Academic literature on the topic 'Vitro coltura'

Histone acetylation/deacetylation are pivotal epigenetic mechanisms responsible for regulating chromatin structure and DNA transcription, respectively leading to a higher o a lesser degree of accessibility to transcription factors and RNA polymerase, i.e. turning on/off genetic expression. It has been described that histone deacetylase inhibitors (HDAIs) can influence hepatic DNA expression and tumor cell lines differentiation but few data about their effects on hepatocytes are available. Freshly isolated Sprague-Dawley rat hepatocytes seeded on matrigel were cultured in control medium or in medium containing one of the following HDAIs: sodium butyrate (NaBu, 500 nM), valproic acid (VPA, 2 mM) or tricostatin A (TSA, 10 mM). After 4 days, cell viability and function were tested by albumin secretion (sandwich ELISA, normalizing the data with the protein content assayed by the Bradford’s method with Comassie Blue), albumin expression (RT-PCR analysis), urea synthesis after ammonia challenge (colorimetric method), cytotoxicity (LDH release measurement) and cell proliferation (BrDU incorporation). Albumin secretion doubled after hepatocyte exposure to NaBu in comparison to controls (92.35 ±18.97 ?g/mg protein vs 44.36 ±7.81 ?g/mg protein; p=0.02) while it was inhibited by VPA (25.09 ± 3.02 vs 44.36 ±7.81 ?g/mg protein; p=0.03) and unaffected by TSA (46.9 ± 9.12 ?g/mg protein vs 44.36 ±7.81 ?g/mg protein; p=0.83). A similar behaviour was observed at RT-PCR analysis of albumin expression (data are relative values compared to controls which are by default 1; VPA: 2.2; NaBu: 12.6; TSA: 1.8). Urea metabolism was preserved in all conditions (controls: 25.47 ± 4.06 ?g/mg protein/h; VPA: 23.45± 4.87 ?g/mg protein/h, p=0.75; NaBu: 30.53 ± 6.98 ?g/mg protein/h, p=0.54; TSA: 25.89 ± 5.97 ?g/mg protein/h, p=0.95). Cells were significantly less viable when exposed to NaBu (54.26 %, p<0.001) or VPA (40.12 %, p=0.0097) than controls (70.74%) while TSA was less cytotoxic (67.85 %, p=0.56). Hepatocyte proliferation was increased with VPA (19.82 ± 3.19 BrDU-positive cells/mm2) and decreased with NaBu (2.05 ± 0.84 BrDU-positive cells/mm2) when compared to controls (5.88 ± 0.70 BrDU-positive cells/mm2). NABU appears to be a differentiating agent on cultured hepatocyte, being able to stimulate albumin expression and production. Urea synthesis was however unaffected. NaBu appears to be less hepatotoxic than VPA, which provides a good proliferative stimulus. TSA played a quasi neutral role. These results suggest a possible use of HDAIs to improve hepatic specific functions in bioartificial liver devices.
