Dissertations / Theses on the topic 'Voie Wnt canonique (Wnt/β-caténine)'

L'épithélium intestinal est un tissu en constant renouvellement, grâce à des cellules souches somatiques présentes dans les cryptes intestinales. Le renouvellement perpétuel et l’homéostasie de ce tissu sont assurés par plusieurs réseaux de signalisation. Il est maintenant admis que la dérégulation de ces mêmes voies est impliquée dans le processus d’initiation et/ou de progression tumorale. Mon laboratoire a décrit l'implication des hormones thyroïdiennes (HT) et de leur récepteur nucléaire TRα1 dans le contrôle de l'homéostasie intestinale, via la régulation de la voie Wnt, jouant un rôle clé dans la physiopathologie de ce tissu. Plus précisément, TRα1 active l’expression et la stabilisation de β-caténine via un mécanisme impliquant le facteur sFRP2. Au cours de ma thèse, j’ai participé, d’une part à l’étude de souris transgéniques surexprimant TRα1 dans l’épithélium intestinal et à l’analyse des mécanismes moléculaires de la régulation croisée entre TRα1 et la voie Wnt canonique dans l’induction des tumeurs intestinales. Nous avons donc démontré un rôle oncogénique de TRα1 dans l’épithélium intestinal. De plus, le mécanisme moléculaire et fonctionnel implique les deux effecteurs de la voie canonique, β-caténine et TCF4. D’autre part, j’ai analysé la fonction de sFRP2 dans la physiopathologie intestinale, et son action sur la voie Wnt. D’une manière intéressante, l’étude de la fonction de sFRP2 nous a permis de révéler son rôle original dans la différenciation des cytotypes épithéliaux. De plus, nous avons montré que sFRP2 est un modulateur positif des voies Wnt canonique et non canonique (JNK). Par ailleurs, l’absence d’expression de sFRP2 a pour conséquence d’augmenter l’apoptose dans les cryptes intestinales et ainsi diminuer le nombre de tumeurs chez des animaux double mutants sFRP2-/-/Apc+/1638N comparé aux simple mutants Apc+/1638N. Ces résultats fournissent des éléments originaux et importants sur les relations fonctionnelles entre les voies des HT et Wnt
The intestinal epithelium is a tissue constantly renewing through somatic stem cells located within the crypts. Several signalling pathways control this process and the homeostasis in this tissue. It is now recognized that the deregulation of these pathways is involved in the process of initiation and/or progression of intestinal tumors. My laboratory has described the involvement of thyroid hormones (TH) and their nuclear receptor TRα1 in the control of the intestinal homeostasis via the regulation of Wnt pathway, which plays a key role in the intestinal physiopathology. Specifically, TRα1 directly activates the expression of β-catenin and controls its stabilization through a mechanism involving sFRP2 (secreted frizzled-related protein 2). During my thesis, I participated to the characterization of transgenic mice overexpressing TRα1 in the intestinal epithelium. Moreover, I have been involved in the study of the molecular mechanisms of the cross-regulation between TRα1 and the canonical Wnt in the induction of intestinal tumors. We have therefore demonstrated an oncogenic role of TRα1 in the intestinal epithelium. In addition, the molecular and functional mechanisms involve both effectors of the canonical pathway, β-catenin and TCF4. On the other hand, I carried out the study of sFRP2 function in the intestinal physiopathology, and its action on the Wnt pathway. My data strongly suggest that sFRP2 plays an essential role in the differentiation of epithelial cytotypes. In addition, we showed that sFRP2 is a positive modulator of the canonical and non-canonical (JNK) Wnt. For instance, the absence of sFRP2 expression increases the apoptosis in the intestinal crypts and thus reduces the number of tumors in the double mutant sFRP2-/-/Apc+/1638N compared to simple mutant Apc+/1638N. These results provided original and important data of the functional relationships between TH and Wnt pathways

La voie Wnt est une voie de signalisation importante pour l’embryogenèse, la morphogenèse et l’homéostasie des tissus au stade adulte. Des mutations dans cette voie de signalisation sont souvent associées à une létalité embryonnaire ou à des pathologies sévères.Une caractéristique singulière de la signalisation Wnt est sa grande complexité génétique. Chez les vertébrés, ce sont 19 ligands Wnt différents qui peuvent potentiellement lier les 10 membres de la famille des récepteurs Frizzled (Fz). De plus, la liaison d’un ligand Wnt à un récepteur Fz peut conduire à l’activation d’au moins trois voies de transduction distinctes. Pourtant, l’interaction Wnt/Fz est incompatible avec une reconnaissance monospécifique étant donné que Wnt et Fz interagissent via des résidus conservés dans les deux familles. Les patrons d’expression des différents Wnt et des différents Fz sont complexes et souvent chevauchant. Malgré cela, la délétion sélective d’un Wnt peut conduire à des phénotypes spécifiques non-observés lors de la délétion d’un autre ligand Wnt co-exprimé. C’est notamment le cas des ligands Wnt7a et Wnt7b. Seules leurs expressions par les progéniteurs neuronaux permettent d’activer la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules endothéliales malgré l’expression simultanée d’autres ligands Wnt. Dès lors, comment les cellules des vertébrés sont-elles capables de discriminer les différents ligands Wnt ?L’étude de l’activation des signalisations induites par les ligands Wnt7a et Wnt7b permet d’illustrer par quel mécanisme moléculaire des co-récepteurs, tels que Gpr124 et Reck, médient la reconnaissance spécifique d’un ligand Wnt et permettent la formation d’un signalosome spécifique. Reck est un récepteur spécifique des ligands Wnt7a et Wnt7b qui permet de les discriminer de tous les autres ligands Wnt. Il interagit avec ceux-ci via une région intrinsèquement désordonnée et divergente dans la famille Wnt appelée « le peptide linker ». Etant donné que cette région est exposée au solvant et qu’elle ne comprend pas les sites d’interaction avec le récepteur Fz, elle pourrait jouer un rôle critique dans la discrimination des différents ligands Wnt. Gpr124, quant à lui, interagit avec Reck via son domaine extracellulaire et permet la co-localisation de ce dernier et des récepteurs Fz dans le même signalosome. Pour ce faire, Gpr124 interagit avec la protéine adaptatrice Dvl via son domaine intracellulaire. Le recrutement membranaire et la polymérisation de Dvl permettent la formation d’une plateforme d’ancrage facilitant la formation du complexe Reck/Gpr124/Fz/Lrp5/6 qui active alors sélectivement la voie la signalisation Wnt/β-caténine en réponse aux ligands Wnt7a et Wnt7b. L’identification d’un tel mécanisme de décodage laisse supposer qu’il pourrait exister plusieurs modules de reconnaissance spécifique adaptés à d’autres ligands Wnt assurant ainsi un réglage précis de la signalisation Wnt en fonction du contexte moléculaire de la membrane plasmique.
Doctorat en Sciences
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Les β-arrestines (Arrbs) régulent diverses voies de signalisation dont la voie Wnt/β-caténine (Wnt), un acteur clé dans le cancer colorectal. Le but de mon projet était d'étudier l'implication et les mécanismes régulés par les Arrbs dans la tumorigenèse intestinale dépendante de la voie Wnt. L'inhibition de l'expression des Arrbs partielle ou totale dans des souris ApcΔ14/+ montre que seules les souris invalidées pour l'Arrb2 développent 33% des tumeurs détectées chez les souris ApcΔ14/+ ; Arrb2+/+. Ces tumeurs ont une croissance normale. Cependant, l'analyse de leur transcriptome montre qu'elles expriment notamment certains gènes liés au système immunitaire, alors que les tumeurs dépendantes de l'Arrb2 expriment des gènes différents impliqués entre autres dans la voie Wnt. L'invalidation de l'Arrb2 réduit l'expression de gènes cibles de la voie Wnt dans les cellules isolées de 12 sur 18 tumeurs de souris ApcΔ14/+, et inhibe l'augmentation d'activité Wnt et la formation de colonies en agar mou induite par l'invalidation d'Apc dans des cellules murines ApcMin/+. L'Arrb2 est donc essentielle pour l'initiation et la croissance des tumeurs intestinales présentant une activité Wnt élevée. Pour comprendre les mécanismes régulés par l'Arrb2 dans ce contexte, les complexes protéiques associés à l'Arrb2 ont été analysés par protéomique dans des cellules humaines de cancer colorectal SW480 exprimant ou non un dominant négatif de Tcf4. 132 partenaires de l'Arrb2 potentiellement imbriqués dans un réseau de 917 protéines, ont été identifiés dans les cellules où la voie Wnt est active. Une baisse de 80% de l'activité Wnt entraine la disparition de 41 protéines avec 256 interactions potentielles alors que 42 protéines apparaissent avec 244 interactions potentielles. Le rôle clé d'Arrb2 dans le cancer colorectal s'expliquerait par la connexion d'au moins une quarantaine de protéines dépendantes de l'activité Wnt à un réseau de signalisation complexe dont l'analyse est en cours
Β-arrestins (Arrbs) participate in the regulation of multiple signaling pathways, including Wnt/β-catenin (Wnt), the major actor in human colorectal cancer. The aim of my project was to study the involvement of Arrbs and the mechanisms they regulate in Wnt-dependent intestinal tumorigenesis. The partial or total inhibition of Arrbs in ApcΔ14/+ mice showed that only mice with Arrb2 depletion developed only 33% of the tumors detected in their Arrb2-WT littermates. These remaining tumors grow normally and are Arrb2–independent. Transcriptomic analysis showed that they overexpressed genes that reflect a high interaction with the immune system, whereas those overexpressed in Arrb2–dependent tumors are predominantly involved in Wnt signaling. Moreover, Arrb2 siRNAs decreased the expression of Wnt target genes in cells isolated from 12 of 18 tumors from ApcΔ14/+ mice, completely reversed the increased Wnt activity and colony formation in soft agar induced by Apc siRNA treatment in ApcMin/+ cells. Therefore, Arrb2 is essential for the initiation and growth of intestinal tumors displaying elevated Wnt pathway activity. To better understand the mechanisms involved in this context, Arrb2 protein complexes were analyzed by a differential systematic proteomic approach in SW480 human colorectal carcinoma cells expressing or not a Tcf4 dominant negative. 132 Arrb2 partners potentially involved in a signaling network of 917 proteins were identified in cells with a high Wnt activity. Upon a 80% decrease of this activity 41 partners disappeared with their 256 potential interactions whereas 42 partners appeared with 244 new possible interactions. Arrb2 key role in colorectal cancer could be explained by the cross-talk of about 40 proteins dependent of Wnt activity with a highly complex signaling network that is currently analyzed

