes (Exo), les microparticules (MPs) et les corps apoptotiques (cAPO). Les VEs sont présentes à l'état physiologique dans les différents fluides biologiques du corps humain et jouent un rôle majeur dans différents processus physio-pathologiques. De nos jours, plusieurs techniques, certaines en routine, sont utilisées pour étudier les VEs. Cependant, aucune d'entre elles ne permet de déterminer à la fois leur concentration, leur taille et leurs caractéristiques biochimiques. Un consensus existe sur la nécessité de combiner des techniques pour disposer enfin d'une caractérisation fine et complète des VEs. Il est d'un intérêt majeur de développer des plateformes analytiques dédiées à ces VEs en vue d'améliorer la qualification des échantillons biologiques et de découvrir de nouveaux biomarqueurs de pathologies humaines ou de bio-indicateurs de suivi thérapeutique.Notre projet consiste à développer une plateforme NanoBioAnalytique (NBA) combinant trois techniques : l'imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRi), la Microscopie à Force Atomique (AFM) et la Spectrométrie de Masse (MS). L'enjeu est de développer une interface biopuce-instruments qui permettra d'effectuer des investigations multiphysiques et multiéchelles apportant, en une stratégie globale, les informations plus complètes sur les différentes populations de VEs.[...]Ces travaux ont montré la capacité de notre plateforme à détecter sélectivement, et simultanément, différentes sous-populations des VEs co-existantes dans un échantillon complexe tel que du plasma, en s'appuyant sur l'expression différentielle des marqueurs protéiques membranaires. Les taux de capture se sont avérés être directement corrélés à la concentration des vésicules dans l'échantillon injecté. L'analyse AFM a permis de déterminer la distribution en taille de différentes sous-populations de VEs et permettre une analyse différentielle de la distribution en taille sur la gamme 20 nm - 1000 nm. Enfin, des études protéomiques "sur-puce" ont été également engagées afin de caractériser la composition en protéines des VEs libérées sous différentes conditions. Cette analyse a permis d'établir des premiers profils protéomiques différentiels des VEs dans les échantillons étudiés.La plateforme NBA est une méthode efficace pour caractériser et quantifier les VEs, sans marquage et avec une grande sensibilité, sur une large gamme dynamique (environ 10(7) à 10(12) particules/mL) cohérente avec celle existante en fluide physiologique et sur une plage de taille couvrant 2 décades. Elle s'inscrit parmi les approches les plus prometteuses pour l'investigation des VEs en complément de la cytométrie en flux. La grande adaptabilité de cette méthode d'analyse des VEs ouvre de larges perspectives de déploiement dans les secteurs de la Santé, de l'Environnement et de l'Agro-alimentaire Extracellular vesicles (EVs) are small vesicles (30 to 1000 nm) released from different cell types, upon activation or apoptosis, and present in most body fluids (Blood, Urine….). Based on the current state of knowledge of their biogenesis and biochemical properties, EVs can be devided into three distinct populations: exosomes (EXO), microparticles (MPs) and apoptotic bodies (APOb). EVs have been found to play important biological roles and are also biomarkers of different pathologies. […] The first step consists of the injection of the samples containing EVs onto the biochip surface. This step is accomplished by SPR technique that allows label-free monitoring of EVs immunocapture onto the surface of a biochip presenting different specific bioreceptors. Following the capture of EVs, a nanometrological investigation of the biochip surface by AFM is engaged to characterize the physical properties of captured vesicles (size, morphology, etc..). Owning a nanometrical resolution, AFM can discriminate between individual EVs and vesicles or protein aggregates, leading to an accurate characterization of individual vesicles. The coupling of SPR technique with AFM was adapted to offer a representative global view of each array of bioreceptors and to measure the size of thousands of individual EVs. A proteomic investigation was also engaged to characterize the proteomic compositions of the different subpopulations of EVs. Such an investigation could contribute to the understanding of EVs biogenesis, biology and pathophysiology. To evaluate the potential of our platform to detect, quantify and characterize nanoparticles, two calibration particles, which cover the lower and upper size range of EVs, were chosen: (i) virus-like particles of 50 nm of diameter, also called CP50, and (ii) protein-functionnalized synthetic beads of 920 nm of diameter, called CP920. The capture tests in SPR showed a specific capture of these two calibration particles with their specific bioreceptors, immobilized onto the biochip surface, regardless the complexity of the media in which they were diluted. Also, a positive correlation was obtained between the capture level, measured by SPR, and the particle 9

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Benmoussa, Abderrahim. "Diversité des vésicules extracellulaires dans le lait bovin et leurs activités dans les maladies inflammatoires de l'intestin." Doctoral thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/36556.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des « fragments » de cellules activement libérés dans tous les fluides biologiques. Elles transitent dans la circulation corporelle et transmettent leur contenu bioactif à d’autres cellules. Le lait est le fluide qui contient le plus de VE et celles-ci encapsulent plusieurs éléments bioactifs qui ont des effets anticancéreux, anti-inflammatoire et diminuent notamment les symptômes de la polyarthrite rhumatoïde in vivo. Durant ma thèse j’ai exploré la diversité des VE présentes dans le lait bovin commercial et j’ai étudié leurs activités biologiques dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Les résultats que j’ai obtenus démontrent l’existence de plusieurs populations de VE dans le lait bovin commercial que j’ai pu discriminer grâce à l’utilisation du citrate de sodium pour leur isolation. J’ai découvert qu’elles étaient capables de survivre lors de la digestion in vitro durant laquelle elles protègent leur contenu bioactif, notamment des microARN. Après avoir décrit en détail les différents microARN et protéines encapsulées dans ces VE, j’ai pu trouver des marqueurs spécifiques pour certains sous-ensembles de VE du lait. J’ai aussi montré le transfert de miR-223 bovin à des cellules humaines in vitro et son activité biologique sur l’expression d’un gène rapporteur. J’ai alors exploré l’activité biologique des VE du lait dans un modèle murin de colite induite par le Dextran sulfate sodium (DSS). La prise orale de VE du lait a diminué les symptômes de la maladie, restauré en partie le microbiote intestinal et rétabli la barrière digestive et les niveaux de mucines. J’ai aussi découvert que différentes populations de VE du lait ont différents effets sur l’inflammation du côlon, notamment en modulant le niveau de certains microARN impliqués dans le développement des MICI. Le lait contient donc différentes VE avec des activités biologiques différentes capables de moduler l’inflammation et le développement de pathologies digestives. L’étude des mécanismes qui sous-tendent leur bioactivité pourrait impacter la prise en charge des maladies inflammatoires, permettrait une amélioration des formulations de lait pour les nouveau-nés et serait d’importance pour la santé publique et le traitement industriel du lait commercial. Extracellular vesicles (EVs) are cellular “fragments” actively released in all biological fluids. They are transported through body circulation and transmit their bioactive content to remote recipient cells. Milk is the biological fluid most enriched in EVs and these encapsulate several bioactive elements with anti-cancer and anti-inflammatory effects and reduce the symptoms of rheumatoid arthritis in vivo. During my thesis, I explored the diversity of EVs present in commercial bovine milk and studied their biological activities in the context of inflammatory bowel diseases (IBD). The results I obtained demonstrate the existence of several EV subsets in commercial bovine milk that I could discriminate using sodium citrate for their isolation. I found these EVs can survive during in-vitro digestion and protect their bioactive content, including microRNAs. After detailing the different microRNAs and proteins encapsulated in these EVs, I found specific markers for certain populations of milk EVs. I also reported the transfer of vesicular bovine miR-223 to human cells in vitro and its biological activity on the expression of a reporter gene. I then explored the biological activities of milk EVs in a mouse model of DSS-induced colitis. The oral intake of milk EVs decreased the symptoms of the disease, restored part of the intestinal microbiota, restored the intestinal barrier and replenished mucin levels. Also, different populations of milk EVs differentially modulated inflammation in the colon, notably by regulating the level of certain IBD-associated microRNAs. Milk therefore contains different EV subsets with different biological activities capable of modulating inflammation and the development of digestive pathologies. Studying the mechanisms underlying their bioactivity could impact the management of inflammatory diseases, improve milk formulations for newborns, and be of importance to public health and industrial milk processing.

