Academic literature on the topic 'WD 2200'

AbstractWilson’s disease (WD) is a rare hereditary disorder of copper metabolism. Some data suggest that iron metabolism is disturbed in WD and this may affect the course of the disease. The current study aimed to determine whether anti-copper treatment could affect iron metabolism in WD. One hundred thirty-eight WD patients and 102 controls were examined. Serum ceruloplasmin and copper were measured by colorimetric enzyme assay or atomic adsorption spectroscopy, respectively. Routine and non-routine parameters of iron metabolism were measured by standard laboratory methods or enzyme immunoassay, respectively. WD patients, both newly diagnosed and treated, had less serum copper and ceruloplasmin than controls (90.0, 63.0, 22.0 mg/dL, respectively, p < 0.001); in the treated patients blood copper and ceruloplasmin were lower than in untreated patients (p < 0.001). Untreated patients (n = 39) had a higher median blood iron (126.0 vs 103.5 ug/dL, p < 0.05), ferritin (158.9 vs 47.5 ng/mL, p < 0.001), hepcidin (32, 6 vs 12.1 ng/mL, p < 0.001) and sTfR (0.8 vs. 0.7 ug/mL, p < 0.001) and lower blood transferrin (2.4 vs. 2.7 g/L, p < 0.001), TIBC (303.0 vs 338.0 ug/dL, p < 0.001), hemoglobin (13.1 vs 13.9 g/dL, p < 0.01) and RBC (4.3 vs. 4.6, p < 0.002) than controls. Treated patients (n = 99) had a significantly lower median iron (88.0 vs. 126.0 ug/dL, p < 0.001), ferritin (77.0 vs. 158.9 ng/mL, p < 0.005) and hepcidin (16.7 vs. 32.6 ng/mL, p < 001) and higher transferrin (2.8 vs. 2.4 g/L, p < 0.005), TIBC (336.0 vs 303.0 ug/dL, p < 0.001), RBC (4.8 vs. 4.3 M/L, p < 0.001) and hemoglobin (14.4 vs. 13.1 g/dL, p < 0.001) than untreated; the median iron (p < 0.005) was lower, and ferritin (p < 0.005), RBC (p < 0.005) and hepcidin (p < 0.002) were higher in them than in the control group. Changes in copper metabolism are accompanied by changes in iron metabolism in WD. Anti-copper treatment improves but does not normalize iron metabolism.

We studied the dust structures in 100 micron infrared image around the white dwarf WD 1003-441. The post Asymptotic Giant Branch (AGB) emission of the white dwarf's precursors' wind and the ambient interstellar matter is studied. For this, distribution of the relative flux density is studied and analyzed in the context of the dust color temperature, mass loading trend and the amount of total mass deposited due the interaction in the interstellar medium. The 100 micron far-infrared image is provided by the Groningen server of Infrared Astronomical Satellite (IRAS) survey. The curved emission structure at 100 micron in the region of interest is probably due to the interaction between the ambient interstellar medium and the He-flashes of the parent planetary nebula of the central white dwarf WD 1003-441. This white dwarf is a PG1159 star with 9-11 detected periods and an associated planetary nebula mass ejection. The total mass of the filamentary arc is found to be ~ 8 x 10-2 solar masses, as predicted. The mass loss rate of the post AGB star goes up to 10-5 solar masses per year. It is concluded that the first He-flash occurred at least ~1000 years ago. The amount of total mass around this white dwarf is about ~ 0.134 solar mass. The maximum and minimum dust color temperature around the white dwarf is found to be 19.0 K (±1.5 K) and 22.0 K (±2.0 K), respectively.Key-Words: White dwarf; Interstellar medium; Flux density; Interstellar dust; Mass of the gasThe Himalayan Physics Vol.2, No.2, May, 2011Page: 5-10Uploaded Date: 31 July, 2011

Recent evidence supports a role for microRNA-223 (miR-223) in modulating tumor cell sensitivity to chemotherapeutic drugs; however, its role in cellular resistance to the effects of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs) used in treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) remains to be elucidated. The levels of miR-223 in parental cell line (HCC827) and erlotinib resistant HCC827 cell line (HCC827/ER) were detected by qRT-PCR. HCC827/ER cells were treated with MK-2206 to block the Akt signaling pathway or RO4929097 to block the Notch signaling pathway, and then transfected with an miR-223 inhibitor or interference expression plasmid of F-Box/WD repeat-containing protein 7 (FBXW7) or insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). HCC827 cells were transfected with miR-223 mimics. Next, CCK-8, colony formation, and flow cytometric apoptosis assays were used to assess cell resistance to erlotinib. When compared with its expression in HCC827 