Dissertations / Theses on the topic 'Virus hepatite b canard'

Orientadores: Fernando Lopes Gonçales Junior, Neiva Sellan Lopes Gonçales
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-04T02:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_Claudiada_M.pdf: 5366361 bytes, checksum: e07618e3f3502fa067dd078ba533e4fd (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: A infecção pelo VHB em pacientes que não apresentam o antígeno de superficie do vírus da hepatite B (HBsAg) detectável pelos métodos usuais, é denominada de infecção oculta. Sua prevalência e significado clínico, não estão ainda, completamente esclarecidos. A proposta deste estudo foi o de investigar: a) a presença de infecção oculta pelo VHB em pacientes com infecção crônica pelo VHC; b) correlacionar a presença do DNA do VHB com fatores de riscos para aquisição da HVB e HVC ; c) correlacionar a presença do DNA do VHB com as alterações histológicas e hepáticas nos pacientes co- infectados pelo VHC e com a resposta ao tratamento da hepatite C. Foi utilizada a Reação em Cadeia da Polimerase para pesquisar o DNA do VHB em amostras de soro de 256 indivíduosHBsAg negativo e anti-HBc positivo: 150 eram doadores de sangue (100 eram anti-HBc isolado e 50 eram anti-HBc / anti-HBs positivo) e 106 eram pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) (50 eram anti-HBc isolado e 56 eram anti-HBc / anti-HBs positivo). A prevalência da infecção oculta pelo VHB variou de 4% (6/150) nos doadores de sangue a 24% (12/50) nos pacientes com infecção crônica pelo VHC (anti-HBs negativo). A prevalência da infecção oculta pelo VHB em todos os pacientes co-infectados com o YHC foi de 14.2% (15/106). Foi observado que nos pacientes com infecção oculta pelo VHB, o anticorpo contra o antígeno de superficie do VHB (anti-HBs) não foi capaz de proteger os pacientes co-infectados pelo VHC (5,4, 3/56). Não houve correlação entre os diferentes genótipos do VHC e a presença de infecção oculta pelo VHB nem com o grau histológico de lesão hepática. A infecção oculta pelo VHB não influenciou na resposta ao interferon em pacientes com infecção crônica pelo VHC
Abstract: HBV infections in patients who lack levels of hepatitis B surface antigen (HBsAg) are called occult infections. Their prevalence and clinical significance are not yet fully understood. The purpose of this study was to investigate: a) the prevalence ofHBV occult infection in patients with chronic HCV infection; b) to correlate the presence ofHBV DNA with risk factor to acquire HBV and HCV infection; c) to correlate the presence of HBV DNA in serum with histopathologic al terations and the response to interferon therapy in patients with chronic HCV infection. We used the polymerase chain reaction to search for HBV DNA in serum samples from 256 HBsAg negative and anti-HBc positives subjects: 150 were blood donors (100 were anti-HBc alone and 50 were anti-HBc / anti-HBs positive), 106 were patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection (50 were anti-HBc alone and 56 were anti-HBc / anti-HBs positive). The prevalence of HBV occult infection ranged from 4% (6/150) in blood donors to 24% (12/50) in patients with chronic HCV infection anti-HBc / anti-HBs negative. The prevalence of HBV occult in the totality of patients co-Ínfected with HCV was 14.2% (15/106). It was observed that in our patients with HBV occult infection the antibodies to anti-HBs was not able to protect the patients co-Ínfected with HCV (5.4, 3/56). There was not correlation between different genotypes and the presence HBV occult infection neither with the lesion histological grade. The HBV occult infection did not influence in the response to interferon therapy in the patients with chronic HCV infection
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) induit hépatites aigue͏̈s et chroniques pouvant entraîner une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Les thérapies actuelles ont une efficacité insuffisante, elles inhibent la réplication virale mais n'éliminent pas complètement la matrice transcriptionnelle du virus, l'ADN superenroulé (ADN CCC), persistant dans le noyau des cellules infectées. Dans ce contexte nous avons essayé de comprendre le devenir de la forme superenroulée de l'ADN viral lorsque les cellules se divisent. Nous avons montré, en utilisant des cultures primaires d'hépatocytes d'embryons de canards infectés expérimentalement, que cette entrée des hépatocytes dans le cycle cellulaire va favoriser l'amplification initiale d'ADN CCC. Nous avons ensuite regardé si l'entrée dans le cycle cellulaire avait un effet sur la transcription virale. Dans notre modèle, nous n'avons pas mis en évidence d'effet direct de l'entrée dans le cycle cellulaire sur les taux d'ARN viral. Cette étude nous a permis de conclure que, après la division d'hépatocytes chroniquement infectés, les cellules filles sont porteuses des protéines virales de capside ; suggérant que ces hépatocytes restent infectés après leur division. Enfin, nous avons cherché à inhiber la formation initiale de l'ADN CCC avec un nouvel analogue de nucléoside, l'adéfovir. Ce travail montre qu'un traitement préventif par l'adéfovir permet de diminuer fortement la réplication virale, de manière plus efficace que la lamivudine, sans toutefois inhiber totalement l'infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite B. Nous avons donc montré très clairement que la persistance du virus dans les cellules lors du turn-over des hépatocytes est un point clé expliquant l'échec de l'élimination totale du virus lors des traitements de l'infection par le VHB. Ce travail a aussi permis de mettre en évidence la grande efficacité d'un nouvel analogue de nucléoside très prometteur : l'adéfovir.