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Cosenza, Stella. "Vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules souches mésenchymateuses : caractérisation, fonction et rôle dans les maladies ostéo-articulaires." Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT014/document.

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Abstract:

L’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde sont deux atteintes ostéo-articulaires qui affectent les tissus cartilagineux et osseux. Elles représentent un réel problème de santé publique de par leur prévalence et le manque de traitements curatifs. Des approches innovantes de thérapie cellulaire sont en cours d’évaluation dans ces maladies. Elles sont basées sur l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM), qui possèdent des propriétés immunosuppressives et régénératrices, et pourraient apporter de nouveaux espoirs aux patients. Ces cellules sécrètent des vésicules extracellulaires, moyen de communication intercellulaire puissant, qui sont classées en 3 populations : exosomes, microparticules (MPs) et corps apoptotiques. Dans cette étude, nous proposons d’étudier et de comparer les effets in vitro et in vivo des exosomes et des MPs sécrétés par les CSMs. Nous montrons pour la première fois que les exosomes et les MPs de CSMs exercent in vitro des effets anti-inflammatoires, anti-apoptotiques et chondroprotecteurs similaires. In vivo, seuls les exosomes exercent un effet thérapeutique dans un modèle expérimental de polyarthrite rhumatoïde. En revanche dans un modèle expérimental d’arthrose, les exosomes et les MPs protègent le cartilage et l’os de la dégradation et ce, de manière équivalente. Cette étude est la première preuve de concept que des exosomes et/ou des MPs isolés de CSMs ont un effet thérapeutique dans des maladies rhumatismales Osteoarthritis and rheumatoid arthritis are osteoarticular diseases affecting primarily cartilage and bone. They are a high public health problem because of their prevalence and absence of curative treatment. Innovating cell therapy approaches are being evaluated in the clinic for treating these diseases. They rely on the use of mesenchymal stem cells (MSCs), which display immunosuppressive and regenerative functions and could provide new hope for patients. These cells release extracellular vesicles, which are very powerful tools for intercellular communication and are classified into 3 populations: exosomes, microparticles (MPs) and apoptotic bodies. In the present study, we characterize and compare the in vitro and in vivo effects of MSC-derived exosomes and MPs. We show for the first time that exosomes and MPs exert in vitro anti-inflammatory, anti-apoptotic and chondroprotective functions. In vivo, only exosomes exert a therapeutic effect in an experimental model of inflammatory arthritis. However in a model of osteoarthritis, both exosomes and MPs protect cartilage and bone from degradation, in a similar fashion. This study provides the proof-of-concept that MSC-derived exosomes and/or MPs exert a therapeutic effect in rheumatic diseases

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Le, goff Manon. "Etude des vésicules extracellulaires endothéliales et autres marqueurs de toxicité du Benzo[a]pyrène : influence d’extraits de microalgues d’origine marine." Thesis, Le Mans, 2020. http://www.theses.fr/2020LEMA1007.

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Abstract:

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), e.g. benzo[a]pyrène (B[a]P), sont des polluants environnementaux associés aux cancers et aux maladies cardiovasculaires. Les objectifs de cette thèse ont été: (1) d’'identifier des biomarqueurs d’'un risque de développement de ces maladies dues aux HAP et (2) de tester des produits naturels en prévention, sur les cellules endothéliales HMEC-1. Dans ce contexte, les vésicules extracellulaires (VE) : exosomes (EXO) et microvésicules (MV), accessibles dans les fluides biologiques, semblent être des biomarqueurs prometteurs non invasifs. La composition et la production des VE dépendent du type et de l’'état physiopathologique de la cellule. Nos résultats démontrent que certains HAP stimulent in vitro et in vivo la production de VE et modifient leur contenu. Nous avons montré que la surproduction d’'EXO dépend du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) contrairement aux MV. Nous avons étudié l’'influence de deux extraits de microalgues, O. tauri et P. tricornutum, riches en oméga-3 et en pigments sur la toxicité du B[a]P. Nous avons observé que l'extrait d’'O. tauri peut influencer la toxicité du B[a]P. En effet, l'apoptose et la production de VE ont diminué probablement par réduction de l'expression du CYP1A1, une enzyme de bioactivation du B[a]P. En outre, l'expression des cytokines inflammatoires induite par le B[a]P a été réduite. L'extrait de P. tricornutum n'a inhibé que l'expression de la cytokine IL-8 induite par le B[a]P. Ces travaux de thèse suggèrent une application potentielle des VE comme biomarqueurs de toxicité des HAP et la possible utilisation d’'O. tauri dans la prévention de pathologies médiées par les HAP Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), such as benzo[a]pyrene (B[a]P), are environmental pollutants associated with cancers and cardiovascular diseases. The aims of the present thesis have been : (1) to identify biomarkers of a risk of developing these pathologies due to PAHs, and (2) to test the preventing effects of natural products on HMEC-1 endothelial cells. In this context, extracellular vesicles (EV) : exosomes (EXO) and microvesicles (MV), accessible in biological fluids, seem to be promising non-invasive biomarkers. EV composition and production depend on the type and physiopathological state of the cell. Our results demonstrate that some PAHs stimulate in vitro and in vivo EV production and modify their content. We have further shown that the overproduction of EXO depends on the aromatic hydrocarbon receptor (AhR) unlike the MV. We have studied the influence of two extracts of microalgae, O. tauri and P. tricornutum, rich in omega-3 and pigments, on the toxicity of B[a]P. We have observed that O. tauri extract can influence the toxicity of B[a]P. Indeed, apoptosis and EV production were decreased likely through reduction of the expression of CYP1A1, a B[a]P bioactivation enzyme. In addition, the B[a]P-induced expression of the inflammatory cytokines IL-8 and IL1-β was reduced. The P. tricornutum extract only inhibited the expression of the B[a]P-induced cytokine IL-8 expression. Overall, this thesis suggests a potential application of EVs as biomarkers of PAH toxicity, and the possible use of O. tauri extract in the prevention of PAHs-mediated pathologies

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Ali, Sakina. "Rôle des vésicules extracellulaires dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline dans le syndrome métabolique LPS-enriched small extracellular vesicles from metabolic syndrome patients trigger endothelial dysfunction by activation of TLR4." Thesis, Angers, 2020. http://bu.univ-angers.fr/Contact.