Le foie est un organe qui exerce un rôle majeur dans le contrôle de l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme en maintenant la glycémie à un taux constant. LKB1 est une sérine-thréonine kinase qui joue un rôle clef dans la physiologie cellulaire en couplant le contrôle du métabolisme au statut énergétique de la cellule. A l’aide de modèles murins ayant une délétion de LKB1 dans les hépatocytes adultes, nous avons identifié un rôle complexe pour LKB1 au sein de l’homéostasie énergétique. L’objectif de ma thèse était de caractériser ce phénotype et d’en comprendre les bases physiologiques. Nos résultats montrent une hyperglycémie à jeun chez les animaux mutants, associée à une perte de masse maigre (muscle), une accumulation du glycogène à jeun et une activation constitutive de la voie de l’insuline, qui, à long terme, conduit à une cachexie. Nos résultats suggèrent que Lkb1 hépatique exercerait un dialogue complexe avec la signalisation insuline dans le contrôle de la gluconéogenèse avec une dépendance énergétique aux acides aminés. Nous avons aussi montré qu’il existait un dialogue complexe entre LKB1 et la voie Wnt/β-caténine dans le foie. En effet, les carcinomes hépatocellulaires (CHC) mutés CTNNB1 ont des caractéristiques phénotypiques en termes de polarité et de métabolisme (absence de stéatose). Nous avons émis l’hypothèse que ce phénotype pouvait être secondaire à l’activation du gène suppresseur de tumeurs LKB1. Les mutations CTNNB1 sont en effet capable d’induire l’expression protéique de LKB1 dans les lignées hépatomateuses humaines, et les CHC mutés CTNNB1 présentent une expression protéique accrue de LKB1. De plus, dans deux modèles murins d’invalidation hépatospécifique de Lkb1, LKB1 est apparu comme requis pour l’activation du programme transcriptionnel de β-caténine mais de façon dépendante du stade de développement et du contexte nutritionnel
The liver plays a major role in the control of both metabolic and energetic homeostasis in the body by maintaining glycemia. LKB1 is a serine-threonine kinase that plays a crucial role in cell physiology by controlling cell metabolism and cell energetic status. Using murine model with LKB1 hepatospecific deletion, we identified a complex role for LKB1 in energy homeostasis. The aim of my thesis was to characterize this phenotype and to understand its physiological basis. Our results show a hyperglycemia at fasted state in mutants animals, associated with a loss of dry mass, a glycogen accumulation and a constitutive activation of insulin signaling, which leads to a cachexia at long term. Our results suggest that hepatic Lkb1 is involved in a cross talk with insulin signaling in the control of neoglucogenesis with amino acid dependence. We also showed a cross talk between LKB1 and Wnt/β-catenin signaling in the liver. Indeed, CTNNB1-mutated hepatocellular carcinoma (HCC) have phenotypic features in terms of polarity and metabolism (lack of lipid accumulation). Our hypothesis is that this phenotype would be secondary to the activation of the tumour suppressor gene LKB1. CTNNB1 mutations induce LKB1 proteic expression in human hepatoma cell lines and CTNNB1-mutated HCC show an increased proteic LKB1 expression. In two murine models of Lkb1 hepatospecific invalidation, LKB1 seems to be necessary for the activation of the β-catenin transcriptional program in a way that is dependent on developpemental state and nutritional context

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) présente des mutations génétiques qui altèrent les principales voies de signalisation, notamment la voie Wnt/β-caténine. En absence de mutation génétique, certains CHC peuvent montrer une activité Wnt exacerbée suite à une inactivation épigénétique d’inhibiteurs ou à une surexpression de ligands Wnts ou de ses récepteurs. De plus, le remodelage de la matrice extracellulaire favorise la progression du CHC. Nous avons montré une association entre l’activation du signal Wnt et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) dans les cirrhoses et le CHC. Puis modélisé in vitro, les effets des stimuli Wnt extracellulaires sur le phénotype de cellules hépatiques, en absence de mutation de la β-caténine. En effet, les cellules HepaRG ne présentent pas de mutations de la β-caténine, de l’axine et de p53. Ainsi, la stimulation Wnt3a des cellules HepaRG induisait la formation de palissades de cellules fusiformes. De plus, les cellules traitées exprimaient des taux élevés de αSMA, COLIV, c-MYC, CK19 et LGR5 suggérant un phénotype myofibroblastique, en accord avec l’expression des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), SNAIL et TWIST. Ces données sont en faveur du rôle déterminant du microenvironnement Wnt activé dans la progression du CHC entrainant les cellules vers un phénotype progéniteur plus agressif via une TEM. En outre, l'analyse in silico de la signature transcriptomique de l'activation non mutationnelle de la voie Wnt a révélé un réseau de gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, la TEM et la différenciation cellulaire. Les résultats suggèrent le rôle de HAPLN1 qui affecterait la migration cellulaire et l'expression des gènes de la MEC. De plus, LGR5 semble favoriser la dédifférenciation des hépatocytes. Au total, 8 gènes marqueurs obtenus in vitro ont été validés in vivo dans une série de 81 CHC humains, par qPCR et immunohistochimie en utilisant des tissus micro-array (78 CHC et 5 foies contrôles). Au total, l'ensemble des données suggère que HAPLN1 a une valeur pronostique sur la récidive et la survie globale du CHC. HAPLN1semble être indépendant du statut mutationnel la β-caténine et des variables cliniques. De plus, sa valeur pronostique est additive avec celle de CK19 + EpCAM et il semble agir en synergie avec NOG
Hepatocellular carcinoma (HCC) displays signaling pathway disorders, including Wnt/β-catenin. Up-regulation of extracellular Wnt pathway agonists and down-regulation of extracellular Wnt pathway inhibitors result in non-mutational activation of Wnt signaling. In addition, increased extracellular matrix remodeling fosters HCC progression. Thus, we showed that enhanced Wnt signaling is associated with extracellular matrix remodeling in human cirrhosis and cancer. To further investigate non-mutational Wnt pathway activation, we established a model of Wnt activation in HepaRG human HCC progenitor cells carrying wild-type β-catenin, axin and p53. HepaRG progenitor cells treated with Wnt3a became fusiform and grew in palisades with enhanced expression of αSMA, COLIV, CK19, c-MYC, LGR5, SNAIL and TWIST, suggesting that enhanced extracellular Wnt signaling may drive HCC cells toward a more aggressive progenitor and epithelial mesenchymal transition (EMT) phenotype. Moreover, in silico analysis of the transcriptomic signature of non-mutational Wnt activation revealed a gene network involved in ECM remodeling, EMT and cell fate. Results suggest a role of HAPLN1, affecting extracellular matrix gene expression and cell migration and of LGR5 in hepatocyte dedifferentiation. Eight genes among the HepaRG gene expression dataset were validated in vivo in a collection of 81 human HCC samples and controls by qPCR and immunohistochemistry using tissue micro-arrays (78 HCC samples and 5 normal livers) in the light of β-catenin activation and mutational status. In conclusion, data suggest that HAPLN1 has a prognostic value on overall survival and recurrence of HCC. HAPLN1 appears to be independent of clinical features and β-catenin mutationnal status. Moreover, HAPLN1 appears to have an additive prognostic value with CK19 + EpCAM and act synergistically with NOG