Les traitements actuels visant a inhiber la replication du virus de l'hepatite b (vhb) chez les patients chroniquement infectes, et ainsi a prevenir l'evolution des hepatites b chroniques vers l'hepatocarcinome, ont une efficacite insuffisante. Des donnees recentes suggerent que les approches immunotherapeutiques, et en particulier l'immunisation par adn nu ou vaccin genetique, pourraient etre particulierement interessantes pour le controle de l'infection chronique par le vhb. Cette nouvelle approche de vaccination est basee sur l'induction de puissantes reponses immunitaires par injection de l'adn exprimant une proteine antigenique virale. L'objectif de notre travail etait d'utiliser le modele du virus de l'hepatite b du canard (dhbv), etroitement apparente au vhb, afin d'evaluer l'efficacite de la vaccination genetique pour la protection et la therapie de l'hepatite b. Dans un premier temps, nous avons mis au point l'immunisation par adn nu de canards avec un plasmide codant pour la grande proteine d'enveloppe (l) du dhbv. Nos resultats montrent que l'immunisation d'animaux adultes non infectes avec ce plasmide induit une reponse humorale forte, specifique de la proteine l du dhbv, et capable de neutraliser le pouvoir infectieux du virus. De plus, les anticorps induits sont transmis verticalement de la cane immunisee aux canetons, via l'uf, et sont capables de les proteger contre une epreuve virulente par le dhbv. Dans un deuxieme temps, nous avons demontre que la combinaison de l'immunisation par adn avec la production d'anticorps dans les ufs permet d'obtenir rapidement des quantites tres importantes d'anticorps specifiques de l'enveloppe virale et neutralisants (brevet depose). De plus, l'immunisation d'animaux nouveau-nes par adn nu non seulement n'induit pas d'immunotolerance mais est egalement capable d'induire une reponse primaire memoire superieure a celle induite par l'immunisation avec une proteine recombinante. Enfin, l'immunotherapie par adn nu d'animaux chroniquement infectes par le dhbv induit une baisse de la replication virale chez tous les animaux traites, et meme dans quelques cas l'elimination de la forme d'adn viral superenroule intrahepatique responsable de la chronicite de l'infection. L'ensemble de ces resultats suggere que l'immunisation par adn pourrait representer la base de nouvelles approches protectrices et therapeutiques de l'infection par le vhb.

Les études structurales des protéines membranaires eucaryotes sont importantes mais particulièrement difficiles à effectuer car elles nécessitent non seulement un système efficace et pratique pour produire la protéine dans une conformation native, d’une technique d’étude structurale compatible avec ce dernier. Du fait de leur modularité, les systèmes de production acellulaires in vitro sont adaptés à la production de protéines membranaires. De plus, l’amélioration de leur robustesse et de leur efficacité les rendent maintenant comme une alternative viable à l’expression cellulaire. Parmi ceux-ci, le Système d’Expression Acellulaire à partir de Germes de Blé (SEA-GB) est le plus efficace pour produire des protéines membranaires eucaryotes, et permet de plus un marquage isotopique efficace et spécifique. Ce dernier point est très utile pour la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), et plus spécifiquement la RMN du solide qui permet l’étude structure de protéines membranaires et d’assemblages macromoléculaires. Depuis récemment, la RMN du solide est compatible avec le SEA-GB, formant un outil puissant pour l’étude structurale de protéines membranaires et assemblages macromoléculaires. Dans ces travaux, les deux techniques ont été combinées pour la production et l’étude des protéines d’enveloppe du virus de l’Hépatite B du canard (VHBC), appartenant à la famille des Hepadnaviridae. Ces virus sont capables de sécréter des virions actifs, mais aussi des particules composées uniquement de protéines d’enveloppe, appelées particules sous-virales (PSV). Dans un premier temps, nous montrons que plusieurs milligrammes de petite protéine d’enveloppe (DHBs S) du VHBC sont produits sous forme soluble avec le SEA-GB. DHBs S forme des PSV durant la traduction, ce qui confirme la conformation native de la protéine. Après désassemblage des PSV, la protéine est majoritairement en hélice , synonyme d’un bon repliement. Après isolation par ultracentrifugation sur gradient de sucrose, les PSV ont été sédimentées dans un rotor de 0.7 mm et étudiées par RMN du solide. Des spectres 2D hNH très prometteurs ont été obtenus, avec un bon signal, des pics isolés et une résolution similaire à celle d’autres protéines membranaires sédimentées et étudiées par RMN du solide. De plus, la superposition du spectre de DHBs S avec des spectres simulés de protéines modèles possédant des structures secondaires caractéristiques confirme que DHBs S est principalement en hélice dans le contexte des PSV. Le signal doit cependant être amélioré pour pouvoir réaliser les expériences nécessaires à des études structurales approfondies, c’est pourquoi des tests d’optimisation de la production ont été effectués. D’une part, l’amélioration du rendement de production, via l’utilisation d’un extrait de germes de blé commercial, et de la stabilisation des PSV, par incubation avec du KSCN, ont été testés. D’autre part, différentes méthodes de purification ont été examinées: précipitation à l’ammonium sulfate ou au PEG6000, incubation à haute température, élimination de contaminants via une unité d’ultrafiltration, purification d’affinité ou d’exclusion stérique ainsi qu’un test de désassemblage des particules, suivie d’une purification puis de la reconstitution des PSVs en présence de lipides. Enfin, un marquage isotopique spécifique de certains acides aminés a été évalué. Dans la seconde partie, nous avons étendu les possibilités du SEA-GB via l’expression de la grande protéine d’enveloppe (DHBs L) du VHBC. In vivo, la protéine est phosphorylée spécifiquement et subit aussi une traduction alternative ; nous avons montré que c’était aussi le cas dans le SEA-GB. Nous avons aussi testé la coexpression de DHBs S, DHBs L ainsi que de la capside de DHBV pour inclure DHBs L dans les PSV, voire même reconstituer des virions entiers, ce qui augmenterait les possibilités du système. Enfin, nous avons aussi détaillé certains paramètres critiques pour la formation des PSV dans le système