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Abstract:

Le syndrome métabolique (SMet) est un ensemble de troubles métaboliques associés à une dysfonction endothéliale et à une résistance à l’insuline. Grâce à leur cargaison qu’ils peuvent transférer d’une cellule à l’autre, les vésicules extracellulaires (VEs), incluant les grandes (lEVs) et les petites (sEVs) vésicules sont impliquées dans différentes voies de communication intercellulaire. Parmi toutes les recherches menées sur les VEs, l’étude de leur implication dans la physiopathologie des maladies métaboliques a mis en évidence de nombreuses communications intercellulaires délétères pour le système vasculaire et pour la signalisation de l’insuline. Les objectifs de mon projet de thèse étaient de caractériser les sEVs circulants de patients SMet et non-SMet, d’évaluer leur effet métabolique sur la fonction endothéliale et enfin d’analyser l’effet des lEVs et des sEVs sur les cellules et tissus cibles de l’insuline. Premièrement, nous avons montré que la concentration circulante des sEVs étaient positivement corrélées avec les critères du SMet, notamment l’obésité viscérale, l’hypertension, la résistance à l’insuline et la dyslipidémie. Nous avons montré que les SMet-sEVs, enrichies en LPS, sont impliqués dans le développement d’une dysfonction endothéliale via l’activation de la voie de signalisation de TLR4. Deuxièmement, nous avons démontré que les deux sous-types de VEs peuvent induire une résistance à l’insuline dans les organes périphériques via des mécanismes moléculaires différents. Ces résultats ont permis de mettre en évidence les voies moléculaires par lesquelles les VEs participent aux altérations métaboliques associées à la dysfonction endothéliale et à la résistance à l’insuline pendant le MetS Metabolic syndrome (MetS),characterized by interconnecting metabolic disorders, is associated with endothelium dysfunction and insulin resistance. Thanks to their ability to transfer their cargo to recipient cells, extracellular vesicles (EVs), including large(lEVs) and small (sEVs) vesicles are involved indifferent intercellular communication pathways. Among the research conducted on EVs, the study of their involvement in the pathophysiology of metabolic diseases have highlighted numerous intercellular communication that are deleterious for the vascular system and for insulin pathways. My thesis project aims were to characterize circulating EVs from non-MetS and MetSpatients, to evaluate their metabolic effect on endothelial function, and to analyze lEVs andsEVs effects on insulin target cells and tissues. First, we shown that circulating concentration of sEVs were positively correlated with MetS criteriain cluding visceral obesity, hypertension, insulin resistance and dyslipidemia. We have shown that MetS sEVs, enriched with LPS, are involved in the development of endothelial dysfunction through the activation of the TLR4 signaling pathway. Second, we demonstrated that both subtype of EVs can induce insulin resistance in peripheral tissues via different molecular mechanisms.These results allow understanding the molecular pathways by which EVs participate in metabolic alterations associated with endothelial dysfunctions and insulin resistance during MetS

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Glemain, Alexandre. "Micro-aRNs des neutrophiles dans les vacularités associées aux ANCA." Thesis, Nantes, 2020. http://www.theses.fr/2020NANT4052.

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Abstract:

L’activation des polynucléaires neutrophiles par les ANCA (anticorps anti-cytoplasme de neutrophiles) est un élément clé de la pathogenèse des lésions endothéliales observées au cours des vascularites associées aux ANCA (VAA). Nous avons démontré que ces cellules pouvaient relarguer des vésicules extracellulaires (VE) capables de transférer à des cellules microvasculaires les miR-223, miR-142-3p et miR-451 suite à l’activation par des ANCA. Nous avons montré un impact délétère du transfert des miR-142-3p et miR-451 à travers des modèles in vitro de surexpression de ces micro-ARNs et de coincubation de VE et de cellules microvasculaires transfectées avec des inhibiteurs de ces micro-ARN. Cet impact se traduit par une induction de l’apoptose, de la sécrétion de chimiokines et de cytokines pro-inflammatoires, et par des modifications de la signalisation intracellulaires, et notamment l’inhibition de gènes pro-angiogéniques. Ces résultats ont été appuyés par une étude du profil d’expression de ces micro-ARN dans des biopsies de patients Activation of neutrophils by ANCA (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies) is a key feature of microvascular endothelial cell (EC) damage in ANCA-associated vasculitis (AAV). Here, we demonstrate that upon ANCA activation, neutrophils release extracellular vesicles (EVs) that are able to transfer of miR-223, miR-142-3p and miR-451 to microvascular EC. We have shown a deleterious impact of miR-142-3p and miR-451 in vitro, both in models of overexpression of these microRNAs and coincubation of EVs with EC transfected with specific inhibitors of these miRNA. This impact is characterized by increase of apoptosis, secretion of proinflammatory chemokines and cytokines, and inhibition of pro-angiogenic genes expression. These results were backed up by a study of the expression profile of these micro-RNAs in patients biopsies

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Drelich, Lauranne. "De l’hétérogénéité intra-tumorale à la recherche de vésicules extracellulaires au sein de biopsie liquide en vue d’une médecine personnalisée." Thesis, Lille 1, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL1S105.

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Abstract:

Les gliomes représentent 80% des tumeurs cérébrales malignes primitives et sont classés selon différents grades de malignité. Les glioblastomes, groupe le plus agressif, représentent plus de la moitié de tous les gliomes. Il s'agit de tumeurs dont la composition est hétérogène, présentant notamment de zones de nécrose, de prolifération vasculaire, de prolifération cellulaire. La survie des patients peut aller de quelques mois à quelques années après la chirurgie et la chimiothérapie. L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI est une technique intéressante pour l’étude de ces tumeurs, car elle permet de prendre en considération l'hétérogénéité intra-tumorale. Dans cette étude, l’imagerie MALDI MS est couplée à la microprotéomique localisée sur tissu dans l'objectif d'identifier des sous-groupes de glioblastomes afin d'aider au diagnostic et au pronostic. Les images moléculaires ont été générées à partir de coupes fines de tissus dans le but de déterminer la localisation de peptides digérés. Ensuite, des analyses statistiques non supervisées nous ont permis de générer un regroupement hiérarchique de régions moléculaires homogènes au sein du tissu. Une analyse restreinte à ces différentes régions à nous a donné accès à leur contenu protéique. Le regroupement hiérarchique a révélé trois régions moléculaires dans l’ensemble des échantillons. À partir de ces régions, 3 groupes de patients ont été identifiés : le groupe A (13/50 patients), le groupe B (9/50 patients) et le groupe C (23/50 patients) . Cinq patients sont restés non classables. Chaque groupe présentait des signatures moléculaires spécifiques. Les analyses microprotéomiques ont montré un panel de protéines spécifiquement surexprimées dans chaque groupe : les protéines surexprimées dans le groupe A sont associées à la neurogenèse ; celles du groupe B sont associées à une activation du système immunitaire et celles du groupe C sont impliquées dans des processus viraux. Enfin, nous avons identifié 6 nouveaux marqueurs pronostiques des glioblastomes qui pourraient aider à stratifier les patients et aider à la décision thérapeutique.En parallèle, nous nous sommes intéressés au développement d’une nouvelle technique de microprotéomique localisée basée sur l’expansion de tissu. Agrandir le tissu permet, tout en conservant les méthodes de protéomique conventionnelle, d’analyser des régions plus petites que celles atteignables actuellement. Jusqu’à 655 protéines ont pu être identifiées dans une région de 460 µm de diamètre, ce qui correspond à une moyenne de 940 cellules. De plus, cette stratégie est intéressante pour l'imagerie MS, car elle donne la possibilité de cartographier facilement un grand nombre de protéines sur la base de leur quantification avec une résolution spatiale inférieure à 350 µm. En ce sens, l’expansion de tissu est d’un grand intérêt pour augmenter la résolution spatiale de la protéomique localisée.Finalement, étudier les vésicules extracellulaires circulant dans le sang pourrait à terme permettre d'aider au dépistage, au diagnostic ainsi qu'au suivi des glioblastomes. L’analyse protéomique des vésicules du sang des patients pourrait permettre d’identifier des protéines ou des réseaux déjà identifiés dans les échantillons tumoraux. Les résultats préliminaires à partir de plasma témoin montrent qu’il est possible d’isoler des vésicules et de réaliser des analyses protéomiques. Ainsi, il serait intéressant de pouvoir associer un profil de vésicule extracellulaire pour chaque groupe de tumeurs. De plus, nous avons été capables d’isoler spécifiquement les vésicules contenues dans une coupe fine de cerveau de rat. Ces résultats sont encourageants et à terme il sera possible d’identifier les vésicules provenant de la tumeur Gliomas account for 80% of all malignant brain tumors and are classified within different maligniy grades. Glioblastomas, the most aggressive group, represent more than half of all gliomas but remain a heterogeneous group. Indeed, patient survival ranges from several months to a few years after surgery and chemotherapy. To study gliomas, MALDI mass spectrometry imaging is a technique of choice, allowing for tumor heterogeneity analysis. In this study, MALDI-MSI is coupled with spatially-resolved microproteomic aiming at identifying subgroups of glioblastomas patients in order to help for diagnosis and prognosis. Molecular images are generated from thin tissue sections to determine digested peptides spatial localizations. Based on unsupervised statistical analysis, we generated hierarchical clustering of homogeneous molecular regions. According to these regions, spatially resolved proteomic provided a broad range of protein identification and their relative quantifications. The hierarchical clustering reveals three molecular regions within all the tumor samples. Based on these regions, three groups of patients can be determined: group A (13/50 patients), group B (9/50 patients) and group C (23/50 patients) and 5 non-classifiable patients, each group with specific molecular signatures. Microproteomic analyzes show a panel of proteins specifically overexpressed in each group: proteins overexpressed in group A are associated with neurogenesis; those of group B are linked to immune system activation; and those of group C are involved in viral processes. Finally, we have identified 6 new prognosis markers for glioblastomas that could help stratifying patients and orient clinician in choosing therapeutics.In parallel, we were interested in developing a novel spatially resolved microproteomic technique based on tissue expansion. Tissue enlargement allows, while maintaining conventional proteomics methods, to analyze regions smaller than those currently achievable. Up to 655 proteins were identified within a region of 460 µm diameter, which corresponds to an average of 940 cells. In addition, this strategy is relevant for MS imaging as it gives the possibility to easily map a large number of proteins based on their quantification within a spatial resolution of less than 350 μm. Thus, tissue expansion is of great interest in increasing the spatial resolution of localized proteomics.Finally, studying circulating extracellular vesicles in blood may ultimately lead to an earlier diagnosis of glioblastomas. Proteomic analysis of patients' blood vesicles can identify proteins or networks already identified in tumor mass. Preliminary results from control plasma show that it is possible to isolate and perform proteomic analyzes on circulating vesicles. Thus, it would be interesting to be able to associate an extracellular vesicle profile for each group of tumors. In addition, we have been able to specifically isolate the vesicles embedded in a thin section of rat brain. These results are encouraging and, in the long term, will make it possible to identify vesicles originating from the tumor

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Murgoci, Adriana-Natalia. "The role of microglia derived extracellular vesicles in inflammatory and tumorous processes of the CNS : in vitro study." Thesis, Lille 1, 2018. http://www.theses.fr/2018LIL1S103/document.

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Abstract:

Dans cette étude on décrit une méthode reproductible et efficace pour isoler des cellules microgliales et leurs exosomes. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de différences morphologiques entre les cellules microgliales issues d'origines tissulaires différentes e.g. cortex et moelle épinière. D'autre part, en utilisant une plateforme de protéomique à grande échelle, nous démontrons que les microglies dérivées du cortex et de la moelle épinière des rats expriment des phénotypes différents tant dans les conditions physiologiques normales ou inflammatoires. Cette différence a été confirmée également au niveau des exosomes qu’elles sécrètent.Des essais biologiques in vitro démontrent que les exosomes dérivées de microglies testées sur des sphéroïdes 3D de gliomes de rat étaient capables d'inhiber l'invasion tumorale. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que des exosomes dérivées de la microglie pouvaient être utilisés comme agents nano thérapeutiques vis-à-vis des gliomes. Sur la base des études précédentes conduites au laboratoire, nous avons montré que les EVs isolées à partir de macrophage KD PC1/3 traitées avec Paclitaxel inhibaient la croissance de la lignée C6 de gliome de rat. Nous avons isolé les exosomes et nos résultats mettent en valeur le potentiel d'une stratégie thérapeutique combinant Paclitaxel et inhibition de PC1/3 et utilisation des exosomes produits par ces cellules comme agents thérapeutiques In present study, we present a reproducible and an efficient method for isolating microglial cells and their exosomes. The results show that there are no morphological differences between microglial cells from different tissue origins e.g. cortex and spinal cord. On the other hand, using a large-scale proteomic platform, we demonstrate that microglia derived from the cortex and spinal cord of rats express different phenotypes under both normal and inflammatory physiological conditions. This difference has also been confirmed at the level of the exosomes they secrete.In vitro bioassays demonstrate that microglia-derived exosomes tested on 3D spheroids of rat gliomas were able to inhibit tumor invasion. These results made it possible to demonstrate that exosomes derived from microglia could be used as nano-therapeutic agents vis-à-vis gliomas.Based on previous studies conducted in the laboratory, we have shown that EVs isolated from KD PC1/3 macrophage treated with Paclitaxel inhibited the growth of the rat glioma C6 line. We isolated the exosomes and our results highlight the potential of a therapeutic strategy combining Paclitaxel and PC1/3 inhibition and use of the exosomes produced by these cells as therapeutic agents

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Ryskaliyeva, Alma. "Exploring the fine composition of Camelus milk from Kazakhstan with emphasis on protein components." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLA016/document.