L'ostéosarcome est la tumeur osseuse primitive maligne la plus fréquente chez les enfants avec 150 nouveaux cas par an en France. La survie des patients n’a pas évolué depuis 30 ans, atteignant 70 % à 5 ans pour les patients présentant une forme localisée de la maladie, mais seulement 25 % en présence de métastases (20% des cas), aucun traitement ne montrant une efficacité suffisante chez ces patients métastatiques. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, une dérégulation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine a été rapportée dans de nombreux cas d'ostéosarcome, mais son implication dans le développement de ces tumeurs reste controversée. Ainsi, nous avons évalué le potentiel anti-tumoral de l'ICG-001, une molécule ciblant spécifiquement l’interaction entre la protéine de liaison CREB Binding Protein (CBP), et la β- caténine et inhibant ainsi la transcription dépendante de ce complexe, dans trois lignées cellulaires d’ostéosarcome humain, KHOS, MG63 et SJSA1. L'ICG-001 diminue la prolifération cellulaire mais, de façon surprenante, favorise la migration des cellules in vitro et le développement de métastases pulmonaires dans un modèle murin de xénogreffe induit par une injection para-tibiale de cellules KHOS. Cet effet pro-migratoire pourrait résulter en partie, d’un déplacement d’équilibre transcriptionnel d’un complexe se composant de la β-caténine et de CBP vers un complexe incluant la β-caténine et un autre cofacteur p300. Cette étude ajoute donc un niveau de complexité quant au rôle de la voie Wnt/β-caténine dans le développement métastatique de l'ostéosarcome
Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor in children with 150 new cases per year in France. Patient survival has not been improved for the last decades, reaching 70% to 5 years for patients with localized disease, but only 25% for patients with metastatic disease (20% of cases), no effective treatment could develop for these patients with metastases at diagnosis. Therefore, it is necessary to develop new therapeutic strategies. In this context, a deregulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway has been reported in many cases of osteosarcomas, but its involvement in the development of these tumors remains controversial. Thus, we evaluated the anti-tumor potential of ICG-001, a small molecule specifically targeting the interaction between the CREB Binding Protein (CBP) and the β- catenin, inhibiting the dependent transcription of this complex, in three human osteosarcoma cell lines, KHOS, MG63 and SJSA1. ICG-001 reduces cell proliferation but, surprisingly, promotes cell migration in vitro and the development of pulmonary metastases in a mouse xenograft model induced by para-tibial injection of KHOS cells. This pro-migratory effect could result in part from a transcriptional switch from a complex consisting of β-catenin and CBP to a complex including β-catenin and another cofactor, p300. Thus, this study adds a level of complexity to the role of the Wnt/β- catenin pathway in the metastatic development of osteosarcoma

L'arthrose est une maladie articulaire fréquente, affectant plus de 10 millions d'individus. Bien que caractérisée par la destruction progressive du cartilage, elle implique l'ensemble de l'articulation, y compris l'os sous-chondral, le cartilage et la membrane synoviale. Nous nous sommes intéressés à la voie Wnt qui régule le remodelage du cartilage et de l'os dans l'objectif de mieux comprendre la régulation locale des 2 tissus. Dans un modèle murin d'instabilité articulaire, nous avons caractérisé des approches différentes pour inhiber la voie Wnt et freiner la perte du cartilage. L'inhibition osseuse de la signalisation Wnt par DKK1 empêche la perte de cartilage et la formation d'ostéophytes. De plus, la suractivation de la voie Wnt/I3-caténine chez les souris déficientes en sclérostine a aggravé les lésions du cartilage. En outre, nous avons montré qu'HIFlα est un inhibiteur de la voie canonique de Wnt qui se lie à β-caténine et inhibe son interaction avec TCF4. La délétion conditionnelle d' HIF1α dans les chondrocytes a augmenté les lésions du cartilage et l'expression de MMP13 qui est dépendante de l'interaction TCF/13-catenine. Nos résultats apportent des preuves fortes sur le rôle pro-catabolique de la voie Wnt dans l'arthrose. Enfin, nos travaux décrivent le rôle des inhibiteurs de cette voie afin de développer de nouvelles stratégies pour prévenir la destruction du cartilage au cours de l' arthrose
Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease, affecting millions of individuals wordwide. OA , a disease characterized by progressive cartilage destruction, involves the whole joint including the subchondral bone, cartilage and the synovium. Wnt signaling is a major regulator of bone and cartilage remodeling. Here we show that the activation of Wnt signaling in bone and cartilage, triggers cartilage destruction. We have characterized different approaches to inhibit Wnt signaling and prevent cartilage loss. The inhibition of Wnt signaling in bone by DKK1 prevents cartilage loss and osteophyte formation. In the other hand, the over-activation of Wnt signaling, through sclerostin deficiency, enhanced cartilage destruction through the regulation of canonical and non-canonical Wnt pathway. Furthermore, we showed that HIF 1 a is a canonical Wnt inhibitor that binds to β-catenin and inhibits its interaction with TCF4. This prevents the binding of TCF4 to the regulatory region of MMP13 gene. In DMM mice, conditional knock-out of HIF la in chondrocytes exacerbated cartilage lesions and MMP13 expression which is dependent of TCF/β-catenin interaction. Our results shed light on one of the main controversies in the role of Wnt signaling in OA and provide new Wnt inhibitory strategies to prevent cartilage destruction. Ever, Dkkl overexpression in the bone induced a decrease in VEGF expression, thereby decreasing cartilage catabolism. These data highlight the links between bone and cartilage in OA, and show that targeting bone can impact cartliage lesions

La régulation de la croissance et de la régénération des cellules bêta pancréatiques est soumise à l'action de facteurs extra et intra-cellulaires qui agissent de concert afin d'assurer la production d'insuline nécessaire au maintien de l'homéostasie glucidique. Le manque de cellules bêta fonctionnelles est un acteur majeur de la pathogenèse du DT2. Nous nous sommes intéressés à l'implication de la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine dans la régulation de la masse bêta cellulaire. Ce travail a porté sur l'étude de 1) de l'implication de cette voie de signalisation dans la croissance normale des cellules bêta chez le rat Wistar nouveau-né 2) son rôle dans la régénération bêta cellulaire dans des modèles de diabète néonataux induit (rat nO-STZ) et spontané (rat GK) et 3) son rôle dans la régénération des cellules bêta pancréatiques chez l'adulte après pancréatectomie à 90%. Nous montrons que les effecteurs distaux de la voie Wnt (TCF7L2 et bêta-caténine) régulent la croissance normale des cellules bêta pendant la période néonatale. De plus, l'activation de cette voie de signalisation par des inhibiteurs de GSK3bêta peut participer à la stimulation in vitro la prolifération des cellules bêta et in vivo leur régénération chez le rat diabétique nO-STZ. Enfin, nous montrons que l'inhibition de la GSKSbêta stimule la régénération des cellules bêta pancréatiques dans un modèle de déficit bêta cellulaire chez l'adulte après pancréatectomie. Nos résultats impliquent pour la première fois la voie Wnt canonique dans la régulation des phénomènes de croissance compensatoire des cellules bêta et de ce fait offre une nouvelle cible d'intervention pour la médecine régénérative
The loss of functionnal beta cells is the root cause for the development of diabetes. The regulation of beta cells mass is critically reliant on a combination of extra- and intracellular signals that act to maintain normal beta cell mass under basal conditions and to promote adaptative growth of these cells when the need for insulin increases. In this work, we investigated the role of the canonical Wnt pathway 1) in the process of normal beta cell growth in Wistar neonates, and 2) in the process of beta cell regeneration in induced and spontaneous models of neonatal diabetes (nO-STZ and GK respectively), 3) in beta cell regeneration after 90% pancreatectomy in adult rat. Our findings demonstrate that the effectors of the Wnt signalling pathway (TCF7L2 and beta-catenin) regulate the normal beta cell growth in Wistar neonates. Moreover, the activation of the Wnt pathway by the inhibition of GSKSbeta participate to the stimulation of pancreatic beta cell regeneration in vivo in diabetic nO-STZ neonates. Finally, we showed that the inhibition of GSKSbeta stimulates beta cell regeneration in adult rat after pancreatectomy. Our results open new perspectives for the development of pharmacological maneuvers aimed at the in vivo induction of beta cell growth and could be pertinent to potential clinical applications in regenerative therapy of diabetes