Structural studies of eukaryotic membrane proteins are of prime importance but notoriously difficult as they not only necessitate an efficient and practical overexpression system that allows for membrane protein expression in a biologically relevant folding, but also a structural technique that you can easily combine with the chosen protein production system. In vitro cell-free systems, due to their modulable nature, are particularly suited for membrane protein expression. Furthermore, they now established themselves as a viable alternative to conventional cell-based expression, notably because of considerable advances in robustness and efficiency. Amongst them, the wheat germ cell-free production system (WG-CFPS) proved to be the most efficient for production of eukaryotic membrane proteins, and allows for efficient and specific isotope labeling. This makes it particularly convenient for Nuclear Magnetic Resonance (NMR), and more specifically solid-state NMR which is particularly appropriate for membrane protein studies and macromolecular assemblies. Thanks to very recent advances that lead to a drastic reduction of the quantity of protein needed, solid-state NMR is now compatible with WG-CFPS, creating a powerful tool for structural studies of macromolecular assemblies and membrane proteins. In this work, these two techniques are combined for the production and study of the envelope proteins from the duck Hepatitis B Virus (DHBV), that belongs to the Hepadnaviridae family. These viruses are able to secrete active virions, but also particles composed only of envelope proteins, which are called subviral particles (SVPs). In the first part, we show here that the DHBV small envelope protein (DHBs S) is produced as soluble in mg amounts using WG-CFPS. Even more, the protein forms SVPs upon translation, and is thus expressed in a biologically relevant form. After SVPs disassembly, the protein displays a mostly -helical folding, which is characteristic of a well-folded protein, and also very similar to the secondary structure of an assembly-incompetent mutant. After further isolation by ultracentrifugation on a sucrose gradient, the SVPs were sedimented in a 0.7 mm rotor and observed by solid-state NMR. Very promising hNH 2D spectra, with a good signal, were obtained. They display numerous isolated peaks and a resolution alike to other sedimented membrane proteins observed by solid-state NMR. Moreover, superimposition of the DHBs S spectrum with simulated spectra from proteins with extreme secondary structure content confirms that the protein is mostly -helical in the context of the SVPs. Nonetheless, the signal still needs to be improved in order to perform the experiments necessary for in-depth structural analysis. To that end, sample optimization assays were conducted. On the one hand, protein yield improvement, by the use of a commercial wheat germ extract, and SVPs stabilization, by incubation with KSCN, were tried. On the other hand, different methods for SVPs purification were tested, including PEG6000 or ammonium sulfate precipitation, incubation at high temperature, contaminant removal with an ultrafiltration device, affinity or size-exclusion purification as well as tests of particles disassembly, purification followed by SVPs reconstitution in lipids. Finally, amino-acid specific isotopic labeling of DHBs S was evaluated. In the second part, we could show extended possibilities of WG-CFPS through expression of DHBV large envelope protein (DHBs L). In vivo, the protein undergo specific phosphorylation as well as alternative translation, and we could show that it is also the case upon wheat germ cell-free expression. We also tested coexpression of DHBs S, DHBs L and of the DHBV capsid in order to assess the possibility of DHBs L inclusion in SVPs, or even complete virion reconstitution, which could even augment WG-CFPS possibilities. Ultimately, we also detail some critical parameters for SVPs formation in the WG-CFPS

Introdução: O Vírus da Hepatite B (HBV) é um vírus de DNA com tropismo por hepatócitos, que apresenta um genoma circular parcialmente dupla fita. Baseado na divergência de sequência do genoma completo, dez linhagens evolutivas, denominadas “genótipos” de HBV, foram descritas (A-J), sendo F e H considerados como “indígenas” da América. Os genótipos de HBV apresentam uma forte estruturação geográfica, o que pode refletir padrões das migrações humanas. Na América do Sul, áreas de alto endemismo incluem a região amazônica, e as maiores taxas de infecção têm sido observadas em populações Nativas Americanas. Embora a forte estruturação geográfica seja indicativa de uma origem antiga, a maioria das análises visando datar a origem dos genótipos “americanos” F e H resulta em datações extremamente recentes que não condizem com eventos históricos relacionados ao HBV. Objetivo: Os objetivos desse trabalho compreendem avaliar o impacto de diferentes taxas evolutivas e da seleção purificadora sobre as estimativas de datação molecular a fim de inferir quais taxas são mais condizentes com a origem do HBV na América; caracterizar o HBV circulante em uma amostra histórica de Nativos Americanos, e discutir os processos históricos que possam ser relevantes para entender os padrões observados. Material e Métodos: Nós realizamos análise Bayesiana utilizando sequências disponíveis dos genótipos F e H e diferentes taxas evolutivas previamente reportadas, e comparamos a ocorrência de mutações sinônimas e não-sinônimas em ramos da filogenia classificados como “antigos” ou “recentes” a fim de inferir a atuação da seleção purificadora ao longo do tempo. Para caracterização do HBV presente nas populações Nativas Americanas, detecção e amplificação do DNA viral foi obtida através de PCR seguido de sequenciamento e análise filogenética. Análise Bayesiana de Skyline Plot foi realizada para comparar a dinâmica populacional do subgenótipo A1 presente na amostra de Nativos Americanos e em outras cepas isoladas no Brasil. Resultados e conclusão: Nossos resultados mostram que as estimativas de datação molecular são fortemente influenciadas pelas taxas evolutivas utilizadas na análise. Além disso, foi observado excesso de mutações não-sinônimas nos ramos recentes da filogenia, o que é compatível com a ocorrência de seleção purificadora, e pode gerar um viés sobre as estimativas, produzindo datações recentes demais. Na amostra de Nativos Americanos, nós constatamos o predomínio do subgenótipo A1, relacionado com populações africanas. Análise de Skyline Plot mostrou que a expansão populacional nas cepas isoladas de Nativos Americanos é mais recente que aquela inferida para outras cepas brasileiras, sugerindo que os processos históricos que contribuíram para a formação do subgenótipo A1 dos Nativos Americanos são relacionados com ondas migratórias mais recentes em direção à região amazônica.