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Abstract:

La présente étude visait à identifier, en explorant la fraction protéique des laits de camélidés provenant de plusieurs régions du Kazakhstan, des molécules originales (peptides, protéines) potentiellement responsables des propriétés attribuées au lait de chamelle. Près de 180 échantillons de lait de 2 espèces de camélidés (Camelus bactrianus, C. dromedarius et leurs hybrides) ont été collectés à différents stades de lactation, âge et nombre de vêlages, et soumis à différentes techniques analytiques et approches protéomiques (SDS-PAGE, LC-MS/MS et LC-ESI-MS). Cinquante molécules protéiques correspondant à des variants génétiques, des isoformes issues de modifications post-traductionnelles et d'épissages différentiels, appartenant à 9 familles de protéines (κ-, αs1-, αs2-, β- et γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA / LPO) ont été caractérisées. L’existence de deux isoformes inconnues (i1 et i2) de la caséine αs2 a été observée dans les deux esèces. Ces isoformes sont des variants d'épissage consécutif pour l’un à l’intégration d'une séquence de 27 nucléotides « in frame », codant pour le nonapeptide ENSKKTVDM, dont la présence a été confirmée au niveau génomique, flanquée de motifs canoniques définissant une structure exonique. La seconde isoforme, présente à différents niveaux de phosphorylation compris entre 8P et 12P, comporte un décapeptide supplémentaire (VKAYQIIPNL), révélé par LC-MS/MS, codé par une extension 3 'de l'exon 16. En outre, nous rapportons, pour la première fois à notre connaissance, l’existence d'une isoforme de phosphorylation de la caséine αs2 présentant au moins un résidu S/T phosphorylé n’appartenant pas à la séquence canonique habituelle (S/T-X-A) reconnue par la kinase mammaire, suggérant ainsi l'existence de deux systèmes impliqués dans la phosphorylation des caséines, dans la glande mammaire.S’agissant de la WAP, nous avons identifié chez C. bactrianus un nouveau variant génétique (B), issue d'une transition G => A conduisant à un changement de codon (GTG/ATG) dans la séquence nucléotidique de l’ARNm, qui entraine un changement d’acide aminé en position 12 de la protéine mature (V12M). Un variant résultant de l’usage du site d'épissage canonique, reconnu comme tel chez les autres mammifères exprimant la WAP dans leur lait, a été identifié. La forme majoritaire de la WAP cameline, décrite pour la première fois par Beg et al. (1986) qui présente une insertion de 4 résidus d'acides aminés (56VSSP59) dans le segment peptidique reliant les deux domaines 4-DSC, résulte de l'utilisation d'un site d'épissage cryptique intronique improbable, prolongeant l'exon 3 du gène de 12 nucléotides sur son extrémité 5 '. De plus, nous confirmons que chez les camélidés, l'intron 3 du gène spécifiant la WAP, est un intron rare de type GC-AG, avec un site donneur faible qui s’accompagne d’un effet compensatoire au site consensus de l'exon accepteur.Finalement, en utilisant un protocole optimisé, nous avons isolé les vésicules extracellulaires (VE) dérivés du lait de camélidés présentant les caractéristiques morphologiques, de taille et de contenu en protéines des exosomes. Nous avons identifié un millier de protéines différentes représentant le premier protéome des VE dérivés du lait de chamelle qui semble plus étendu que le protéome du lait de chamelle, incluant notamment les marqueurs associés aux VEs, tels CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 et ADAM10. Nous avons également identifié des protéines présentes dans d'autres compartiments du lait. C'est notamment le cas pour les protéines apparentées à Ras, MFG-E8, ou CD9 qui sont également présentes dans les globules gras du lait. Nos résultats suggèrent par ailleurs fortement que les VEs dérivés du lait de chamelle ont des origines cellulaires différentes The present study aimed to identify, in exploring the protein fraction of camelid milks from several regions of Kazakhstan, original molecules (peptide, proteins) potentially responsible for the properties attributed to camel milk. Nearly 180 milk samples from two camel species (Camelus bactrianus and C. dromedarius, and their hybrids) we collected at different lactation stage, age and calving number, and submitted to different proven analytical techniques and proteomic approaches (SDS-PAGE, LC-MS/MS and LC-ESI-MS). A detailed characterization of 50 protein molecules, relating to genetic variants, isoforms arising from post-translational modifications and alternative splicing events, belonging to 9 protein families (κ-, αs1-, αs2-, β-; and γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA/LPO) was achieved. We reported the occurrence of two unknown isoforms (i1 and i2) of camel αs2-CN arising from alternative splicing events. Using cDNA-sequencing, i1 was characterized as a splicing-in variant of an in-frame 27-nucleotide sequence, of which the presence at the genome level, flanked by canonic motifs defining an exon 13 encoding the nonapeptide ENSKKTVDM, was confirmed. Isoform i2, which appeared to be present at different phosphorylation levels ranging between 8P and 12P, was shown to include an additional decapeptide (VKAYQIIPNL), revealed by LC-MS/MS, encoded by a 3’-extension of exon 16. In addition, we reported, for the first time to our knowledge, the occurrence of a αs2-CN phosphorylation isoform with at least one phosphorylated S/T residue that does not match with the usual canonic sequence (S/T-X-A) recognized by the mammary kinase, suggesting thereby the existence of two kinase systems involved in the phosphorylation of caseins in the mammary gland.As far as camel WAP is concerned, we identified in C. bactrianus a new genetic variant (B), originating from a transition G => A, leading to a codon change (GTG/ATG) in the nucleotide sequence of cDNA, which modifies a single amino acid residue at position 12 of the mature protein (V12M). In addition, we describe the existence of a splicing variant of camel WAP, arising from an alternative usage of the canonical splice site recognized as such in the other mammalian species expressing WAP in their milk. We also report that the WAP isoform predominantly present in camelids milk, first described by Beg et al. (1986) as displaying an additional sequence of 4 amino acid residues (56VSSP59) in the peptide segment connecting the two 4-DSC domains, results from the usage of an unlikely intron cryptic splice site, extending camel exon 3 on its 5’ side by 12-nucleotides. In addition, we confirm that in the camel gene encoding WAP, intron 3 is a GC-AG intron, with a GC donor site showing a compensatory effect in terms of a dramatic increase in consensus at the acceptor exon position.Finally, using an optimized protocol, we isolated camel milk-derived EVs satisfiying the typical requirements for exosomal morphology, size and protein content. We identified a thousand of different proteins representing the first comprehensive proteome of camel milk-derived EVs that appears wider than camel milk proteome, including markers associated with small extracellular vesicles, such as CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 and ADAM10. We also identified proteins present in other milk components. This is particularly the case for lactadherin/MFG-E8, Ras-related proteins or CD9 that have been reported to occur in MFG. Our results strongly suggest that milk-derived exosomes have different cellular origin