Nouveau modèle d’étude de l’hépatoblastome in vivo et identification de microARNs régulateurs de la β-caténineL’hépatoblastome (HBL) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. Au niveau moléculaire, il est caractérisé par des mutations activatrices dans le gène de la β-caténine (CTNNB1) entrainant une accumulation de sa protéine et une activation anormale de la voie de signalisation Wnt, responsables de la transformation maligne des cellules hépatiques. Ainsi, la β-caténine est une cible thérapeutique majeure dans l’HBL.Ce manuscrit décrit les deux parties principales de mon projet de thèse, dont l’objectif était d’étudier le rôle de microARNs régulateurs de la β-caténine sur la carcinogenèse de l’HBL.La première partie présente le développement d’un nouveau modèle d’étude in vivo de l’HBL. Ce travail a consisté à réaliser des xénogreffes de cellules dérivées d’HBL sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) de l’embryon de poulet, et à étudier le développement des tumeurs par des approches histologiques et moléculaires. Mes résultats montrent que les cellules d’HBL modifient leur phénotype et activent des mécanismes de survie et de prolifération pour former des nodules tumoraux structurés et vascularisés au sein de la CAM. Le traitement des cellules par le cisplatine conduit à un arrêt net de la progression tumorale.La seconde partie présente les résultats concernant la régulation de la β-caténine et des processus oncogéniques par les microARNs dans les cellules d’HBL. Un crible fonctionnel m’a permis d’identifier plusieurs microARNs ayant un effet inhibiteur sur la β-caténine. Quatre microARNs, sous-exprimés dans les tumeurs de patients, bloquent la prolifération cellulaire et l’activité de la voie Wnt in vitro. Le miARN le plus efficace interagit avec l’ARNm de la β-caténine via un site unique localisé dans sa région 3’ non traduite et bloque la croissance des tumeurs d’HBL sur la CAM.Durant ma thèse j’ai développé un nouveau modèle animal d’étude de l’HBL qui permet de modéliser la croissance tumorale et de tester l’impact de molécules thérapeutiques. Ce travail a également permis d’identifier de nouveaux microARNs sous-exprimés dans les tumeurs d’HBL, qui inhibent l’expression de la β-caténine et agissent comme des gènes suppresseurs de tumeur. Ces microARNs constituent de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de l’HBL et pourraient aussi être utilisés comme des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques
Hepatoblastoma (HBL) is the most common pediatric liver cancer. At molecular level it is characterized by activating mutations in β-catenin gene (CTNNB1) that cause protein accumulation and abnormal Wnt signaling pathway activation leading to malignant transformation of hepatic cells. Therefore, β-catenin is a key therapeutic target in HBL.This manuscript describes two major parts of my thesis project that aimed to understand the role of β-catenin-regulating microRNAs in HBL carcinogenesis.The first part presents the development of a new in vivo HBL model. This work consisted of making HBL-derived cells xenograft on chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) and studying tumor development using histological and molecular approaches. My results show that HBL cells implanted on CAM modify their phenotype and activate survival and proliferation mechanisms to form organized and vascularized tumor nodules. Cell treatment with cisplatin leads to tumor progression arrest.The second part presents results concerning the regulation of β-catenin and oncogenic processes by microRNAs in HBL cells. A functional screening allowed me to identify several microRNAs with an inhibitory effect on β-catenin. Four microRNAs down-regulated in patient tumors inhibit cell proliferation and Wnt pathway activity in vitro. The most efficient microRNA directly interacts with β-catenin mRNA through a unique site localized in 3’ untranslated region and blocks HBL tumor growth on CAM.During my thesis I developed a new animal model to study HBL that allows modelling rapid tumor growth and testing the impact of therapeutic molecules. My work also led to the identification of new microRNAs down-regulated in HBL tumors that inhibit β-catenin expression and act as tumor suppressor genes. Those microRNAs represent new potential therapeutic molecules for HBL treatment and could be also used as diagnostic and prognostic biomarkers

La gonade embryonnaire a la capacité de se différencier en deux structures très différentes, le testicule et l'ovaire, grâce à l'intervention de différentes voies de signalisation. Chez les mammifères, la voie Wnt/ß-Caténine joue un rôle majeur dans la différenciation ovarienne, notamment via Wnt4, Rspo1, et un gène-cible de cette voie, la Follistatine. L'objectif de mon travail de thèse était de caractériser l’implication potentielle de cette voie de signalisation au cours de la différenciation gonadique de la truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss. Une attention particulière a été portée au gène wnt4. Trois paralogues ont été identifiés chez la truite: Wnt4a1 et Wnt4a2, fortement conservés avec les séquences Wnt4 des autres vertébrés, et Wnt4b, une forme divergente, qui semble s’être sous-fonctionnalisée dans le développement du système nerveux. L'analyse par PCR en temps réel et par hybridation in situ a montré que les gènes wnt4a1/2 et rspo1 ne sont pas surexprimés dans l'ovaire en cours de différenciation, contrairement au facteur de transcription tcf7. Le gène de la follistatine (fst) s'exprime de façon très précoce dans l'ovaire, dans les mêmes cellules que cyp19a1a, un gène-clé de la différenciation ovarienne, nécessaire pour la synthèse des oestrogènes. Ce sont à ce jour les gènes qui présentent un dimorphisme sexuel le plus précoce dans l'ovaire. L'inhibition de la voie Wnt durant la différenciation ovarienne conduit à une diminution de l'expression de fst et de cyp19a1a. Ces travaux suggèrent donc une implication de la voie Wnt/ß-Caténine dans la différenciation ovarienne chez la truite arc-en-ciel
The embryonic gonad is able to differentiate into two very different structures, the testis and the ovary, and this process is under the control of multiple signalling pathways. In mammals, the Wnt/ ß-Catenin pathway plays a major role in ovarian differentiation, through the action of Wnt4, Rspo1, and a gene that acts downstream of this pathway, Follistatin. The aim of the work presented in this thesis was to characterize the expression of molecular actors of this pathway, and to study the potential implication of the Wnt/ ß-Catenin pathway during gonadal differentiation in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Particular attention was paid to the wnt4 gene, and three paralogs were identified in rainbow trout. Wnt4a1 and Wnt4a2 proteins share high identity with other vertebrate Wnt4 proteins, whereas the teleost fish specific sequence Wnt4b is clearly more divergent, and seemed to have sub-functionalized in the nervous system development. Analysis by real-time PCR and in situ hybridization showed that wnt4a1/2 and rspo1 genes are not overexpressed in the ovary during gonadal differentiation, in contrast to the transcription factor tcf7. The follistatin gene (fst) is expressed in the same cells than cyp19a1a, a key gene in ovarian differentiation, that is necessary for estrogen synthesis. It is so far the earliest genes that display a sexually dimorphic expression in the ovary. Inhibition of the Wnt pathway during ovarian differentiation leads to a decreased expression of fst and cyp19a1a. These results therefore suggest an involvement of the Wnt / ß-catenin in ovarian differentiation in rainbow trout

Le cancer colorectal et le carcinome hépatocellulaire font partie des cancers les plus fréquents au monde. Les traitements disponibles à ce jour pour les formes avancées de ces cancers ne sont que palliatifs et ont une efficacité relativement faible. Les biothérapies ciblant les mécanismes moléculaires impliqués dans la croissance ou la différenciation des cellules tumorales permettent de proposer des traitements nouveaux ayant une forte spécificité et une faible toxicité, prolongeant ainsi les rémissions avec une meilleure qualité de vie. Nous nous sommes intéressés au collagène XVIII qui est un composant majeur des membranes basales. Un des variants de ce collagène possède un domaine Frizzled que nous avons nommé FZC18. Celui-ci contient un motif CRD (Cysteine-rich Domain) homologue à celui présent dans la portion extracellulaire des récepteurs Frizzled et à celui des SFRPs (Secreted Frizzled-related Proteins), deux acteurs majeurs de la voie de signalisation Wnt/β-caténine
Colorectal cancer and hepatocellular carcinoma are among the most common cancers in the world. Currently available treatments for advanced froms of these cancers are only palliative and have a relatively low efficacy. Biotherapy targeting the molecular mechanisms involved in growth or differentiation of tumor cells provide treatments with high specificity and low toxicity, prolonging remissions with a better quality of life. A major issue in the use of biomolecules is teir ability to enter in the tumor cells, which can be adressed by using biomolecules that target cell surface receptors. We focused on collagen XVIII, which is a major basement membrane component. One of the variants of this collagene has a FZC18 domain, which contains a CRD motif (Cysteine-rich Domain) homologous to the CRD of the extracellular Wnt-binding domain of the Frizzled receptors and the SFRPs (Secreted Frizzled-related Proteins). Both of them are major actors of the Wnt/β-catenin signaling pathway