cells, miR-223 expression was significantly up-regulated in HCC827/ER cells. Blocking either the Akt or Notch signaling pathway and reducing miR-223 expression resulted in decreased resistance in HCC827/ER cells. Conversely, increasing miR-223 expression induced cell resistance to erlotinib in HCC827 cells. miR-223 enhanced resistance to erlotinib by down-regulating FBXW7 expression. Reducing FBXW7 expression lowered resistance to erlotinib in HCC827/ER cells, while interference with expression of IGF1R produced no significant effect. This study demonstrated that NSCLC cells can up-regulate their levels of miR-223 expression via the Akt and Notch signaling pathways. miR-223 may serve as an important regulator of erlotinib sensitivity in NSCLC cells by targeting FBXW7.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt.<br>Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

Zellen enthalten zahlreiche Enzyme, deren Reaktionen von molekularem Sauerstoff abhängen. Oft sind deren aktive Zentren tief im inneren des Proteins verborgen, was die Frage nach spezifischen Zugangskanälen, die den Sauerstoff gezielt zum Ort der Katalyse leiten, aufwirft. In der vorliegenden Arbeit wird dies am Beispiel der 12/15-Lipoxygenase, als ein typisches Beipiel Sauerstoff verbrauchender Enzyme, untersucht. Die Sauerstoffverteilung innerhalb des Proteins wurde bestimmt und mögliche Routen für den Sauerstoffzugang definiert. Zu diesem Zweck wurden theoretische Untersuchungen eng mit Experimenten verzahnt. Zuerst wurden Molekulardynamik Simulationen des Proteins in Lösung durchgeführt. Aus den Trajektorien konnte die dreidimensionale Verteilung der Freien Enthalpie für Sauerstoff berechnet werden. Die Analyse der günstigsten Pfade in dieser Energielandschaft führte zur Identifikation von vier Sauerstoffkanälen im Protein. Alle Kanäle verbinden die Proteinoberfläche mit einem Gebiet hoher Sauerstoffaffinität am aktiven Zentrum. Diese Region liegt bezüglich des Substrats gegenüber dem Eisenzentrum, wodurch eine strukturelle Erklärung für die Reaktionsspezifität des Enzyms gegeben ist. Der katalytisch bedeutsamste Weg des Sauerstoffs kann durch L367F Austauschmutation blockiert werden, was zu einer stark erhöhten Michaelis-Konstante für Sauerstoff führt. Diese experimentell nachgewiesene Blockade konnte, mit Hilfe entsprechender Molekulardynamik Simulationen, durch eine Umordnung eines Wasserstoffbrücken-Netzwerks von Wassermolekülen innerhalb des Protein im Detail erklärt werden. Die Ergebnisse ermöglichen den Schluss, dass die Hauptroute für Sauerstoff zum aktiven Zentrum des Enzyms einem Kanal folgt, der aus vorübergehend verbundenen Hohlräumen besteht. Hierbei unterliegt das Öffnen und Schließen des Kanals der Dynamik der Proteinseitenketten.<br>Cells contain numerous enzymes utilizing molecular oxygen for their reactions. Often, their active sites are buried deeply inside the protein which raises the question whether there are specific access channels guiding oxygen to the site of catalysis. In the present thesis this question is investigated choosing 12/15-lipoxygenase as a typical example for such oxygen dependent enzymes. The oxygen distribution within the protein was determined and potential routes for oxygen access were defined. For this purpose an integrated strategy of structural modeling, molecular dynamics simulations, site directed mutagenesis, and kinetic measurements has been applied. First, molecular dynamics simulations of the protein in solution were performed. From the trajectories, the 3-dimensional free-energy distribution for oxygen could be computed. Analyzing energetically favorable paths in the free-energy map led to identification of four oxygen channels in the protein. All channels connect the protein surface with a zone of high oxygen affinity at the active site. This region is localized opposite to the non-heme iron providing a structural explanation for the reaction specificity of this lipoxygenase isoform. The catalytically most relevant path can be obstructed by L367F exchange which leads to a strongly increased Michaelis constant for oxygen. This experimetally proven blocking mechanism can, by virtue of molecular dynamics studies, be explained in detail through a reordering of the hydrogen bonding network of water molecules. As a conclusion, the results provide strong evidence that the main route for oxygen access to the active site of the enzyme follows a channel formed by transiently interconnected cavities whereby the opening and closure is governed by sidechain dynamics.