L’acetilazione e la deacetilazione del DNA sono meccanismi epigenetici cruciali responsabili della regolazione della struttura della cromatina e della trascrizione del DNA, che consentono una maggiore o minore accessibilità ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi, inducendo o inibendo rispettivamente l’espressione genica. In letteratura è descritto che gli inibitori della deacetilazione degli istoni (HDACIs = histone deacetylase inhibitors) possono influenzare il DNA inducendo la traduzione di geni tipicamente espressi nelle cellule del fegato ed il differenziamento di linee cellulari tumorali verso il pattern epatico, tuttavia sono ancora pochi i dati disponibili sui loro specifici effetti sugli epatociti. Epatociti di ratto Sprague-Dawley appena isolati sono stati seminati su piastre con substrato di matrigel e coltivati con medium di controllo o con medium contenente uno dei seguenti HDACIs: il sodio butirrato (NaBu, 500 nM), l’acido valproico (VPA, 2 mM) e la tricostatina A (TSA, 10 mM). Dopo 4 giorni sono stati determinati i seguenti parametri: la funzionalità del metabolismo epatico tramite l’analisi della secrezione di albumina (sandwich ELISA, normalizzando i dati per il contenuto proteico misurato con il metodo di Bradford tramite il Blu di Comassie), l’analisi dell’espressione genica di albumina (analisi di Real Time PCR, RT-PCR), la quantificazione della sintesi di urea (realizzata mediante metodo colorimetrico con il carico di ammoniaca), la stima della citotossicità (quantificazione del rilascio di latticodeidrogenasi [LDH] mediante spettrofotometria) e della proliferazione cellulare (incorporazione di bromodesossiuridina [BrDU] mediante microscopia a fluorescenza). La secrezione di albumina è risultata raddoppiata dopo l’esposizione degli epatociti al NaBu rispetto ai controlli (92.35 ± 18.97 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.02), mentre è stata inibita dal VPA (25.09 ± 3.02 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.03) e non è influenzata dal TSA (46.9 ± 9.12 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.83). L’analisi dell’espressione di albumina tramite RT-PCR conferma tali risultati (i dati sono espressi come valori relativi rispetto ai controlli i quali per convenzione hanno valore 1; VPA = 2.2; NaBu = 2.6; TSA = 1.8). Il metabolismo dell’urea è risultato inalterato (controlli = 25.47 ± 4.06 ?g/mg proteine/ora; VPA = 23.45 ± 4.87 ?g/mg proteine/ora, p = 0.75; NaBu = 30.53 ± 6.98 ?g/mg proteine/ora, p = 0.54; TSA = 25.89 ± 5.97 ?g/mg proteine/ora, p = 0.95). Le cellule sono risultate significativamente meno vitali se esposte al NaBu (54.26 %, p <0.001) ed al VPA (40.12 %, p = 0.0097) rispetto ai controlli (70.74%), mentre il TSA si è dimostrato meno citotossico (67.85 %, p = 0.56). La proliferazione degli epatociti è risultata incrementata nell’esposizione al VPA (19.82 ± 3.19 cellule BrDU-positive/mm2, p <0.01) mentre è diminuita con il NaBu (2.05 ± 0.84 cellule BrDU-positive/mm2) rispetto ai controlli (5.88 ± 0.70 cellule BrDU-positive/mm2, p <0.01). Il NaBu sembra quindi essere un agente di differenziazione per gli epatociti in grado di stimolare l’espressione genica dell’albumina e la sua secrezione. Tuttavia la sintesi di urea sembra non esserne influenzata. Il NaBu è risultato meno epatotossico del VPA, il quale costituisce peraltro un buono stimolo proliferativo. Il TSA gioca un ruolo quasi neutro ai dosaggi testati. Questi risultati suggeriscono di approfondire un possibile utilizzo degli HDACIs per incrementare le funzioni tipiche degli epatociti non solo in vitro ma anche nei dispositivi per il fegato bioartificiale.

The purpose of this PhD project is the development of in-vitro culture models to study different aspects of Osteoarthritis (OA), an entire joint degenerative disease that involved articular cartilage, synovium and subchondral bone. The global incidence of knee OA is 203 per 10,000 person-year that grows with the increase of age, reaching a peak between 70-79 years old, thus dragging the peak of prevalence in old age. The main OA disabling symptom is pain that is typically intermittent and weight-bearing (mechanical) and can lead to psychological stress. Contrary to the common description of a wear-related pathology, OA is the consequence of an active and unbalanced process of repair and destruction. The actual causes of OA are still unidentified and there is still debating on the precise order of events that trigger its onset. There is currently no predetermined in-vitro model of OA disease. This is essentially due to the defective knowledge on the onset of this pathology and to the numerous tissue modifications involved that make difficult to in-vitro reproduce OA. A clear comprehension of the various mechanisms engaged in the pathology is necessary to understand its progression, as well as the targets to restore joint function. Here, two different in-vitro culture models to study different aspects of OA were applied to investigate: (i) the involvement of adult stem/stromal cells of the synovial membrane in bone remodeling, through an indirect 2D co-culture approach and (ii) the crosstalk between chondrocytes and subchondral bone in normal and pathological condition, developing an engineered 3D scaffold and simulating an inflamed microenvironment. These two models allowed the investigation of the cell behaviours from the three tissues involved in the pathogenesis of OA, and the development of a possible in-vitro platform for future studies encompassing the three components simultaneously.