Runx2 est un facteur de transcription indispensable à la différenciation de l'ostéoblaste (Ob) et nécessaire au développement osseux. Chez la souris transgénique (TG), la surexpression de Runx2 spécifiquement dans l'Ob induit un phénotype ostéoporotique précoce et sévère avec apparition de fractures spontanées. Cette ostéoporose est la résultante d'une augmentation de la résorption couplée à un blocage de la différenciation ostéoblastique. Notre étude a eu pour but de déterminer si la voie Wnt/p-Caténine, très importante dans le développement du tissu osseux, était impliquée dans le mécanisme induisant l'ostéoporose chez la souris TG. En particulier nous avons cherché à mettre en évidence l'implication de Runx2 dans la régulation de la voie Wnt et son impact sur le phénotype osseux de la souris Runx2 et son contrôle. Nous avons mis en évidence que l'activité de la p-Caténine est régulée de façon dose-dépendante par l'expression de Runx2 in vitro et in vivo et que son activation peut restaurer l'activité de la P-Caténine et partiellement la différenciation de l'Ob Runx2. Nous avons aussi montré que la stimulation de la voie Wnt induit une restauration du phénotype trabéculaire osseux due à l'inhibition de la résorption osseuse suite à une augmentation de la synthèse d'ostéoprotégérine par l'Ob. En conclusion, alors qu'une restauration de la différenciation ostéoblastique était attendue, nous avons montré que la stimulation de la voie Wnt inhibe la différenciation ostéoclastique et donc la résorption osseuse induite par la surexpression de Runx2. Notre travail montre que la voie Wnt est un régulateur indirect de la résorption osseuse induite par Runx2 dans notre modèle
Runx2 is a transcription factor essentiel for osteoblast differentiation and necessary for bone development. Moreover, transgenic mice overexpressing Runx2 specifically in osteoblast exhibit an early and severe osteoporosis associated with spontaneous fractures. Osteoporosis in mice overexpressing Runx2 is the result of an increased resorption coupled to a blocking of osteoblast differentiation. Our study was designed to determine whether the Wnt/p-Catenin, that is very important in the development of bone tissue, was involved in the mechanism inducing osteoporosis in mice overexpressing Runx2. In particular, we sought to highlight the involvement of Runx2 in the regulation of the Wnt and the impact of this pathway on the bone phenotype in mice overexpressing Runx2 and in their control. We have shown that the activity of p-Catenin is regulated in a dosé-dependent manner by expression of Runx2 in vitro and in vivo, and that stimulation of the Wnt pathway can restore the activity of p-Catenin and partially the differentiation of osteoblasts overexpressing Runx2. We also showed in vivo that stimulation of the Wnt pathway induces a restoration of trabecular bone phenotype. This restoration is due to inhibition of bone resorption with an increase in the synthesis of osteoprotegerin by osteoblasts. In conclusion, while a restoration of osteoblast differentiation was expected, we showed that stimulation of the Wnt signaling inhibits in vivo and in vitro osteoclast differentiation and thus bone resorption induced by overexpression of Runx2. Our work shows that the Wnt pathway is an indirect regulator of bone resorption induced by Runx2 in our model

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l’adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l’adiponutrine dans le foie, d’une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l’insuline et au glucose et d’autre part, en étudiant l’impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L’adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l’adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l’insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l’orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d’animaux résistants à l’insuline, suggérant qu’elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique
The prevalence of metabolic syndrome (MetS) has increased in industrial countries. The hallmark of MetS in the liver is an excessive accumulation of triglyceride, which is called hepatic steatosis. Different SNP (Single Nucleotide Polymorphism) are associated with hepatic steatosis or MetS. One of them is found on adiponutrin/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) gene (SNP I148M) and is now considered as a new marker of hepatic steatosis and severity of NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). In order to understand the physiological role of adiponutrin in the liver, we studied its transcriptional regulation by SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) and ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein), mediators of insulin and glucose respectively. Moreover, by overexpressing adiponutrin in mice liver, we investigated its role in hepatic carbohydrate and lipid metabolism. We showed that adiponutrin is regulated as lipogenic genes and could have a role lipid metabolism. As for adiponutrin I148M, different SNP are found on substrats of Wnt/β-catenin pathway, a major pathway controlling acinus zonation. We examined the regulation of this pathway by nutritionnal status and in a pathophysiological context of insulin resistance and steatosis. We showed that Wnt/β-catenin pathway is regulated by pancreatic hormones (insulin and glucagon) in the liver in order to adapt hepatocyte phenotype to energetic needs. Moreover, this pathway is dysregulated in insulin resistant mice liver. These data may suggest a link between Wnt/β-catenin pathway deregulation and hepatic metabolic disorders

Dans le muscle squelettique, les lipides intramyocellulaires (IM) semblent responsables de l'insulinoresistance (IR) qui conduit à long terme à l'obésité et au diabète de type 2. Nous avions montré in vitro qu'une concentration élevée de glucose augmente SREBP-1c, ce qui induit une lipogenèse de novo et une IR. Ici, nous montrons que Wnt10b et SREBP-1c présentent des profils d'expression inverses in vitro et in vivo. L'invalidation de Srebp-1c induit l'expression de Wnt10b et la ré-activation de la voie Wnt/β-caténine dans les myotubes où elle est éteinte. Inversement l’invalidation de Wnt10b induit l'expression de Srebp-1c dans les myoblastes. Puis, un traitement avec le BIO (6-BromoIndirubine-3’Oxime),inhibiteur sélectif de la GSK3, réduit les lipides IM et améliore la sensibilité à l'insuline. Des résultats similaires ont été observés dans des myoblastes humains d'un sujet sain et d'un sujet obèse et diabétique. Pour déterminer les effets de l'activation de la voie Wnt in vivo, nous avons électrotransfecté l'ADNc de Wnt10b ou injecté du BIO directement dans le muscle Tibialis Anterior de souris obèses et diabétiques (ob/ob). Dans les deux cas, 21 jours après traitement, Wnt10b est surexprimé et SREBP-1c est diminué, ce qui induit une diminution de lipides IM et une baisse de la glycémie des souris ob/ob. De plus, l'activation de la voie Wnt entraîne un remodelage des fibres musculaires vers des fibres oxydatives (Types I/IIA) et augmente la capacité respiratoire des cellules musculaires. L'augmentation du métabolisme oxydatif des cellules musculaires humaines et murines montre que l'activation de la voie Wnt peut conduire à l'amélioration de la sensibilité à l'insuline

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC
Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l'adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l'adiponutrine dans le foie, d'une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l'insuline et au glucose et d'autre part, en étudiant l'impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L'adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l'adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l'insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l'orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d'animaux résistants à l'insuline, suggérant qu'elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique.

Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...)
Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity

Afin de mieux connaître les mécanismes moléculaires impliqués dans le cancer du sein, nous avons entrepris l'étude de la fonction du gène suppresseur de tumeur WWOX comprenant le site fragile FRA16D. Nous avons mis en évidence l'association de WWOX avec des composants de la voie de signalisation intracellulaire Wnt/β-caténine : Dvl-2, BCL9 et BCL9-2, ainsi que, l'histone deacetylase 3 (HDAC3). Nous avons défini, pour la première fois, WWOX en tant que nouvel inhibiteur de la voie Wnt/β-caténine. Nos résultats suggèrent que WWOX agit sur cette voie en séquestrant Dvl-2 dans le cytoplasme et en inhibant les activités transcriptionnelles de BCL9 et BCL9-2. En outre, nous avons démontré que HDAC3 est également capable d'inhiber l'activité transcriptionelle de BCL9-2. HDAC3 agirait en recrutant WWOX sur BCL9-2 et cela indépendamment de son activité déacétylase. L'inhibition de la voie Wnt/β-caténine par WWOX suggère que l'inhibition de l'expression de WWOX, souvent observée dans le cancer du sein, pourrait conduire à la suractivation de cette voie et par conséquent à la stimulation de la progression tumorale. En parallèle de ce travail, nous avons étudié l'implication des nouveaux partenaires moléculaires de WWOX que nous avons trouvé dans la carcinogenèse mammaire. Nous avons mis en évidence une surexpression de BCL9, et non pas de BCL9-2, dans les tumeurs du sein, cette surexpression serait due, au moins en partie à des polyploïdies et des amplifications du gène, suggérant un rôle important de BCL9 dans cette pathologie.