Introduction: Hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic DNA virus that presents a partially double-stranded circular genome. Based on sequence divergence of the complete genome, ten HBV evolutionary lineages, called “genotypes” have been described (A-J), with F and H being considered as indigenous from the Americas. HBV genotypes present a remarkable geographic structure which may reflect historic patterns of human migrations. In South America, areas of high endemism include the Amazon basin, and high prevalence rates have been observed in Native American populations. Although the strong geographical structure indicates an ancient origin, most analysis trying to date the origin of the “American” genotypes F and H result in extremely recent dates that disagree with historical events related with HBV. Objective: The aims of this study comprise evaluate the impact of different evolutionary rates and of the purifying selection on molecular dating estimates in order to infer which rates are in better agreement with the origin of HBV in the Americas; to characterize the HBV circulating in a historical sample of Native Americans, and discussing the historical processes that might be relevant to understand the observed patterns. Materials and Methods: We performed a Bayesian analysis using the available sequences of F and H genotypes and different evolutionary rates previously reported, and compared the occurrence of synonymous and non-synonymous mutations in branches of phylogeny classified as “old” or “young” in order to infer the effects of purifying selection over time. For the characterization of HBV from Native American populations, detection and amplification of viral DNA were obtained through PCR followed by sequencing and phylogenetic analysis. Bayesian Skyline Plot analysis was performed to compare the population dynamics of the A1 subgenotype present in the sample of Native American and in other strains isolated from Brazil. Results and Conclusion: Our results show that molecular dating estimates are strongly influenced by the evolutionary rate assumed in the analysis. In addition, we observed an excess of non-synonymous mutations in recent branches of phylogeny, which is compatible with the occurrence of purifying selection and may create a bias on the estimates, producing too recent datings. In the sample of Native Americans, we observed a predominance of the A1 subgenotype, related with African populations. Skyline Plot analysis showed that population expansion in strains isolated from Native Americans is more recent than that inferred from other Brazilian strains, suggesting that the historical processes that contributed to the presence of A1 subgenotype A1 Native Americans are related with more recent migratory waves towards the Amazon region.

Orientador: Jorg Kobarg
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-04T15:19:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PatriciaRibeirode_D.pdf: 30024723 bytes, checksum: 2ccab093b151640dcfa12bf976450ad6 (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: A infecção crônica pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma das causas do desenvolvimento do câncer de fígado. O genoma do HBV codifica a onco-proteína HBx, uma proteína multi-funcional de 17 kDa que possui 10 resíduos de cisteína, e que está relacionada com a indução do câncer de fígado em camundongos transgênicos para HBx. Apesar de não ter uma função definida, sabe-se que a proteína HBx é um potente trans-ativador transcricional, ativando a transcrição de muitos promotores virais e celulares através de interações proteína-proteína, uma vez que HBx não interage diretamente com o DNA de fita dupla. Desta forma, HBx pode afetar a replicação e proliferação virais, e interferir nos processos celulares de apoptose e carcinogênese. Neste trabalho, a proteína HBx foi expressa em E. coli, em fusão com a proteína GST ou com a cauda de poli-histidina, e utilizada em ensaios funcionais e estruturais. Através de ensaios de retardamento da mobilidade eletroforética e UV cross-linking, observou-se que a proteína HBx possui uma afinidade maior pelos oligonucleotídeos de RNA ricos em bases "A", "V" e "AV", com tamanho superior a 21-mer, e que os resíduos de cisteína não interferiram na ligação da HBx com o oligonucleotídeo de RNA AV-38. A ausência dos resíduos de eisteína da proteína HBx também não interferiu na ativação do promotor alvo para a proteína p53, em sistema de mono-híbrido em levedura, nem tampouco na interação in vitro da HBx com a proteína humana p53, o que foi confirmado através de um ensaio de co-precipitação. Em cultura de células HeLa, a proteína HBx causou um aumento do crescimento celular e uma leve uma estabilização dos mRNAs dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, como mostraram os ensaios de cinética de degradação de mRNAs, e esta estabilização poderia contribuir para o fenótipo transformador da onco-proteína HBx. Os experimentos de dicroísmo circular e de fluorescência mostraram que a proteína HBx encontrava-se parcialmente estruturada em solução aquosa, mas apresentou uma tendência à estruturação sob determinadas condições experimentais, o que poderia ser uma conseqüência de uma provável flexibilidade conformacional inerente à proteína HBx. Vma estrutura flexível poderia explicar as interações observadas entre a HBx e uma variedade de proteínas celulares e ácidos nucléicos de fita simples, de modo que a proteína HBx poderia interferir nos processos de sinalização, transcrição, apoptose e nos mecanismos de reparo de DNA, que levariam ao desenvolvimento do câncer de fígado