In Eukaryoten werden sekretorische Proteine an zytoplasmatischen Ribosomen synthetisiert und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie ihre biologisch aktive Struktur erhalten. Defekte Proteine, die durch Fehler in diesem Reifungsprozess entstehen, werden über den Prozess der „ER-assoziierten Protein Degradation“ (ERAD) abgebaut. Eine zentrale Komponente dieses Abbauweges ist die HRD‑Ligase, ein membranständiger Proteinkomplex, der das E3‑Enzym Hrd1 enthält. Einige publizierte Arbeiten lassen eine Beteiligung der Transmembrandomäne von Hrd1 an einem neuartigen Transportsystem für den Export von fehlgefalteten Proteinen aus dem ER vermuten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die Bedeutung der Transmembranregion von Hrd1 für den Abbau von ERAD‑Substraten in dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden. Die Substitution von zwei Aminosäuren in der dritten Transmembranhelix von Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) hemmt spezifisch den Abbau von fehlgefalteten ER-luminalen Proteinen, während die Prozessierung membrangebundener Hrd1-Substrate weitestgehend unbeeinflusst blieb. Daher zeigt die Hrd1‑Variante wahrscheinlich eine Störung im Transport von luminalen ERAD‑Substraten durch die ER Membran. Biochemische Analysen zeigen keine starken Veränderungen bei der Zusammensetzung der HRD-Ligase durch die Hrd1‑Variante. Allerdings ließen sich bei Anwendung von zielgerichtetem in vivo photocrosslinking deutliche Veränderungen in der räumlichen Orientierung der Ligaseuntereinheit Der1 zu Hrd1E84L, H101L beobachten. Da Der1 ausschließlich für den Abbau ER-luminaler ERAD-Substrate benötigt wird ist anzunehmen, dass die korrekte Ausrichtung von Der1 zu Hrd1 innerhalb der ER-Membran eine Voraussetzung für den Transport von ERAD‑Substraten in das Zytoplasma ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals einen direkten Einfluss der Transmembranregion von Hrd1 auf den Abbau luminaler ERAD‑Zielproteine.<br>In eukaryotes, secretory proteins are synthesized on cytoplasmic ribosomes and transported into the endoplasmic reticulum (ER), where they obtain their biologically active structure. Defect proteins that arise from errors in this maturation process are degraded by the “ER-associated protein degradation” (ERAD) pathway. A central component of ERAD is the HRD-ligase, a membrane-bound protein complex that contains the ubiquitin ligase Hrd1. Some published work raised speculations on an involvement of this trans-membrane domain in a novel transport system for the export of misfolded proteins from the ER. In the course of this work new insights for the importance of the transmembrane domain of Hrd1 for the degradation of ERAD substrates in the model organism Saccharomyces cerevisiae were obtained. The substitution of two amino acids in the third trans-membrane helix of Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) specifically impairs the turnover of misfolded ER-luminal proteins whereas the processing of membrane-bound Hrd1 substrates remained largely unaffected. The Hrd1 variant therefore displays most likely a defect in the transport of luminal ERAD substrates through the ER membrane. No major changes in the assembly of the HRD-ligase by the Hrd1 variant were detected. Still, in site specific in vivo photo-crosslinking assays substantial changes in the spatial orientation of the ligase subunit Der1 towards Hrd1E84L, H101L were detected. Der1 is exclusively required for the degradation of ER-luminal ERAD substrates. This implies that the proper alignment of Hrd1 and Der1 within the ER membrane is a prerequisite for the transport of ERAD substrates into the cytoplasm. This work shows for the first time a direct involvement of the trans-membrane region of Hrd1 in the degradation of luminal ERAD client proteins.