Lo scopo di questo progetto di dottorato è lo sviluppo di modelli di coltura in-vitro per studiare diversi aspetti dell'osteoartrosi (OA), una malattia degenerativa che coinvolge tutti i tessuti dell’articolazione tra cui la cartilagine articolare, la membrana sinoviale e l'osso subcondrale. L'incidenza globale dell'OA del ginocchio è di 203 per 10.000 persone all’anno e cresce con l'aumentare dell'età, raggiungendo un picco tra i 70-79 anni. Il principale sintomo disabilitante dell'OA è il dolore, tipicamente intermittente e portante (meccanico) che può, in alcuni casi, a stress psicologico. Contrariamente alla comune descrizione di una patologia correlata all'usura, l'OA è la conseguenza di un processo attivo e sbilanciato di riparazione e distruzione. Le cause che portano all’insorgenza di tale patologia non sono ancora state del tutto identificate e si dibatte ancora sull'ordine preciso degli eventi coinvolti nella sua progressione. Attualmente, la scarsa conoscenza della patogenesi dell’OA e le numerose modificazioni tissutali che la caratterizzano hanno reso complicato lo sviluppo di un modello in-vitro. È quindi necessario comprendere i meccanismi coinvolti nella progressione della patologia, nonché i target di nuovi trattamenti per il ripristino della funzionalità articolare. Qui, due diversi modelli di coltura in-vitro per indagare diversi aspetti dell'OA: (i) il coinvolgimento di cellule staminali / stromali adulte della membrana sinoviale nel rimodellamento osseo, attraverso un approccio di co-coltura 2D indiretta e (ii) il crosstalk tra condrociti e osso subcondrale in condizioni normali e patologiche, sviluppando uno scaffold 3D ingegnerizzato e simulando un microambiente infiammato. Questi due modelli hanno permesso lo studio dei comportamenti cellulari di tre tessuti coinvolti nella patogenesi dell'OA e lo sviluppo di una possibile piattaforma in-vitro per futuri studi che potranno comprendere simultaneamente queste tre componenti.

Somaclones both selected and not selected for tolerance to the triazine herbicide atrazine were used to compare tissue culture-induced variability in the presence or absence of stress. Two types of repeated sequences (rDNA and a randomly cloned, anonymous sequence) were analysed both qualitatively and quantitatively, and overall genome variation was assessed by RAPDs. Multiplicity differences were found for the two sequences both between the tolerant and susceptible group and within each group with respect to leaf DNA, but no qualitative differences were detected with either RFLPs orRAPDs. Moreover, we investigated whether stress-induced variation in the atrazine target gene, the chloroplast psbA gene, was responsible for herbicide tolerance by analysing two possible resistance mechanisms: the presence of a specfic point mutation in the gene and its amplification and/or increased expression. Some somaclones were shown to be a mosaic for psbA gene mutation, but the number of cells or plastid genomes involved seemed too low to account for tolerance in the whole tissue. Atrazine tolerance could then be due to an increase in the number of plastids/plastid genomes or/and to a permanent response to respiration inhibition whose basis is, up to now, unknown.