Les carcinomes cortico-surrénaliens (CCS) sont des tumeurs malignes rares de mauvais pronostic et pour lesquelles les options thérapeutiques efficaces sont inexistantes. Il est donc indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des CCS, afin d’améliorer leur prise en charge. Les deux altérations les plus fréquentes dans les CCS sont une surexpression du facteur de croissance IGF2 et l'activation constitutive de la voie Wnt/β-caténine. Le laboratoire a mis en évidence le rôle oncogénique de la β-caténine à l'aide d'un modèle murin (souris ΔCat) présentant une activation constitutive de la β-caténine dans la cortico-surrénale. Toutefois, la faible pénétrance du phénotype malin suggère la nécessité d'autres altérations pour la progression tumorale. L’objectif initial de ma thèse était de tester le pouvoir oncogénique de IGF2, seul ou en association avec l’activation constitutive de la β-caténine. Les modèles de surexpression de Igf2 dans la cortico-surrénale nous ont permis de montrer que Igf2 n'initie pas le développement de tumeurs cortico-surrénaliennes. Dans un contexte d'activation de la β-caténine, la surexpression de Igf2 favorise le développement tumoral à des stades tardifs. Toutefois la formation de tumeurs malignes reste un évènement rare. Ces résultats suggèrent donc que la surexpression de Igf2 et l'activation de la β-caténine ne sont pas suffisantes dans notre modèle pour induire le développement de CCS. Une analyse rétrospective des données de transcriptome nous a permis de mettre en évidence une surexpression de l’oncogène putatif et histone méthyl-transférase EZH2, qui est associée à un mauvais pronostic. Mes travaux in vitro suggèrent que EZH2 est surexprimé en réponse à une surexpression des facteurs E2F et qu’il pourrait être impliqué dans le contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de certaines caractéristiques tumorales des cellules cortico-surrénaliennes humaines H295R. Des inhibiteurs pharmacologiques étant disponibles, EZH2 pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante pour le traitement des CCS. En parallèle de ces travaux, nous avons cherché à identifier les mécanismes impliqués dans la zonation du cortex surrénalien. Au cours du renouvellement tissulaire, les cellules acquièrent d’abord une identité glomérulée puis fasciculée. L'identité de la zone glomérulée repose en partie sur l'activité de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation induit l'expression de gènes essentiels à l'identité de cette zone et inhibe l'identité fasciculée. La différenciation fasciculée des cellules doit donc reposer en partie, sur l'inhibition de cette voie de signalisation. Nous avons donc émis l'hypothèse que la signalisation PKA, activée dans la zone fasciculée par la liaison de l'ACTH à son récepteur MC2R, s'oppose à l'activité de la β-caténine pour permettre la différenciation fasciculée. A l'aide d'approches pharmacologiques et génétiques, nous avons pu mettre en évidence que l'activation de la PKA inhibe la voie Wnt/β-caténine dans le cortex surrénalien et que ceci est à l'origine d'une perte de la zone glomérulée au profit d'une expansion de la fasciculée. L'effet de la PKA sur la voie Wnt résulte au moins en partie de l'inhibition de l'expression de Wnt4 en réponse à l'activation de la PKA. En effet une diminution d'expression de Wnt4 est observée en réponse à l'activation de la PKA dans la cortico-surrénale et l'invalidation de Wnt4 spécifiquement dans le cortex induit un phénotype proche de celui observé lors de l'activation de la PKA. Au delà des mécanismes moléculaires de la zonation, nous avons également montré que l’effet inhibiteur de la PKA sur la signalisation Wnt était capable de s’opposer aux effets oncogéniques de la β- caténine dans la cortico-surrénale. Ces observations pourraient s’avérer pertinentes, la voie de signalisation ACTH/PKA étant inhibée dans les CCS
Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare tumour associated with poor prognosis and for which, efficient therapeutic approaches are not available. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in CCS development in order to improve their clinical management. The two most frequent alterations in ACC are overexpression of IGF2 and constitutive activation of β-catenin. Our lab has previously demonstrated the oncogenic activity of β-catenin in the adrenal cortex by developing a mouse model of constitutive β-catenin activation (ΔCat mice). However, the low malignant progression in ΔCat mice suggests that other alterations are necessary for acquisition of malignancy. The initial aim of my thesis was to test the oncogenic potential of IGF2 alone or associated with constitutive β-catenin activation. We showed that overexpression of Igf2 in the adrenal cortex does not trigger adrenal cortex tumourigenesis. In a context of constitutive β-catenin activation, overexpression of Igf2 promotes tumour development at later stages. However the formation of malignant tumours remains a rare event. These data suggest that the overexpression of Igf2 and constitutive activation of β-catenin are not sufficient to trigger malignant tumour progression. Retrospective analysis of available ACC transcriptome data highlighted overexpression of the putative oncogene and histone methyltransferase EZH2 in ACC, which was associated with poor prognosis. My in vitro studies suggest that EZH2 is overexpressed in response to overexpression of E2F transcription factors and that it could be involved in control of proliferation, apoptosis and oncogenic capacities of adrenocortical carcinoma cells H295R. Interestingly, the availability of pharmacologic inhibitors suggests that EZH2 could be a novel therapeutic target for the treatment of ACC. In parallel, we sought to identify the mechanisms involved in zonation of the adrenal cortex. During adrenal cortex renewal, cells first differentiate as glomerulosa before switching to fasciculata as they move within the cortex. Establishment of glomerulosa identity relies on the Wnt/β-catenin pathway, which induces expression of genes involved in glomerulosa differentiation and inhibits fasciculata identity. These data suggest that β-catenin has to be inhibited in order to allow the lineage conversion from glomerulosa to fasciculata. We thus postulated that PKA signalling pathway, which is triggered by ACTH binding to its receptor MC2R in zona fasciculata, played a role in repressing Wnt/β-catenin signalling to allow fasciculata differentiation. Using pharmacologic and genetic models, we have shown that PKA inhibits β-catenin signalling, which leads to loss of zona glomerulosa and expansion of zona fasciculata. The inhibitor effect of PKA on β-catenin pathway could be the result of decreased expression of Wnt4. Indee, a decrease of Wnt4 expression is observed in response to PKA activation and inactivation of Wnt4 in the adrenal cortex phenocopies PKA activation. We have also shown that PKA inhibits oncogenic effects of β-catenin in the adrenal cortex. The observation of decreased ACTH/PKA signalling in ACC suggests that this inhibition could be relevant to human adrenal tumour development

Les jonctions serrées (JS) maintiennent l'étanchéité de la barrière intestinale et participent à la régulation de la croissance et de la différenciation cellulaire. Nos résultats montrent que certaines protéines transmembranaires des JS, les claudines, sont exprimées de façon différentielle entre le compartiment prolifératif (bas) et le compartiment différencié (haut) des cryptes coliques. En particulier, la claudine-7 présente un gradient d'expression inversé par rapport à celui de plusieurs facteurs de transcription (Tcf-4, Sox-9) essentiels pour le maintien du compartiment prolifératif au fond des cryptes. In vitro, la sur-activation de la voie Wnt/β-caténine/Tcf-4 réprime partiellement l'expression de la claudine-7, entraîne sa délocalisation du niveau basolatéral au niveau des JS et induit la dissociation du complexe avec son partenaire EpCAM. Nous avons également démontré que Sox-9 est un intermédiaire essentiel des effets de la voie Wnt sur la claudine-7, et qu'il exerce un rôle de répresseur sur l'expression de cette protéine in vivo. En contre-partie, la réexpression de la claudine-7 inhibée par Sox-9 entraîne une désorganisation des cellules tumorales coliques polarisées en 3 dimensions. De plus, la claudine-7 module positivement l'activité transcriptionnelle du complexe β-caténine/Tcf-4. Cette situation récapitule celle détectée dans les tumeurs colorectales humaines, où l'expression de la claudine-7 n'est pas réprimée malgré l'importante activité de la voie Wnt et la forte expression de Sox-9. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'existence d'un dialogue fonctionnel entre l'activité de la voie Wnt et l'expression des claudines, et suggèrent que le niveau d'expression et la localisation de la claudine-7 participent à la modulation du degré de polarisation des cellules épithéliales de l'intestin.