Abstract: Chronic infection of the hepatitis B virus (HBV) is one of the causes leading to liver cancer. The HBV genome encodes the 17 kDa onco-protein HBx, a multi-functional protein that contains 10 cysteine residues and is related to induce liver cancer in transgenic mice. The exact function of HBx is still unknown. However, it has been shown that HBx is a potent trans-activator, which activates transcription of many cellular and viral promoters indirecdy through protein-protein interactions, although it does not bind to double-stranded DNA direcdy. Besides, the HBx protein can affect viral replication and proliferation, and it interferes with cellular apoptosis and carcinogenesis. In this work, the recombinant HBx protein was expressed in E. coli as a GST or 6xHis fusion protein, and used in functional and structural assays. By Electrophoretic Mobility Shift Assay and UV cross-linking assays, it was observed that the HBx protein was able to bind to the "A", "V" and "AV" rich RNA oligonucleotides, and that the cysteine residues of the HBx protein were not required for its binding to the AV-rich RNA oligonucleotide (AV-38). The lack of cysteine residues in the HBx protein did not interfere with the pS3 promoter activation in the yeast one-hybrid system, or neither in the in vitro interaction through a co-precipitation assay of the HBx and human p53 protein. In HeLa cells, the HBx protein increased the cellular growth and caused a slight c-fos and c-myc mRNA stabilization. This mRNA stabilization could contribute for the transforming character of the onco-protein HBx. Both the circular dichroism and fluorescence spectroscopic assays had shown that the HBx protein was partially structured in aqueous solution, but the protein presented a propensity to gain secondary structure under specific experimental conditions. The HBx inherent conformational flexibility might explain its interaction with a wide array of cellular proteins and single-stranded nucleic acids, in a way that the HBx protein interferes with signaling cellular processes, modulates transcription, apoptosis and DNA repair, and contributes to the development of the liver cancer
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

La sequence activatrice ou enhancer du virus de l'hepatite b du canard possede 6 domaines de liaison pour des facteurs transcriptionnels hepatospecifiques: un site pour les facteurs c/ebp et hnf1 ; un site ayant une sequence proche de celui reconnu par efc/rfx1, et 3 sites pour le facteur hnf3. L'etude de l'activite transcriptionnelle de ces facteurs dans la lignee cellulaire hepatocytaire hepg2, montre que la proteine hnf1 est essentielle pour l'activite du enhancer, mais ces differents facteurs cooperent entre eux. Les proteines hnf1 et hnf3 se fixent sur des sites proches l'un de l'autre ; toutefois, dans un modele in vitro, la proteine hnf1 s'avere capable d'inhiber la fixation de la proteine hnf3 mais l'inverse n'est pas observe

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Myuki Alfaia Esashika Crispim.pdf: 2246402 bytes, checksum: d9773c605258310c1244020f1e5cb467 (MD5) Previous issue date: 2007-09-20
Hepatitis B and D are endemic in the Western Brazilian Amazon region , but few studies have been conducted to investigate the genetic variability of both viruses. The hepatitis B virus (HBV) has a high genetic variability, with eight different genotypes defined (A-H). In present classification hepatitis D virus (HDV) is also supposed to present eight different genotypes (I-VIII). The aim of this study was to describe the genotypes of the virus B and D of the Western Brazilian Amazon region. We selected 190 samples of chronic carriers with HBV and 50 of them presented double infection with HDV. The serum samples of HBV were submitted to the genotyping through Polymerase Chain Reaction (PCR), with type-specific primers . In the reactive samples for HDV RNA by RT-PCR was used the genotyping by Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). The genotype A of HBV was detected as the most frequent, in 91 participants (56,5%), following by genotype F, in 41 (25,5%), and genotype D, in 29 (18,0%). In the HDV genotyping, we found only the genotype III. This study showed that the genotypes A, D and F of VHB and the genotype III of HDV represented the predominant genotypes in the Western Brazilian Amazon.
As hepatites B e D são endêmicas na Amazônia Ocidental Brasileira, mas poucos estudos têm buscado investigar a variabilidade genética de ambos os vírus. O vírus da Hepatite B (VHB) tem uma alta variabilidade genética, sendo definidos oito genótipos distintos (A-H). O vírus da hepatite D (VHD), na atual classificação, também é sugerido apresentar oito genótipos (I-VIII). O presente estudo teve o objetivo de descrever os genótipos do vírus B e D na Amazônia Ocidental Brasileira. Selecionamos 190 amostras de portadores crônicos do vírus da hepatite B, sendo que, destas, 50 apresentavam infecção dupla com o VHD. As amostras de soro do VHB foram submetidas a genotipagem por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com iniciadores tipo específicos. Em amostras reativas para o VHD RNA por RT-PCR foi realizada a genotipagem por Análise do Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos de Restrição (RFLP). Foi detectado o genótipo A como o mais freqüente em 91 participantes (56,5%), seguido pelo F em 41(25,5%), e o D em 29 (18,0%). Na genotipagem para o VHD encontramos somente o genótipo III. Este estudo mostrou que os genótipos A, D e F do VHB e o genótipo III do VHD, representam os genótipos predominantes na Amazônia Ocidental Brasileira.