L’ osteoartrite (OA) è la più comune tra le patologie degenerative che colpiscono le articolazioni, rappresentando da sola il 70% del totale. Proprio per la sua diffusione nella popolazione, per la sua natura degenerativa e per l’attuale mancanza di terapie in grado di arrestarne la progressione, l’OA costituisce un notevole fardello per la salute pubblica. L’OA è un insieme eterogeneo di condizioni che conducono al progressivo assottigliamento della cartilagine articolare fino alla sua totale perdita, all’ipertrofia del sottostante tessuto osseo con formazione di osteofiti e sclerosi ossea e all’ispessimento della capsula articolare. Momentaneamente gli unici farmaci impiegati nel trattamento dell’osteoartrite sono: paracetamolo (farmaco d’elezione), farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), cortisonici, inibitori selettivi della cicloossigenasi di tipo II (COXIB), farmaci questi ad azione antinfiammatoria e analgesica, volti quindi solo al trattamento della sintomatologia; tra le altre terapie invece rientrano: il trattamento infiltrativo intrarticolare con sostanze atte a migliorare la lubrificazione articolare (es. acido ialuronico), le terapie fisiche e riabilitative spesso effettuate in ambiente termale ed i condroprotettori, composti orientati a modulare l’attività metabolica dei condrociti allo scopo di rallentare i processi degenerativi e di stimolare i processi di riparazione della cartilagine, che comprendono glucosammina solfato (GlcN), condroitin solfato, diacerina e acido ialuronico, classificati nell’insieme come Symptom Modifyng Drugs (SMDs). Il principale scopo di questo studio quindi è quello di analizzare l’efficacia del 2-(N-Acetil)-L-fenilalanilamido-2-deossi-β-D-glucosio (NAPA) e della GlcN nello stimolare la produzione di nuova matrice extracellulare, in condrociti primari umani; inoltre quello di identificare quale sia la minima quantità, delle due molecole, capace di modulare i pathways anabolici condrocitari. Gli studi sono stati condotti incubando i condrociti primari umani con diverse quantità delle due molecole sia in condizioni di crescita in monostrato (2D) che in tridimensione (3D); questo ha permesso di capire che la coltura in tridimensione è molto più adatta per lo studio della sintesi di alcuni componenti della matrice extracellulare come il Glicosamminoglicano solfato (GAG) e l’Acido Ialuronico (HA), mentre la coltura in monostrato è adatta per valutare la modulazione genica. La sintesi dei componenti della matrice è sotto il controllo di fattori di crescita quali TGF-β (transforming growth factor), IGF-1 (insuline-like growth factor) ed OP-1 (osteogenic protein). E’ stata pertanto studiata la capacità di NAPA e GlcN di influenzare i livelli di produzione di IGF-1 ed OP-1, allo scopo di trovare una spiegazione per l’efficacia delle due molecole nello stimolare l’attività anabolica dei condrociti. I risultati ottenuti indicano che il NAPA e la GlcN influiscono sulla sintesi dei componenti della matrice extracellulare in maniera dose-dipendente; il NAPA si è mostrato efficace nell’aumentare la sintesi dei GAGs alla concentrazione di 1mM, mentre la GlcN mostra risultati apprezzabili a 5mM, anche se a questa concentrazione evidenzia un consistente effetto citotossico. Il NAPA inoltre è risultato molto più efficace della GlcN nell’indurre la produzione di collagene II, mentre la GlcN è maggiormente in grado di stimolare la produzione di acido ialuronico. Entrambe le molecole sono capaci di indurre la sintesi di IGF-1 ed OP-1 con differente efficacia. In conclusione quindi si può affermare che la GlcN e il suo N-peptidyl derivato sono in grado di aumentare la produzione dei componenti della matrice extracellulare a diverse concentrazioni e di interferire con pathway cellulari differenti, infatti, il NAPA è molto più efficace sul pathway di IGF-1, mentre la GlcN influenza maggiormente quello dell’OP-1. Il diverso effetto anabolico di NAPA e GlcN osservato, insieme all’individuazione delle loro concentrazioni ottimali potrebbero essere utili per formulare nuove strategie di riparazione della cartilagine.