La couleur de la peau résulte de la synthèse et de la distribution de la mélanine dans l’épiderme et les poils. La mélanine est un pigment produit par les mélanocytes, des cellules dérivées de la crête neurale. Les mélanocytes transfèrent la mélanine aux kératinocytes environnants et forment l'unité épidermique de mélanisation constituée d’un mélanocyte pour 40 kératinocytes. Les interactions entre les mélanocytes et les kératinocytes sont assurées principalement par la E-CADHÉRINE, une protéine responsable de la formation de jonctions adhérentes entre deux cellules adjacentes. L’ancrage de ses jonctions au cytosquelette est assuré par l’intermédiaire de la β-CATÉNINE. Le rôle de ces protéines n’est pas simplement adhésif, elles interviennent aussi dans de nombreux processus développementaux et assurent le maintien de l’architecture de l’épiderme. De plus, β-CATÉNINE est une protéine centrale de la voie de signalisation WNT/β-CATÉNINE essentielle dans la formation du lignage mélanocytaire. Lors de cette thèse, nous nous sommes intéressés au rôle des protéines E-CADHÉRINE et β-CATÉNINE, d’une part dans l’homéostase des mélanocytes et d’autre part dans le développement embryonnaire d’un type particulier de mélanocytes, ceux peuplant l’extrémité des membres. Dans la première partie, nous avons étudié l’implication de ces protéines dans une leucodermie circonscrite acquise, le Vitiligo. Dans cette pathologie, les mélanocytes disparaissent, générant des zones de peau dépigmentées. L’une des hypothèses invoquées est un défaut adhésion des mélanocytes et leur élimination de la lame basale vers les couches supérieures de l’épiderme. Nous avons montré que la présence de E-CADHÉRINE et β-CATÉNINE à la membrane est altérée dans les mélanocytes Vitiligo avant leur disparition de l’épiderme, au niveau de la peau pigmentée des patients. L’altération de E-CADHÉRINE et β-CATÉNINE à la membrane des mélanocytes est corrélée à une localisation suprabasale de ces cellules et une perturbation de l’unité épidermique de mélanisation. A l’aide de systèmes de peaux reconstruites in vitro et de souris déficientes en E-CADHÉRINE dans les mélanocytes, nous avons démontré un rôle essentiel de E-CADHÉRINE pour l’adhésion des mélanocytes à la lame basale de l’épiderme en présence de stress mécanique et oxydatif, deux facteurs aggravants de la dépigmentation dans le Vitiligo. Nous proposons que l’altération de E-CADHÉRINE est un événement précoce dans la pathologie du Vitiligo qui reste silencieux jusqu’à ce que des stress mécaniques ou oxydatifs accélèrent la perte des mélanocytes (Wagner et al., 2015).Dans la deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux rôles des protéines E-CADHÉRINE et β-CATÉNINE dans le développement embryonnaire des mélanocytes. Nous avons examiné la possibilité de générer des mélanoblastes à partir des dérivés des cellules de crêtes neurales qui emprunteraient la voie ventrale de migration et non la voie dorso-latérale classiquement décrite. Nous avons montré que les mélanoblastes produits à partir de la voie ventrale dérivent de cellules précurseurs se spécifiant à E14 en mélanoblastes ou en cellules de Schwann. A l’aide d’un mutant gain de fonction de β-CATÉNINE, nous avons mis en évidence que l’activation de la signalisation de β-CATÉNINE induit la spécification des mélanocytes au détriment des cellules de Schwann. La E-CADHÉRINE n’intervient pas dans la spécification des mélanoblastes issus de la voie ventrale mais est impliquée dans l’expansion des mélanoblastes issus de la voie dorso-latérale au niveau des membres.Ces résultats démontrent un rôle critique de E-CADHÉRINE et β-CATÉNINE dans l’homéostase des mélanocytes dans des conditions de stress et dans la régulation du développement des mélanocytes
Skin pigmentation results from the synthesis and the distribution of melanin by melanocytes. Melanocytes are neural crest derived cells that produce and transfer melanin to their surrounding keratinocytes. One melanocyte makes contacts with approximately 40 keratinocytes, forming the so-called epidermal melanin unit. Adhesion between melanocytes and keratinocytes is mediated by the adhesive protein E-CADHERIN, which is responsible for the formation of adherens junctions. These junctions are anchored to the cytoskeleton via β-CATENIN. The main function of adhesive proteins is to form cell-cell junctions and to maintain epidermal architecture. β-CATENIN is a central component of the WNT signalling pathway, which is implied in the development of the melanocyte lineage. During this PhD we were interested in the potential roles of E-CADHERIN and β-CATENIN proteins first in melanocyte homeostasis and second in melanocyte development in the mouse limb.In the first part of this PhD project, we studied the role of these proteins in an acquired leuco-derma: the Vitiligo disease. In this disease, depigmented areas appears in the skin due to melano¬cyte loss. One hypothesis for this loss is a defect in adhesive proteins of melanocytes, leading to melanocyte detachment and loss. We examined pigmented skin biopsies of patients with or without Vitiligo and observed that membranous staining of E-CADHERIN and β-CATENIN is absent from, or discontinuously distributed across melanocyte membranes of Vitiligo patients long before clinical lesions appeared. The abnormal distribution of E-CADHERIN correlated with lower melanocyte numbers in the basal epidermal layer and higher melanocyte numbers in the suprabasal layer. Using reconstructed human epidermis and mouse models with defective E-CADHERIN expression in melanocytes, we showed that E-CADHERIN is required for melanocyte adhesiveness to the basal layer under oxidative and mechanical stress. These observations establish a link between pre-clinical, cell-autonomous defects in Vitiligo melanocytes and known environmental stressors accelerating disease onset. Our results implicate a primary predisposing skin defect affecting melanocyte adhesiveness, which under stress conditions, leads to the disappearance of melanocytes and clinical Vitiligo (Wagner et al., 2015).In the second part of this PhD project, we examined the role of these two proteins E-CADHERIN and β-CATENIN in the development of melanoblasts from the ventrally migrating pathway in contrast to the laterally migrating pathway previously described. We observed that ventrally migrating melanoblasts arose from precursors specified at E14 in melanoblasts or Schwann cells. Using a β-CATENIN gain of function mouse model, Tyr::Cre ; bcatΔex3 we observed that β-CATENIN signalling activation induced melanoblast specification at the expense of Schwann cells. We also demonstrated that E-CADHERIN loss in melanocytes (Tyr::Cre ; EcadF/F) decreased dorso-laterally migrating melanoblast expansion in the limb. Taken together, these results point to a critical role for E-CADHERIN and β-CATENIN in maintaining melanocyte homeostasis under stress conditions and regulating melanocyte development

La méduse hydrozoaire Clytia hemisphaerica a une plasticité lui permettant de répondre efficacement à différents types de blessure. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux processus cellulaires et moléculaires au cours de la régénération de l’organe digestif regroupant la bouche et l’estomac (appelé ‘manubrium’) chez cette méduse. J’ai pu observer que la réponse à la blessure se décompose en trois phases successives : la cicatrisation, le remodelage de l’ombrelle rétablissant la forme méduse et la régénération de certains des organes manquants. La régénération du manubrium repose sur la formation d’une zone de prolifération locale et sur des migrations de cellules souches venant des gonades. Des éléments structuraux, notamment les fibres musculaires, jouent un rôle clef dans le repatterning de l’ombrelle et la position du manubrium régénéré. J’ai également généré des données transcriptomiques des premiers stades de la régénération. Ces données ont permis d’identifier des marqueurs de différents types cellulaires du manubrium, et d’observer leur réapparition séquentielle au cours de la régénération. Elles ont également révélé que la voie Wnt/β-caténine est la voie de signalisation présentant l’expression la plus dynamique dans le manubrium en régénération, jouant très certainement un rôle important dans la régénération de cet organe. Les travaux réalisés confirment le potentiel de la méduse Clytia comme modèle de régénération permettant d’adresser de nombreuses questions sur le plan cellulaire et moléculaire, et ainsi de mieux comprendre l’évolution des mécanismes de régénération chez les métazoaires
The hydrozoan jellyfish Clytia hemisphaerica displays very efficient wound repair mechanisms after different types of injury. During my PhD, I investigated in the medusa the cellular and molecular processes involved in the regeneration of the feeding organ, called ‘manubrium’, ensuring the function of the mouth and stomach. I could define three successive phases during the wound response: wound healing, remodeling of the umbrella allowing the rapid recovery of the circular medusae shape, followed by the regeneration of some of the missing organs. Manubrium regeneration relies on local proliferation as well as cell migration from the gonads. Structural elements, especially the muscle fibers, play a key role in the repatterning process of the umbrella and the site of manubrium regeneration. I also generated transcriptomic data covering the early steps of regeneration. These data allowed the identification of markers of different cell types of the manubrium and documentation of their sequential reappearance during regeneration. They also revealed dynamic expression profiles for Wnt/β-catenin pathway components in the regenerating manubrium, strongly suggesting important roles for this pathway during regeneration. This work confirmed the potential of Clytia medusae as an experimental model for studying regeneration, allowing conserved cellular and molecular mechanisms to be uncovered, and our knowledge about the evolution of regeneration mechanisms in metazoans to be expanded

One major reason of CNS pharmacotherapy's impediment is the existence of "barriers" between blood and CNS, especially the Blood-Brain Barrier (BBB), a neurovascular structure localized at the level of brain microvasculature. Main factors responsible for this barrier function are drug efflux transporters type ABC (ATP-Binding Cassette) and SLC (SoLute Carrier) expressed at BBB level and known to be at the origin of multi-drug resistance phenomenon. Recent researches aim at unraveling the signaling mechanisms regulating these transporters in order to modulate their activity and improve pharmacotherapy in brain diseases. For years, these transporters have been studied in adult organism. But, there is a wide spread belief that the BBB in embryo, fetus, new born and infant is "immature", implying caution in giving drugs to infants. However, current knowledge on the functional status of the BBB in immature organism remains very limited.This study was performed in the aim of understanding: 1) The ontogenesis of ABC and SLC transporters during brain maturation, 2) the functional role of four BBB drug efflux transporters (P-glycoprotein (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) in children's brain, and 3) the mechanisms that regulate their functional expression under normal and pathological conditions, mostly under inflammatory conditions, because indeed alterations in structural and functional components of the BBB have been reported in a long list of CNS pathologies in adults. Our results showed changing properties of the BBB during ontogenesis, as well as an age-related differential regulation of BBB drug efflux transporters under normal and inflammatory conditions.These findings highlight the importance of considering an age-related response of CNS to drugs and of taking into account the specific properties of juvenile BBB during definition of therapeutic strategies designed to treat childhood brain diseases, and this in the clinical perspective of developing new drugs with enhanced efficacy in children's CNS.