Seit mehr als 10 Jahren kann biologische Aktivität durch eine Vielzahl photosensorischer Proteine beeinflusst werden. In diesem als Optogenetik bezeichneten Forschungsgebiet, werden Kationen leitende Kanalrhodopsine (CCRs) als lichtinduzierte neuronale Aktivatoren eingesetzt. Diese Arbeit soll zur Vervollständigung von optogenetischen Werkzeugen durch die Entwicklung Anionen leitender Kanalrhodopsine (ACRs) dienen, um die bestehenden Nachteile mikrobieller lichtgetriebener Ionenpumpen zu überwinden, die bislang zur neuronale Inhibition genutzt wurden. Der Austausch von E90 in C. reinhardtii Kanalrhodopsin 2 (CrChR2) durch positiv geladene Aminosäuren führte zu Entwicklung Chlorid leitender ChRs (ChloCs), die jedoch eine Restkationen-permeabilität aufwiesen. Durch Substitution zweier weiterer negativen Ladungen innerhalb des Ionenpermeationsweges, konnte die Kationenleitung vollständig aufgehoben werden. Parallel wurde durch A. Berndt et al. ein inhibitorisches C1C2 (iC1C2), basierend auf der CrChR1/2 Chimäre entwickelt. Wie auch bei den ChloCs, zeigte iC1C2 verbesserungswürdige biophysikalische Eigenschaften. Mutagenesestudien des Ionenpermeationsweges führten zur Entwicklung der verbesserten Nachfolgervariante iC++. Um ausgehend von weiteren CCRs neuartige ACRs zu entwickeln (eACRs), wurden die zuvor angewandten Mutagenesestrategien auf weitere CCRs übertragen. Zwei neue eACRs, Phobos und Aurora, mit jeweils blau- und rotverschobenen Aktionsspektrum konnten generiert werden. Bistabile eACRs wurden erzeugt, die ein lichtgesteuertes Schalten zwischen offenen und geschlossenen Zuständen ermöglichen. Schlussendlich wurde ein natürlich vorkommendes ACR (nACR) aus Proteomonas sulcata (PsACR1) identifiziert und charakterisiert. Die Maximalaktivität von PsACR1 zählt mit 540 nm zu den am stärksten rotverschobenen unter den nACRs. Elektrophysiologische und spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich der Photozyklus von PsACR1 signifikant von jenen der CCRs unterscheidet.<br>For more than 10 years, photosensory proteins have developed as powerful tools to manipulate biological activity. In this research field termed optogenetics, cation-conducting channelrhodopsins (CCRs) mainly are utilized as light-induced neural activators. This study aimed at a complementation of the optogenetic tool box by engineering anion-conducting channelrhodopsins (ACRs) to overcome the existing drawbacks of microbial light-driven ion pumps utilized for neural inhibition so far. Replacement of E90 in the cation-conducting C. reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) with positively charged residues reversed the ion selectivity and yielded chloride-conducting ChRs (ChloCs). Applied in neuronal cell culture, ChloCs showed residual cation permeability occasionally leading to excitation instead of the desired inhibition. Further charge elimination within the ion permeation pathway completely abolished cation conduction. In parallel, an inhibitory C1C2 (iC1C2) was developed by A. Berndt et al. based on a CrChR1/2 chimera. Though, iC1C2 displayed unsatisfactory biophysical properties as well. Further mutational modifications of the ion permeation pathway led to the development of the improved successor variant iC++. A systematic transfer of both conversion strategies to other CCRs was conducted to create engineered ACRs (eACRs) with distinct biophysical properties. Two novel eACRs, Phobos and Aurora, with blue- and red-shifted action were obtained. Additionally, step-function mutations greatly enhanced the operational light sensitivity and enabled temporally precise toggling between open and closed states using two different light colors. Finally, a natural ACR (nACR) originating from Proteomonas sulcata (PsACR1) was identified and characterized. With a maximum activation at 540 nm it is one of most red-shifted nACRs. Single turnover electrophysiological measurements and spectroscopic investigations revealed an unusual photocycle compared to that of CCRs.

Kanalrhodpsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkanäle, welche als primäre Fotorezeptoren in Grünalgen dienen. In der Optogenetik werden ChRs verwendet um neuronale Membranen zu depolarisieren und mit Licht Aktionspotentiale auszulösen. Das mit blauem Licht aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodopsin 2 (C2) und effiziente Mutanten wie C2 H134R stellen die am häufigsten genutzten depolarisierenden, optogenetischen Werkzeuge dar. Komplementär zu ChRs werden Protonen- und Chloridpumpen aus Archaebakterien zur neuronalen Inhibierung durch lichtinduzierte Hyperpolarisation verwendet. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die ChR-Chimäre C1V1, ein grünlichtaktiviertes ChR, das sich durch hervorragende Membranlokalisierung und hohe Fotoströme in HEK-Zellen auszeichnet. C1V1 und C1V1-Mutanten mit feinabgestimmten spektralen und kinetischen Eigenschaften ermöglichen die neuronale Aktivierung mit Wellenlängen bis 620 nm sowie die unabhängige Aktivierung zweier Zellpopulationen in Kombination mit C2. Um die strukturelle Basis von Kanalöffnung und Ionentransport in ChRs zu verstehen, wurden gezielt Mutationen in C2 und C1V1 eingeführt. Die Fotoströme der entsprechenden Mutanten wurden auf Kationenselektivität und kinetische Veränderungen untersucht. Während Aminosäuren, die den Kanal an der zytosolischen Seite begrenzen, die Kationenfreisetzung und Einwärtsgleichrichtung der ChRs bestimmen, spielen zentral im Kanal gelegende Aminosäuren ein entscheidende Rolle für Kationenselektivität und -kompetition. Ein enzymkinetisches Modell ermöglichte außerdem die Zerlegung der Fotoströme in Beiträge der verschiedenen, konkurrierenden Kationen. Im letzten Teil der Arbeit wurde pHoenix, ein optogenetisches Werkzeug zur Ansäuerung synaptischer Vesikel, entwickelt. In Neuronen des Hippocampus wurde pHoenix verwendet, um die treibenden Kräfte für die vesikuläre Neurotransmitteraufnahme sowie den Zusammenhang zwischen Vesikelfüllstand und Freisetzungswahrscheinlichkeit zu analysieren.<br>Channelrhodopsins (ChRs) are light-activated cation channels functioning as primary photoreceptors in green algae. In the emerging field of optogenetics, ChRs are used to depolarize neuronal membranes, thus allowing for light-induced action-potential firing. The blue light-activated Chlamydomonas channelrhodopsin 2 (C2) and high-efficiency mutants such as C2 H134R represent the most commonly used depolarizing optogenetic tools. Complementary to ChRs, green to yellow light-activated proton and chloride pumps originating from archea enable neuronal inhibition by membrane hyperpolarization. In the present work, we developed the chimeric ChR C1V1, a green-light activated ChR with excellent membrane targeting and high photocurrents in HEK cells. Action spectrum and kinetic properties of C1V1 were further fine-tuned by site-directed mutagenesis. The ensemble of C1V1 variants allows for neuronal activation with wavelengths up to 620 nm and can be used in two-color optogenetic experiments in combination with C2 derivatives. In order to understand the structural motifs involved in channel gating and ion transport, conserved residues in C2 and C1V1 were mutated and photocurrents of the respective mutants were analyzed for kinetic characteristics and cation selectivity. In these experiments, residues of the inner gate region were shown to alter cytosolic cation release and inward rectification, whereas central gate residues determine cation competition and selectivity, as well as the equilibrium between the two open channel conformations. Moreover, an enzyme-kinetic model was used to quantitatively dissect ChR photocurrents into the contribution of different competing cations. Finally, we designed pHoenix, an optogenetic tool enabling green-light induced acidification of synaptic vesicles. In hippocampal neurons, pHoenix was used to study both the energetics of vesicular neurotransmitter uptake and the impact of the vesicular contents on synaptic vesicle release.