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Linares, Romain. "Caractérisation, quantification et isolation de vésicules extracellulaires du plasma sanguin à l’aide de nanoparticules d’or ou magnétiques conjuguées à des protéines." Thesis, Bordeaux, 2016. http://www.theses.fr/2016BORD0344/document.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des vésicules membranaires de taille majoritairement submicrométrique présentes dans les fluides biologiques et émises par les cellules en réponse à divers stimuli. Les VEs sont impliquées dans de nombreux phénomènes physiologiques mais également dans des pathologies telles que cancers ou maladies cardiovasculaires. Elles pourraient donc être utilisées comme biomarqueurs de ces pathologies. Bien que les VEs soient aujourd’hui largement étudiées, nos connaissances sur le sujet demeurent limitées. Ceci est principalement dû aux difficultés de caractérisation des VEs et à l’absence de standardisation de leurs méthodes d’étude et d’isolation. La première partie de mon travail de thèse a porté sur le développement d’une méthode de thiolation de protéines. Des anticorps ont été modifiés pour exposer des thiols et ont été conjugués à des nanoparticules d’or fonctionnalisées par des maléimides. Le couplage des anticorps thiolés aux nanoparticules d’or a été étudié de manière quantitative et des conditions de conjugaison optimales ont été déterminées par des approches biochimiques. La seconde partie de ce travail a concerné la caractérisation des VEs du plasma sanguin de sujets sains par microscopie électronique à transmission (MET). La morphologie, la taille et le phénotype des VEs ont été déterminés par cryo- MET combinée au marquage par des nanoparticules d’or conjuguées à des protéines. La quantification objective des VEs du plasma sanguin a été réalisée à l’aide d’une méthode originale de MET basée sur la sédimentation de VEs sur grille de MET. La troisième partie de cette étude a consisté à mettre au point une méthode d’isolation de VEs à l’aide de particules magnétiques conjuguées à de l’AnxA5. Des conditions permettant d’extraire la totalité des VEs exposant la phosphatidylsérine contenues dans un plasma sanguin ont été déterminées par cytométrie en flux (CF). Ce travail a permis d’apporter une caractérisation détaillée des VEs du plasma sanguin du sujet sain et peut servir de référence pour des études ultérieures concernant les VEs contenues dans des plasmas ou autres liquides biologiques pathologiques Extracellular vesicles (EVs) are submicrometric membrane vesicles found in body fluids and produced by cells in response to various stimuli. EVs are involved in numerous physiological processes but also in pathologies as cancers or cardiovascular diseases. Even if EVs are largely studied, our knowledge about them remains limited. This is mainly caused by the difficulties to characterize EVs and by the lack of standardized methods allowing their characterization. The first part of my PhD work focused on the development and optimization of a protein thiolation method. Antibodies modified to expose few thiols were conjugated to gold nanoparticles functionalized with maleimides. The binding of thiolated antibodies to gold nanoparticles was quantitatively studied and optimal conjugation conditions were determined using biochemical methods. The second part of my PhD work concerned the characterization of blood plasma EVs from healthy subjects using transmission electron microscopy (TEM). EVs morphology, size and phenotype were determined by cryo-TEM combined with labelling with protein-conjugated gold nanoparticles. The near-absolute quantification of blood plasma EVs was achieved using an original TEM method based on the direct sedimentation of EVs onto TEM grids. The third part of this study consisted in developing an EV isolation method using AnxA5-conjugated magnetic particles. Conditions allowing total extraction of blood plasma phosphatidylserine-exposing EVs were determined using flow cytometry (FC). This study presents a detailed characterization of blood plasma EVs from healthy subjects and can serve as a reference for future studies on EVs contained in pathological plasmas or other body fluids

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Dostert, Gabriel. "Les nanovésicules extracellulaires sécrétées par les CSMs et les nanovésicules de synthèse issues d’agro-ressources : de leur caractérisation à leur utilisation en ingénierie tissulaire." Thesis, Université de Lorraine, 2017. http://www.theses.fr/2017LORR0097/document.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires nanométriques (nEVs) issues de cellules souches mésenchymateuses (CSMs) et les nanovésicules synthétiques sont au centre de nombreuses recherches pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en médecine régénérative. La mise en place d’une méthode standardisée pour isoler les nEVs à partir de milieu conditionné de CSMs et de pouvoir les caractériser a été nécessaire. Nous nous sommes concentrés sur leur taille qui se situe entre 30 et 150 nm ainsi que la présence de certains de leur marqueurs membranaires (CD9, CD63 et CD81). Durant ce travail, deux méthodes d’isolement ont été testées. Les résultats obtenus par les analyses physiques (Nanosight®, microscopie électronique à transmission) et biologiques (cytométrie en flux) des différents échantillons ont permis de standardiser la méthode d’isolement des nEVs par centrifugations et ultracentrifugations successives. Ensuite, nous nous sommes intéressés à l’utilisation de ces nEVs sécrétées par les CSMs en culture cellulaire. Il a été mis en évidence que des interactions existent entre ces nEVs et des cellules endothéliales (CEs) in vitro. Ces interactions vont entraîner des modifications dans le comportement cellulaire des CEs en augmentant leur potentiel de formation de réseaux vasculaires. En parallèle de ces travaux sur les nEVs, une étude a été réalisée sur l’utilisation de nanovésicules synthétiques, des nanoliposomes (NLPs), élaborées à partir de lécithine d’agro-ressource (saumon) comme transporteur de TGF-ß1 pour une application en médecine régénérative. Après leur caractérisation physico-chimique, cette étude préliminaire a montré que ces NLPs ne présentent pas de cytotoxicité pour les CSMs in vitro. Il existe un potentiel important d’utilisation des nEVs de CSMs ainsi des NLPs pour développer de nouvelles stratégies innovantes en thérapie « cell-free » dans le domaine de la médecine régénérative Nanoscale extracellular vesicles (nEVs) derived from mesenchymal stem cells (MSCs) and synthetic nanovesicles are at the centre of many research studies for the development of new therapeutic strategies in regenerative medicine. A standardized method was used to isolate nEVs from conditioned media of CSMs and to characterize them. We focused on their size with a range of 30 to 150 nm and the presence of some of their membrane markers (CD9, CD63 and CD81). During this work, two isolation methods were tested. The results obtained by the physical (Nanosight®, transmission electron microscopy) and biological (flow cytometry) analyses of the different samples allowed to standardize the method of isolation of the nEVs by successive centrifugation and ultracentrifugation. Then, we studied the use of these nEVs derived from MSCs in cell culture. Interactions between these nEVs and endothelial cells (ECs) have been demonstrated in vitro. These interactions lead to changes in the cellular behaviour of ECs by increasing their potential to form vascular networks. In parallel of this work on nEVs, we studied the use of synthetic nanovesicles, called nanoliposomes (NLPs) prepared from agro-resource derived lecithin (salmon) as TGF-β1 transporters for applications in regenerative medicine. After their physicochemical characterization, this preliminary study showed that these NLPs do not exhibit cytotoxicity for MSCs in vitro. There is an important potential for the use of nEVs derived from MSCs as well as NLPs to develop new cell-free therapy innovative strategies in the field of regenerative medicine