Au cours de la derniere decennie deux facteurs principaux ont ete impliques dans l'etiopathogenie du cancer hepatocellulaire (chc) chez l'homme: le virus de l'hepatite b (vhb) et un carcinogene chimique l'aflatoxine b1 (afb1). Nous avons utilise le canard infecte par le virus de l'hepatite b du canard (dhbv), tres proche du vhb, pour etudier le mecanisme de l'oncogenese hepatique. Apres avoir demontre la presence du dhbv dans les populations des canards domestiques francais et de canards sauvages colvert, nous avons isole differentes souches de ce virus, compare leurs proprietes biologiques et recherche leur eventuel pouvoir oncogene. En administrant l'afb1 pendant deux ans a des canards, infectes ou non par dhbv, nous avons reussi a induire des chc dans ces deux groupes et montrer un effet synergique de l'afb1 et de l'infection virale dans l'oncogenese hepatique chez le canard. D'autre part, nous avons utilise le modele du canard pour l'etude du role de proteines pre-s, composantes d'enveloppe virale, dans la replication du dhbv. En transfectant in vivo les canetons avec l'adn du dhbv mute au niveau de la region pre-s, nous avons demontre que ce virus peut se repliquer en depit de deletions ou insertions portant sur un total de neuf aminoacides introduits dans la partie c terminale de la proteine pre-s. A l'aide d'anticorps monoclonaux murins, nous avons identifie et localise au niveau des proteines pre-s, un epitope neutralisant conserve chez les differentes souches du virus dhbv et localise a la surface du virus

L'objectif de ce travail a ete d'etudier les interactions entre deux facteurs majeurs de risque du carcinome hepatocellulaire (chc) chez l'homme : l'infection chronique par le virus de l'hepatite b (vhb) et l'exposition a l'aflatoxine b#1(afb#1). Cette etude a ete realisee a l'aide du modele du canard de pekin infecte par le vhb du canard (dhbv) tres proche du virus humain. Dans un premier temps, nous avons etudie l'etiologie du chc chez le canard en milieu naturel grace a des collections de foies de canard provenant de chine et d'inde. Ces etudes nous ont permis de mettre en evidence le role majeur de l'afb#1 dans l'apparition de chc chez le canard. Parallelement, nous avons etudie les interactions l'afb#1-dhbv en administrant de l'afb#1 a des animaux chroniquement infectes. Nous avons demontre, pour la premiere fois, que l'exposition a l'afb#1 induit une augmentation significative de la replication virale in vivo, associee a une forte accumulation hepatocytaire de la grande proteine d'enveloppe virale ainsi qu'a une pathologie hepatique severe (proliferation de cellules biliaires et necrose). Cette augmentation de la replication du dhbv suite a l'exposition a l'afb#1 a ete egalement confirmee in vitro en culture primaire d'hepatocytes de canard. Reciproquement, nous avons demontre, dans ce modele, que la replication virale peut augmenter le metabolisme hepatique de l'afb#1. Nous avons egalement etudie l'impact de l'afb#1 et du dhbv sur les modifications du stress oxydant par l'estimation : - des activites des enzymes de defenses contre ce stress ; - du taux d'adduits 8-ohdg sur l'adn. Nos resultats ont montre que l'exposition a l'afb#1 induit une augmentation de l'activite d'une de ces enzymes, la superoxyde dismutase. En conclusion, notre etude a montre des interactions entre l'afb#1 et le dhbv qui se traduisent par des modifications de la replication virale et du metabolisme cellulaire.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T13:42:36Z No. of bitstreams: 1 Maria Isabel Magalhães Santos Perfil das....pdf: 1133942 bytes, checksum: bcc264f7cc24ec022846c05825fd31cf (MD5)
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Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Introdução: A doença causada pelo vírus da hepatite B (HBV) é um problema de saúde pública mundial. No Brasil, o sistema único de saúde (SUS) tem disponibilizado drogas antivirais para o tratamento de hepatite B crônica há mais de 10 anos, mas um sistema para o monitoramento e avaliação de resistência a estas drogas ainda não está disponível. Objetivo: Este estudo teve como objetivo determinar o perfil de mutações do HBV associadas com a resistência aos análogos de nucleos(t)ídeos entre 81 pacientes com infecção crônica pelo HBV: virgens de tratamento para hepatite B e tratados com diferentes análogos de nucleosídeos e nucleotídeos, no Hospital Professor Edgar Santos (HUPES-UFBA)- Salvador-BA. Metodologia: O HBV-DNA foi isolado de amostras de soro, amplificado por nested-PCR, utilizando-se primers deduzidos da região flaqueadora da domínio rt do gene P e sequenciados (ABI Prism 3730, Applied Biosystems, EUA). Duas a seis sequências de cada isolado foram alinhados e os sítios conflitantes foram resolvidos usando o software CLC Main Workbench v. 5.0 por inspeção visual dos eletroferogramas. As sequências consenso tinham um tamanho de 1032 pb (compreendendo os aminoácido 1-344 da rt). Estas sequências foram submetidas ao banco de dados HBVrt DB (Stanford University, EUA) para a análise de cada mutação de acordo com o genótipo e tratamento. Resultado: O genótipo A1 foi o mais prevalente (85,2%) seguido pelo genótipo A2 (4,9%) F (6,2%) e C1, D2 e D4 (1,2% cada). Seis pacientes (7 %) apresentaram mutações de resistência para LAM, ETV, TDF: dois com o padrão L180M + M204V e quatro com padrões diversos (L80I + L180M + M204I ;L80V + L180M + M204V; M204I; A194T). Todas estas mutações foram associadas ao genótipo A (quatro A1 e dois A2). Além disso, foi encontrado um paciente com HBV genótipo C típico do leste da Ásia. Destes pacientes, dois foram virgens de tratamento e quatro tinham histórico de tratamento para HIV ou HBV. Foram detectadas quatro mutações no gene S (três casos com a mutação sI195M e um a mutação sW196L) associadas às mutações do domínio rt do gene P, correspondendo à uma taxa de 6% de mutações de escape vacinal. A prevalência das mutações de resistência às drogas antivirais variou de acordo com a duração do tratamento e com o nível da barreira genética da droga utilizada. Neste estudo, foi encontrada uma forte associação entre a ocorrência de mutações de resistência do HBV e positividade para o AgHBe, co-infecção com o HIV e histórico de tratamento para HBV e/ou HIV. Conclusão: Antes da terapia ser iniciada é extremamente importante o monitoramento da carga viral e a identificação destas mutações para suportar decisões clinicas sobre o manejo dos pacientes e prevenir a emergência de vírus multi- resistentes.