Der zerstörungsfreien Charakterisierung und Analyse von lebenden humanen Zellen über längere Zeiträume kommt zukünftig in Medizin und Biotechnologie eine zentrale Rolle zu. Für eine therapeutische Nutzung müssen die Zellen nach der Analyse unverändert und vital vorliegen. Ein Ansatz beruht auf der Analyse von nanoskopischen Zellrückständen, die von Zellen während der Migration hinterlassen werden, den Zellspuren. Diese spiegeln in repräsentativer Weise die Merkmale der Erzeugerzelle wider. Für die technische Nutzung muss der Entstehungsprozess reproduzierbar kontrolliert werden können. Im Zusammenhang wurde ein Versuchsaufbau zur Beobachtung der dynamischen Prozesse Adhäsion, Migration und substratnahe Organisation des Zytoskeletts von lebenden Zellen entwicklet, der hochauflösende Langzeitbeobachtungen mittels Totaler Interner Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie ermöglicht. Zur Auswertung wurde eine auf Falschfarben beruhende Darstellungsweise der dynamischen Prozesse entwickelt. Es konnte eine Korrelation der Eigenschaften der Zellspuren mit dem Adhäsions- und Migrationsverhalten, sowie dem Aufbau der substratnahen Bereiche des Zytoskeletts der Erzeugerzellen nachgewiesen werden. Ebenso wurde der Einfluss der oberflächenspezifischen Substrateigenschaften (Beschichtung oder topografische Strukturierung) auf die Zellspurablage gezeigt.<br>Nondestructive characterisation and analysis of human living cells over a long period will be an important issue for medicin and biotechnology in the near future. In order to use the cells after analysis for therapeutical applications, the cells have to be unmodified and still alive after the analytical procedure. The analysis of nanoscopic cell residues, called cell traces, which are left behind during cell migration represent an appropriate approach. Attributes of the donor cell are shown by the cell trace characteristically. In order to use cell traces for biotechnological applications the formation and deposition of cell traces has to be repeatable. Thus, an experimental set up using Total Internal Fluorescence Microscopy (TIRF) has been established to observe the dynamic processes of cell adhesion, cell migration and the organisation of the cytoskeleton used therein. Using miscolours a new embodiment has been developed to evaluate dynamic processes. Cell adhesion, cell migration and the organisation of the actin cytoskeleton of the donor cells have been found to influence the attributes of cell traces. Further specific modified surfaces have been used to influence the deposition of cell traces. Effects have been shown for coated surfaces or surfaces with a topographic structure.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, welche nach Absorption eines Photons durch den Retinal-Cofaktor einen passiven Ionentransport über die Zellmembran katalysieren. Im Zuge von optogenetischen Anwendungen wird diese Reaktion für die Beeinflussung der Ionenhomöostase von verschiedenen Zelltypen und Geweben ausgenutzt. Zu Beginn dieser Arbeit wurden lichtinduzierte Strukturänderungen und Protontransferschritte in einem breiten Zeitbereich (Nanosekunden bis Minuten) in dem grün-absorbierenden ChR ReaChR mithilfe von stationärer und transienter UV-vis- und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) untersucht. Auf Basis der experimentellen Daten wurde ein komplexes Photozyklus-Modell konzipiert. Anschließend wurde die IR-aktive, nichtkanonische Aminosäure p-Azido-L-phenylalanin (azF) mittels Stopp-Codon-Suppression ortsspezifisch an mehreren Positionen innerhalb der vermuteten ionenleitenden Kanalpore in ReaChR inkorporiert und mit FTIR untersucht. azF ist sensitiv gegenüber Polaritätsänderungen und absorbiert in einem hochfrequenten Bereich (~2100 cm-1). Aufgrund der großen spektralen Separation zu endogenen Proteinschwingungen (< 1800 cm-1) können globale Konformations- und lokale Hydratisierungsänderungen simultan detektiert werden. Die erhobenen Daten leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung einer temporären Wasserpore in ChRs und demonstrieren zum ersten Mal den erfolgreichen in-vivo-Einbau einer artifiziellen Aminosäure in mikrobielle Rhodopsine und dessen schwingungsspektroskopische Analyse. Die Methode bietet aufgrund ihrer hohen Ortsauflösung ein großes Potential für die Studie von Mikroumgebungen innerhalb komplexer Proteinensemble.<br>Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels. Upon absorption of a photon, the retinal chromophore isomerizes and drives conformational changes within the protein, which lead to a passive ion transport across the cell membrane. This capability is used for optogenetic applications to manipulate ionic homeostasis of different cell types and entire organisms. Within the work, light-induced structural changes and proton transfer steps were studied in the green-absorbing ChR ReaChR in great detail by steady-state and transient UV-vis and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The data were merged into a complex photocycle model. Next, the IR-active, unnatural amino acid p-azido-L-phenylalanine (azF) was site-specifically introduced at several sites of the putative ion pore of ReaChR by stop codon suppression. azF is sensitive to polarity changes and absorbs in a clear spectral window lacking endogenous protein vibrations. Thus, FTIR measurements of labeled mutants report for global conformational changes (< 1800 cm-1) and local hydration changes (~2100 cm-1) simultaneously. The presented findings reveal crucial insights regarding formation of a transient water pore in ChRs and demonstrate the first report of the successful in-vivo incorporation of an artificial amino acid into a microbial rhodopsin and its subsequent spectroscopic investigation. Additionally, the so far unprecedented spatial resolution renders this methodology superior over conventional FTIR methods to study microenvironments within complex protein ensembles.