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Cardoso, Bueno de Camargo Lívia. "Le rôle des vésicules extracellulaires dans la capacité invasive du cancer du sein : les fonctions de la famille des facteurs de transcription NFAT." Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC093.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des importants moyens de communication cellulaire, permettant l'échange intercellulaire des mARNs, microARNs et des protéines, parmi d'autres molécules. Depuis quelques années leur rôle dans le développement du cancer est de plus en plus étudié et leur importance dans ce contexte reconnue. Dans le travail présenté ici, nous nous sommes investis dans l'étude du rôle des EVs dans l'établissement des profils d'invasion des lignées de cellules du cancer du sein. Nous nous sommes particulièrement intéréssés à la possibilité que les effets opposés sur la motilité cellulaire des cellules du cancer du sein exercés par NFAT1/NFAT5 et NFAT3 (membres de la famille de facteurs de transcription Nuclear Factor of Activated T Cells) puissent être liés au rôle des EVs dans le contrôle de l'invasion cellulaire. D'une part, NFAT1 et NFAT5 sont exprimés par des lignées fortement invasives du cancer du sein, qui n'expriment pas le récepteur alpha de l'cestrogène (ER alpha -). D'autre part, NFAT3 est exprimé par des lignées moins agressives, qui sont ER alpha+. Pour étudier le possible transfert de ces effets opposés de NFAT par les EVs, nous avons effectué le traitement de cellules fortement invasives (MDA-MB 231) avec des EVs isolées à partir des cellules faiblement invasives (T47D) et vice-versa. Nous avons pu observer que les EVs secrétées par les MDA-MB 231 ont induit une augmentation de l'invasivité des T47D. Inversement, les EVs isolées à partir de T47D ont réduit l'invasivité des MDA-MB 231. De plus, l'expression de NFAT3 chez les T47D est essentielle pour que la réduction d'invasivité puisse avoir lieu, puisque son inhibition dans ces cellules produit des vésicules incapables de promouvoir la réduction d'invasivité. Nous avons aussi démontré que les EVs originaires des T47D induisent la transcription active de TGFbetal chez les MDA-MB 231 qui les reçoivent. Cette augmentation dans les taux de TGFbetal dans la cellule réceptrice est aussi essentielle pour la réduction de la mobilité cellulaire. Ces résultats ont aussi été étendus in vivo où les EVs de T47D (utilisés dans le traitement des souris nude dans lesquelles des cellules humaines MDA MB 231 D3H2LN ont été injectées dans le coussinet adipeux mammaire) réduisent la taille de la tumeur primaire et la formation des métastases d'une façon dépendante de l'expression de NFAT3 chez les cellules productrices d'EVs. Les niveaux sériques de TGFbetal ont aussi augmenté chez les souris où le traitement a été efficace, ce qui fait de cette molécule un bon candidat pour le suivi de l'efficacité du traitement. Nos résultats suggèrent que les EVs representent un possible moyen d'inhibiton de l'invasion des cellules agressives du cancer du sein, et peuvent donc être une option attrayante pour diminuer la progression tumorale chez les patients de cette maladie Extracellular vesicles (EVs) represent an important means of cell communication, through which cells can exchange functional mRNAs, microRNAs and proteins, amongst other molecules. During the past few years, the understanding of their role in cancer onset and progression has been largely developed. In this work, we approach the role of EVs in changing the invasive profiles of breast cancer cell lines. We were specifically interested in studying whether the opposite effects of the members NFAT1/NFAT5 and NFAT3 (members of the Nuclear Factor of Activated T cells family of transcription factors) in breast cancer cell motility could be linked to EV function in modulating cell invasiveness. While NFAT1 and NFAT5 are expressed by more invasive breast cancer cell lines that do not express the estrogen receptor alpha (ER alpha -), NFAT3 is expressed by cell lines with less aggressive profile, that are ER alpha +. To study the possible transfer of these opposite effects of NFAT factors through EVs, highly invasive (MDA-MB 231) and poorly-invasive (T47D) breast cancer cell lines were treated with each other's EVs. We have observed that an increase of invasion is induced through EVs secreted by MDA-MB 231. EVs secreted by T47D, on the other hand reduce invasiveness. Moreover, NFAT3 expression in T47D is an essentiel aspect in this second type of response, since when its expression is inhibited in these cells their EVs no longer have the power to reduce MDA-MB 231 invasiveness. We also show that EVs originated from T47D induce the active transcription of TGFbetal ir the recipient MDA-MB 231 to blunt cell nnotility. These results were extended in vivo, where we have demonstrated that T47D EVs are able to reduce primary tumour size and decrease metastasis formation in nude mice injected with human MDA-MB 231 D3H2LN cells in the mammary fat pad. Similarly to our in vitro results, NFAT3 expression in the EV producing cells was shown to be key for their EVs to present these effects. Furthermore, we could also observe TGFbetal sera levels increased in the mice where the treatment was effective, making this molecule a potentiel candidate for following treatment efficiency. Our findings suggest that EVs could represent a possible means of inhibiting the invasion of aggressive cancer cells, and therefore may be an attractive option to decrease tumor progression and metastasis in patients