Introduction: Hepatitis B virus (HBV) infection is a public health issue. The Brazilian public health system (SUS) has provided antiviral drugs for chronic hepatitis B treatment for over 10 years, but a system for monitoring for drug-related resistance mutations is not available. Objective: This study aims to determine the presence of HBV mutations associated with resistance to nucleos(t)ide analogs among 81 patients with chronic HBV infection-naïve and treated from University Hospital Professor Edgard Santos, Salvador-BA (HUPES-UFBA). Methods: Briefly, HBV-DNA was PCR amplified with primers deduced from the flanking of the rt domain at the HBV P gene and sequenced using ABI Prism 3730 (Applied Biosystems, USA). From two to six forward and reverse sequences of each isolate were assembled and conflicting sites were resolved using software CLC Main Workbench v. 5.0 by visual inspection of the electropherograms. Consensus sequence extended 1032 bp and encompassed the entire rt domain (from amino acid 1 to 344). Those sequences were submitted to the HBV drug resistance database (HBVrt DB, Stanford University, USA) to retrieve each mutation according to genotype and treatment. Results: HBV genotype A1 (85.2%) was the most prevalent followed by genotype A2 (4.9%), F (6.2%), and C1, D2 and D4 (1.2% each). Six patients (7%) exhibited resistance mutations to LAM, ETV and TDF: two with patterns L180M + M204V and four with other different patterns: L80I + L180M + M204I; L80V + L180M + M204V; M204I; A194T. All of these mutations were present in patients with genotype A (four A1 and two A2). Furthermore, this study found one patient with genotype C, common in East Asian. Of these patients, two were naïve and four had a history of treatment for HIV or HBV. In addition, four mutations in gene S (sI195M three cases with the mutation and one with the mutations W196L) associated with mutations in the rt domain of the P gene were detected, corresponding to a rate of 6% of vaccine escape mutations. Prevalence of drug-related resistance mutations varied according to treatment duration and the level of genetic barrier for the drugs used. Conclusion: In this study a strong association was found between the occurrence of HBV resistance mutations and HBeAg positivity, co-infection with HIV and a history of treatment for HBV and / or HIV. Once the drug therapy is initiated it is extremely important to monitor viral load and identify those mutations in order to support clinical decisions about patient management and also to prevent the emergence of multidrug-resistant viruses.

L'efficacité des thérapies actuelles étant insuffisante, l'infection chronique par le Virus de l'Hépatite B (VHB) est la cause majeure mondiale de décès par atteintes hépatiques. Il apparaît que la combinaison de molécules antivirales à des approches immunothérapeutiques, comme les vaccins à ADN, sont des thérapies prometteuses contre l'infection chronique par le VHB. L'objectif de ce travail était d'utiliser le modèle du VHB du canard (DHBV), virus apparenté au VHB, pour tester l'efficacité de thérapies associant des analogues de nucléoside (adéfovir, ADV ou lamivudine, 3TC) à des vaccins à ADN codant pour les protéines virales structurales. Tout d'abord, chez des animaux chroniquement infectés, nous avons évalué l'efficacité d'une bithérapie associant un traitement par l'ADV au vaccin par ADN codant pour la grande protéine d'enveloppe du DHBV (pCI-preS/S). Nous avons démontré une tendance à un effet additif de l'ADV et de pCI-preS/S où une inhibition de 51% de la réplication intrahépatique a été observée pour la bithérapie contre 14% et 38% pour les monothérapies respectives. Ensuite, chez des animaux non infectés, nous avons caractérisé la réponse humorale induite par un vaccin codant pour la protéine de la capside du DHBV (pCI-C) et analysé la spécificité de ces anticorps à ceux présents lors d'une infection chronique. Ainsi, nous avons démontré que ce vaccin à ADN est capable d'induire de puissantes réponses humorales spécifiques. De plus, nous avons identifié les régions antigéniques majeures de la protéine de la capside du DHBV reconnues à la fois par ces anticorps induits et par ceux présents lors d'une infection chronique. Enfin, nous avons étudié l'efficacité à induire une élimination virale complète, d'une bithérapie associant l'administration de 3TC aux deux vaccins pCI-preS/S et pCI-C. A la fin de la thérapie, l'analyse du taux d'ADN virale intrahépatique par PCR en temps réel montre que 23% des animaux qui ont reçu la thérapie par ADN, associée ou non à l'administration de 3TC, ont complètement éliminé l'infection virale. Ainsi, la thérapie associant les vaccins à ADN codant pour les protéines structurales du VHB apparaît intéressante contre les infections chroniques par le VHB.