Dans ce mémoire, nous présentons l’utilisation de techniques de model-checking pour l’inférence de paramètres de réseaux de régulation génétique (GRN) et l’analyse formelle d’une voie de signalisation. Le coeur du mémoire est décrit dans la première partie, dans laquelle nous proposons une approche pour inférer les paramètres biologiques régissant les dynamiques de modèles discrets de GRN. Les GRN sont encodés sous la forme d’un méta-modèle, appelé GRN paramétré, de telle façon qu’une instance de paramètres définit un modèle discret du GRN initial. Sous réserve que les propriétés biologiques d’intérêt s’expriment sous la forme de formules LTL, les techniques de model-checking LTL sont combinées à celles d’exécution symbolique et de résolution de contraintes afin de sélectionner les modèles satisfaisant ces propriétés. L’enjeu est de contourner l’explosion combinatoire en terme de taille et de nombre de modèles discrets. Nous avons implémenté notre méthode en Java, dans un outil appelé SPuTNIk. La seconde partie décrit une collaboration avec des neuropédiatres, qui ont pour objectif de comprendre l’apparition du phénotype protecteur ou toxique des microglies (un type de macrophage du cerveau) chez les prématurés. Cette partie exploite un autre versant du model-checking, celui du modelchecking statistique, afin d’étudier un type de réseau biologique particulier : la voie de signalisation Wnt/β-caténine, qui permet la transmission d’un signal de l’extérieur à l’intérieur des cellules via une cascade de réactions biochimiques. Nous présentons ici l’apport du model-checker stochastique COSMOS, utilisant la logique stochastique à automate hybride (HASL), un formalisme très expressif nous permettant une analyse formelle sophistiquée des dynamiques de la voie Wnt/β-caténine, modélisée sous la forme d’un processus stochastique à événements discrets
In this thesis, we present the use of model checking techniques for inference of parameters of Gene Regulatory Networks (GRNs) and formal analysis of a signalling pathway. In the first and main part, we provide an approach to infer biological parameters governing the dynamics of discrete models of GRNs. GRNs are encoded in the form of a meta-model, called Parametric GRN, such that a parameter instance defines a discrete model of the original GRN. Provided that targeted biological properties are expressed in the form of LTL formulas, LTL model-checking techniques are combined with symbolic execution and constraint solving techniques to select discrete models satisfying these properties. The challenge is to prevent combinatorial explosion in terms of size and number of discrete models. Our method is implemented in Java, in a tool called SPuTNIk. The second part describes a work performed in collaboration with child neurologists, who aim to understand the occurrence of toxic or protective phenotype of microglia (a type of macrophage in the brain) in the case of preemies. We use an other type of model-checking, the statistical model-checking, to study a particular type of biological network: the Wnt/β- catenin pathway that transmits an external signal into the cells via a cascade of biochemical reactions. Here we present the benefit of the stochastic model checker COSMOS, using the Hybrid Automata Stochastic Logic (HASL), that is an very expressive formalism allowing a sophisticated formal analysis of the dynamics of the Wnt/β-catenin pathway, modelled as a discrete event stochastic process

Les lésions surrénaliennes surviennent dans la population générale à une fréquence d’environ 2-3%. Parmi les anomalies génétiques identifiées jusqu’à présent dans les tumeurs surrénaliennes, les mutations somatiques de β-caténine sont les plus prévalentes. Elles sont présentes dans environ 20% des adénomes et carcinomes cortico-surrénaliens. β-caténine est l’élément central de la voie canonique de WNT qui joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, l’homéostase et la tumourigenèse. Les mutations activatrices de β-caténine conduisent à l’accumulation nucléaire de β- caténine qui interagit avec les TCF/LEF-1 qui active la transcription des gènes cibles. Les gènes cibles de β-caténine, varient et dépendent du contexte cellulaire. Dans la glande surrénale, les gènes cibles de β-caténine sont inconnus. Nous avons effectué des études de microarray qui nous ont permis d’identifier 490 transcrits dérégulés dans les adénomes corticosurrénaliens porteurs de mutations ponctuelles de β-caténine. L’expression aberrante d’ISM1, RALBP1, PDE2A, CDH12, ENC1, PHYHIP et CITED2 dans les adénomes porteurs de mutations de β-caténine a été confirmée par PCR en temps réel. Le traitement des cellules humaines de carcinome cortico-surrénalien H295R (mutation de CTNNB1, Ser45Prol) avec les inhibiteurs de β-caténine/TCF (PKF115-584 et PNU74654) ont confirmé l'implication de β-caténine dans la régulation transcriptionelle d’ISM1, RALBP1, PDE2A, ENC1 et CITED2. En conclusion, nos travaux ont conduit à l’identification de nouveaux gènes cibles de β-catenin impliqués dans la tumourigenèse cortico-surrénalienne.
Adrenal lesions occur in the general population at a prevalence of about 2-3%. Several mutations have been identified in adrenocortical tumours. β-catenin mutations were recently found to be the most frequent genetic alteration in both sporadic adrenocortical adenomas and carcinomas (20-30%). β-catenin is the central player in canonical Wnt signaling which plays a key role in organ/ gland development, maintenance of homeostasis and tumourigenesis. Activation of Wnt signaling by altered regulation of β-catenin levels evokes -catenin accumulation in the nucleus, and interaction with the TCF/LEF-1 proteins that activates the transcription of target genes. These target genes are believed to be highly cell and context specific and are linked to developmental and cell cycling functions. β-catenin target genes in adrenocortical tumours are unknown. Using microarray technology, we found 490 transcripts that are deregulated in adrenocortical adenomas harbouring β-catenin activating mutations in comparison to non mutated adenomas and normal adrenal glands. These genes differ highly in function and many are poorly characterized genes. Differential expression of ISM1, RALBP1, PDE2A, CDH12, ENC1, PHYHIP and CITED2 in adenomas with activating β-catenin mutations was confirmed by real-time PCR. Treatment of human adrenocortical carcinoma cells, H295R (CTNNB1 Ser45Prol), with β-catenin/TCF inhibitors (PKF115-584 and PNU74654) further confirmed the implication of β-catenin on the transcriptional regulation of ISM1, RALBP1, PDE2A, ENC1 and CITED2. In conclusion, we have found new potential β-catenin target genes that may be involved in adrenocortical tumourigenesis.

L’ostéoporose est une maladie caractérisée par une faible masse osseuse et une détérioration du tissu osseux. Cette condition entraîne une plus grande fragilité osseuse et des risques de fractures. Plusieurs études ont associé l’ostéoporose à la faible densité osseuse des mandibules, à la perte d’attache parodontale, à l’augmentation de la hauteur de la crête alvéolaire et à la chute des dents. Cette étude vise à comprendre les mécanismes sous-jacents cette perte osseuse. En effet, au cours du développement des souris, PITX1 joue un rôle clé dans l'identité des membres postérieurs et dans le bon développement des mandibules et des dents. Son inactivation complète chez la souris mène à un phénotype squelettique sévère. Tandis que, son inactivation partielle provoque des symptômes apparentés à l'arthrose avec une augmentation de la masse osseuse au niveau de l’os cortical et de l’os trabéculaire. Inversement, une étude antérieure chez des jumelles monozygotiques discordantes pour l’ostéoporose, montrent une augmentation d’environ 8.6 fois du niveau d’expression du gène Pitx1 chez la jumelle ostéoporotique. Collectivement, ces données nous ont poussés à investiguer sur le rôle du facteur de transcription PITX1 dans le métabolisme osseux normal et pathologique. Dans ce contexte, des souris transgéniques Col1α1-Pitx1 sur-exprimant Pitx1 spécifiquement dans le tissu osseux sous le promoteur du collagène de type-I (fragment 2.1kpb) ont été générées et phénotypiquement caractérisées. Ces résultats ont révelé que les souris transgéniques Col1α1-Pitx1 présentaient un phénotype similaire à celui des patients ostéoporotiques accompagné d'une perte de dents et des problèmes dentaires et parodontaux. De plus, cette étude a révélé que la surexpression de Pitx1 induit une altération de l’homéostasie osseuse via l’inactivation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique. Cette hypothèse a été appuyée par le fait que le traitement des souris transgéniques Col1α1-Pitx1 avec du chlorure de lithium, un activateur de la voie Wnt canonique, prévient le phénotype ostéoporotique chez ces souris. Finalement, cette étude établit un rôle crucial de PITX1 dans la régulation de la masse osseuse et une implication possible dans l’ostéoporose et les maladies parodontales via l’inactivation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique.
Osteoporosis is a progressive bone disease that is characterized by a decrease in bone mass and density leading to an increased risk of fracture. Several studies have linked osteoporosis to the low bone density of the mandibles, the periodontal attachment loss, increasing of the alveolar crest heigh and tooth loss. This study aims to understand the mechanisms underlying bone loss. During mouse development, PITX1 plays a key role in the identity of the hindlimb and the proper development of the jaws and teeth. Interestingly, PITX1-null mice displayed severe skeletal phenotype. Whereas, ageing PITX1+/- progressively developed OA-like lesions in cartilage associated with a drastic increase in cortical and trabecular bone formation. Conversely, expression analysis of osteoblasts derived from monozygotic twins discordant for osteoporosis reported an 8.6-fold up-regulation of Pitx1 expression in osteoblasts from osteoporotic twins when compared with healthy ones. Collectively, these data prompted us to investigate the role of PITX1 in normal and pathological bone metabolism. In this context, transgenic Col1α1-Pitx1 mice over expressing Pitx1 specifically in bone tissue under the type-I collagen promoter (2.3kb fragment) were generated and phenotypically characterized. These data suggested that Pitx1 overexpression induces an osteoporosis like phenotype accompanied with oral bone loss, edentulousness, dental and periodontal problems. These results suggested that Pitx1 overexpression induces alteration of bone homeostasis via the inactivating of the the Wnt/β-catenin canonical pathway. This hypothesis was supported by the fact that treatment with lithium chloride, a Wnt canonical activator, rescued the phenotype. Finally, this study establishes a crucial role of PITX1 in the regulation of bone mass and a possible involvement in the developpement of osteoporosis and periodontal disease via the inactivation of the Wnt/β-catenin canonical pathway.