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Piffoux, Max. "Approches interdisciplinaires du domaine des vésicules extracellulaires : nouvelles méthodes et outils pour le transfert en clinique en médecine régénérative et délivrance de médicaments." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC243.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires sont des nano-vésicules (100nm) comprenant les exosomes, microvesicules et corps apoptotiques, sécrétées par toutes les cellules de l’organisme. Elles ont des rôles physiologiques et physiopathologiques dans l’hémostase, l’inflammation, la transmission d’information et de molécules biologiques, les métastases, ou la régénération tissulaire. Par exemple, des vésicules issues de cellules souches mésenchymateuses ont le même effet que leur cellule mère dans la régénération du myocarde infarci, mais ont beaucoup d’avantages par rapport à ces dernières : possibilité de les conserver au congélateur, peu immunogènes, ne provoquant pas d’embolies, pas de risque de différentiation anarchique, etc. Toutefois, l’utilisation en clinique de ces vésicules reste difficile pour des raisons pratiques : très faible production par les cellules, difficulté à les caractériser, méthodes de chargement avec des agents thérapeutique peu reproductible, méthodes d’imagerie ou de d’ingénierie peu efficientes, etc. Nous avons développé des méthodes pour répondre à ces défis, croisant la biologie, la pharmacie et la physique, et avons pu découvrir que certaines de ces techniques pouvaient être utilisées dans d’autres domaines et pour d’autres indications. En pratique, pour répondre au problème de la caractérisation des vésicules, nous avons proposé une nouvelle méthode d’imagerie utilisant le microscope électronique en cellule liquide « in situ » pour observer des vésicules dans leur milieu liquide en temps réel, et peut être utilisé pour observer d’autres matériaux et phénomènes comme les liposomes ou des processus biologiques. Nous avons proposé une nouvelle méthode de chargement des vésicules avec des molécules thérapeutiques en les fusionnant avec des liposomes, permettant la délivrance d’agents de chimiothérapie plus efficacement que des liposomes. La méthode de production des vésicules à grand rendement a nécessité 3 d’itérations successives, toutes basées sur le même concept de vésiculation induite par une contrainte mécanique, et a abouti à une méthode efficace, scalable, et conformes aux standards de production pharmaceutique. La protéomique de ces vésicules montre des expressions de protéines plus proche d’un sous type de vésicule issues de la membrane plasmique appelées microvésicules. Les vésicules issues de cette méthode ont été testées in vitro avec succès, induisent un phénotype régénératif dans des modèles cicatrisation de fistule cutanéo-digestives et des modèles murins d’insuffisance cardiaque chronique. D’autres études sur les vésicules produites par cette méthode sont en cours sur la régénération osseuse, articulaire et cérébrale, ou la délivrance de médicaments et sur l’inhibition du phénomène métastatique en cancérologie. Nous commençons aujourd’hui à défricher le transfert de ces vésicules en clinique par le biais de productions en conditions pharmaceutiques dites et de la mise en place d’une start-up Extracellular Vesicles, encompassing exosomes, microvesicles, apoptotic bodies are nanosized vesicles secreted by most cells of the organism, that demonstrated physiologic and physio-pathologic roles in various processes like hemostasis, metastasis, information transfer through biological macromolecules or more recently in inflammation resolution in regenerative medicine. Therapeutic use of these EVs, in particular as drug delivery systems or as a regeneration triggering agent is of a major interest, for example the use Mesenchymal Stem Cells derived EVs after myocardial infarction or stroke. EV recapitulate their parental cell effect and benefit from unique opportunities like off the shelf availability, low immunogenicity and no anarchic differentiation or pulmonary embolism. However, major obstacles are still to be faced in the field, like the EV drug loading, engineering, targeting, characterization, delivery method and GMP high yield production toward clinical translation. We developed new methods to respond to these needs at the crossroad of biology, physics, pharmacy and medicine, and discovered meanwhile that some of these techniques can be used in other fields and indications. As an example, a new liquid cell transmission electron microscopy labeling method was used to investigate live in situ at the nanoscale level EVs behavior, and can be used for other “soft” materials like liposomes or biology processes. The PEG induced liposome/EV fusion method was designed to produce biological/synthetic hybrids with engineered membrane properties and drug loading. A first response to the production problem was made designing a microfluidic chip allowing shear stress application to trigger EV production. The concept of shear stress triggered EV release was also used in the design of 2nd generation system for high yield, scalable and compliant with Good Manufacturing Practice, EV production method that uses a controlled shear stress to induce EV secretion. These EVs were tested in regenerative medicine models of fistula healing and chronic heart insufficiency confirming the interest of a new local delivery method using thermosensitive gels and their potency compared to parental cells. Our team is now exploring the scale-up, immunogenicity, and stability of these EVs and benchmarking their cost/efficiency in various models to pave the way toward the democratization of EV-based regenerative medicine through a company/platform creation

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Vaubourg, Camille. "Développement de nouvelles approches thérapeutiques pour la dystrophie musculaire de Duchenne, basées sur l'utilisation de vésicules extracellulaires Minimal Consequences of CMAH and DBA/2J Background on a FKRP Deficient Model." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL012.

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Abstract:

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique rare causée par des mutations au sein du gène DMD, codant pour la dystrophine qui affecte les muscles squelettiques, cardiaque et respiratoires. Les patients présentent un phénotype dystrophique réduisant leur mobilité et leur espérance de vie. A l'heure actuelle, aucun traitement curatif n'est disponible pour l'ensemble des patients. Ce travail de thèse a visé à développer de nouvelles approches thérapeutiques basées sur l'utilisation de vésicules extracellulaires (VE), des particules de taille variant entre 40 et 500 nm, sécrétées par la majorité des types de cellules, qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire par transfert de biomolécules. Elles sont en parallèle de plus en plus étudiées comme nouveau système de vectorisation non-viral de molécules thérapeutiques car elles présentent de nombreux avantages : une biocompatibilité, une faible immunogénicité, une capacité à moduler des voies de signalisation, la possibilité de les charger en molécules thérapeutiques de différentes natures ou la possibilité de modifier leur tropisme tissulaire. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à la vectorisation, par les VE de cellules souches mésenchymateuses (MSCs), de deux molécules agissant sur deux voies majeures du processus dystrophique (Smad7 et des siARN contre NF-kB) mais aussi de la nucléase du système CRISPR/Cas9 pour agir sur l'expression de la dystrophine. Avant le développement de sa vectorisation par les VE, le potentiel thérapeutique de Smad7 a été évalué par transfert de gène par vecteur AAV. Une augmentation de la masse musculaire sans réduction du niveau de fibrose a été observée. En parallèle, les protocoles de production, isolement et caractérisation des VE ont été définis et validés. Les VE de MSCs sur le processus dystrophique a été évalué et a montré un effet sur les éléments régulateurs de type microARN. Egalement, le chargement de siARN dans les VE a été initié et celui de l'endonucléase spCas9 a été validé. Le transfert in vitro de cette dernière a été validé, avec toutefois une fonctionnalité qui reste à prouver Duchenne muscular dystrophy is a rare genetic disease caused by mutations in the DMD gene, coding for dystrophin, affecting skeletal, cardiac and respiratory muscles. Patients show a dystrophic phenotype reducing their mobility and life span. Today, no cure is available for all patients. This thesis work aimed to develop new therapeutic approaches based on the use of extracellular vesicles (EVs), particles of 40-500 nm of diameter secreted by the majority of cell types and playing a role in intercellular communication by transferring biomolecules. The EVs are more and more studied as new non-viral delivery system of therapeutic molecules as they present a number of advantages: biocompatibility, low immunogenicity, ability to modulate some signalling pathways, the possibility to load them with different kind of molecules and to target them to tissues of interest. In this work, we were interested in the vectorization, by mesenchymal stem cells (MSCs)-derived EVs, of two molecules acting on main pathways of the dystrophic process (Smad7 and siRNA against NF-kB) as well as the nuclease of the CRISPR/Cas9 system for acting on dystrophin expression. Before the development of Smad7 vectorization by EVs, its therapeutic potential have been evaluated by AAV gene transfer. An increase of the muscle mass without any reduction of the fibrosis level has been observed. In parallel, EVs production, isolation and characterization protocols have been set up and validated. The effect of MSCs-derived EVs on dystrophic process have been assessed and showed an impact on regulatory elements as microRNA. Also, the loading of siRNA in EVs have been initiated and the one of the spCas9 have been validated. The in vitro transfer of the last one have also been validated, but its functionality has to be confirmed

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Dissertations / Theses on the topic 'Vésicules extracellulaire'

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