Bien qu'il existe un vaccin efficace contre le virus de l'hepatite b (vhb), le mecanisme de neutralisation et les etapes precoces du cycle viral impliquant les proteines d'enveloppe de ce virus sont encore peu elucides. De plus, des variants du vhb qui echappent a la neutralisation par les anticorps protecteurs et portant des mutations au niveau des proteines d'enveloppe ont ete isoles chez des personnes vaccinees. Cependant, la demonstration d'une relation de cause a effet entre l'apparition de mutations et un effet biologique observe n'a pas pu etre realisee, en raison de l'absence de lignees cellulaires susceptibles d'etre facilement infectees par le vhb et de l'etroite specificite d'hote de ce virus. Afin de contourner ces difficultes nous avons utilise comme modele le virus de l'hepatite b du canard (dhbv), hepadnavirus tres proche du vhb par son organisation genetique et son mode de replication. Ce modele permet de mener des etudes in vivo chez son hote naturel le canard de pekin et in vitro sur des hepatocytes en culture primaire. L'objectif de ce travail a ete d'etudier l'implication des proteines d'enveloppe du dhbv dans l'initiation de l'infection et le mecanisme de neutralisation de ce virus. Afin de selectionner des variants du dhbv echappant a la neutralisation nous avons utilise un anticorps monoclonal (mab 900) hautement neutralisant qui reconnait la sequence 83ipqpqwtp90 au sein de la region pre-s de la grande proteine d'enveloppe (l) du virus. Nous avons ainsi pu selectionner des variants portant des mutations ponctuelles qui affectent deux residus proline distants, un localise en position 90 au sein de l'epitope et l'autre en position 5. La caracterisation des proprietes biologiques des variants pre-s identifies a montre que le remplacement des prolines 5 et 90 affecte de facon drastique la neutralisation par l'anticorps 900 sans modifier le pouvoir infectieux du virus. Afin de mieux definir le role de l'epitope 83-90 dans l'interaction du virus avec l'hepatocyte, nous avons genere une serie de mutants du dhbv qui portent une, deux ou trois substitutions au niveau du motif 88wtp90. Nous avons montre que les mutations introduites ne modifient ni la replication virale, ni l'etat de phosphorylation de la proteine l. Par contre, nous avons pu mettre en evidence que chacun des trois residus w, t, et p est essentiel a la neutralisation par le mab 900. De plus, la modification de deux ou trois de ces acides amines abolit le pouvoir infectieux du virus in vitro et in vivo. Ces resultats demontrent l'implication des residus 88-90 dans la neutralisation du dhbv et l'initiation de l'infection. Enfin, nous avons utilise le gene codant pour les proteines d'enveloppe du virus afin de mettre au point un protocole d'immunisation par adn nu. Nos resultats montrent que cette nouvelle strategie vaccinale stimule efficacement la reponse humorale dirigee contre la proteine l du dhbv : les anticorps induits sont neutralisants in vitro et protegent les animaux contre l'infection virale.

Com o objetivo de avaliar as características operacionais da quantificação do RNA do vírus da hepatite C (VHC) pelo método do DNA ramificado (bDNA) e correlacionar a taxa de viremia com aspectos demográficos, laboratoriais e histopatológicos da doença hepática crônica C, foram estudados prospectivamente, no período de julho de 1991 à julho de 1992, 1 07 pacientes provenientes do ambulatório do Serviço de Hepatologia da Universidade de Miami, Flórida, E.U.A.. Todos apresentavam elevação das aminotransferases por mais de seis meses, anticorpos anti-VHC positivos por ELISA 11 e RIBA 11, RNA do VHC positivo por reação em cadeia da polimerase pós-transcriptase reversa (RT-PCR) e diagnóstico histopatológíco de hepatite crônica ou cirrose. Quanto ao sexo, 68 dos 107 (63,6%) pacientes eram homens e 39 (36,4%) eram mulheres. A idade variou entre 29 e 84 anos (média de 46,2 +/- 12,6 anos). Com relação à cor, 93 dos 107 (86,9%) pacientes eram brancos, 13 (12,1%) eram pretos e 1 (0,9%) amarelo. Como controles, foram selecionados 41 indivíduos com anticorpos anti-VHC negativos por ELISA li e RIBA 11 e negativos para oRNA do VHC por RT-PCR, compreendendo 11 pacientes avaliados ambulatorialmente no mesmo período (6 com cirrose biliar primária e 5 com hepatite crônica B), além de 30 voluntários saudáveis. Do total de 107 pacientes positivos para o RNA do VHC por RT-PCR, o teste bONA foi positivo em 88 (sensibilidade de 82,2%), sendo negativo em todos os controles (especificidade de 1 00% ). A concordância observada entre ambos os testes foi de 87,2%, com índice "kappa" de 0,74. A correlação entre os aspectos demográficos e o grau de atividade histopatológica mostrou que os pacientes com cirrose (CIR) possuíam idade média significativamente superior aqueles diagnosticados como hepatite crônica ativa (HCA) (52,4 +/- 14,3 versus 46,8 +/- 12,3 anos; p<0,02) ou hepatite crônica persistente (HCP) (52,4 +/- 14,3 versus 40,8 +/- 8,9 anos; p<0,0002). A m.édia da aminotransferase do aspartato (AST) mostrou-se significativamente superior no grupo CIR quando comparado aos grupos HCA (139,5 +/- 81,4 versus 96,4 +/- 40,2 UI/I; p<0,009) e HCP (139,5 +/- 81,4 versus 87,5 +/- 40,2 UI/I; p<0,009). A quantificação do RNA do VHC por bDNA não apresentou relação com os aspectos demográficos e laboratoriais dos pacientes com doença hepática crônica C. Porém, com relação a atividade histopatológica, observou-se que os indivíduos do grupo HCA apresentaram taxa média de viremia significativamente superior aos grupos HCP (16.908.490 +/- 13.654.660 versus 3.796.030 +/- 8.075.090 eq RNA-VHC/ml; p