Die lebenden Organismen sind für eine wissenschaftliche Analyse zu kompliziert, wenn man sie als Ganzes und in ihrer vollen Komplexität betrachtet. Die vorliegende Arbeit behandelt die topologischen Eigenschaften von zwei wichtigen Teilen der lebenden Organismen: die metabolischen und die regulatorischen Systeme. Topolgische Eigenschaften sind solche, die durch die Netwerkstruktur bedingt werden. Ein Signalsystem ist eine spezielle Art von regulatorischem System. Zwischen den metabolischen und Signalnetzen gibt es wichtige Unterschiede, die ihre Behandlung in unterschiedlicher Weise erfordert. In der metabolischen Pfadanalyse ist das Konzept der elementaren Flussmoden bereits als ein passendes Instrument für die Charakterisierung der einfachsten essentiellen Wege in biochemischen Systemen etabliert. Wir untersuchen die Eigenschaften und Vorteile dieses Konzepts in einigen besonderen Fällen. Zuerst untersuchen wir die vielfach vorkommenden Enzyme mit niedriger Spezifität (z.B. Nukleosiddiphosphokinase, Uridinkinase, Transketolase, Transaldolase). Sie können parallel verschiedene Substrate und Produkte umwandeln. Auch die Enzym-Mechanismen sind vielfältig, wie wir mit dem Reaktionsschema für bifunktionelle Enzyme veranschaulichen. Wir betrachten dabei nur den Fall, dass ein bestimmtes aktives Zentrum mehrere Reaktionen katalysiert. Der Fall, dass das studierte Enzym mehrere solche aktiven Zentren hat, kann in den Fall mehrerer Enzyme transformiert werden, die nur ein aktives Zentrum haben. Wenn eine Krankheit das Ausgangsenzym ändert, werden dann in der Analyse auch alle ersetzenden Enzyme geändert. Es gibt zwei unterschiedliche Betrachtungsweisen, um multifunktionelle Enzyme zu beschreiben. Zum einen kann man die Gesamtreaktionen betrachten und zum anderen die elementaren Reaktionsschritte (Hemireaktionen, Halbreaktionen). Für Enzyme mit zwei oder mehr Funktionen ist es wichtig, nur linear unabhängige Funktionen zu betrachten, weil sonst zyklische elementare Moden auftreten würden, die keine Nettoumwandlung durchführen. Jedoch ist die Wahl der linear unabhängigen Funktionen nicht a priori eindeutig. Wir stellen eine Methode für das Treffen dieser Wahl vor, indem wir die konvexe Basis des Hemireaktions-Systems betrachten. Eine formale Anwendung des Algorithmus für das Berechnen der elementaren Flussmoden (Routen) erbringt das Resultat, dass die Zahl solcher Moden manchmal vom Niveau der Beschreibung abhängt, wenn einige Reaktionen reversibel sind und die Produkte der multifunktionellen Enzyme externe Metabolite sind, oder einige multifunktionelle Enzyme zum Teil die gleichen Stoffwechselprodukte umwandeln. Jedoch kann dieses Problem durch eine geeignete Deutung der Definition der elementaren Moden und die korrekte Wahl der unabhängigen Funktionen der Multifunktionsenzyme gelöst werden. Die Analyse wird durch einige kleinere Beispiele und ein größeres biochemisches Beispiel veranschaulicht, das aus dem Nukleotidmetabolismus stammt und die zwei Arten der Beschreibung für Nukleosiddiphosphokinase und Adenylatekinase vergleicht. Der Nukleotidmetabolismus spielt eine wichtige Rolle in lebenden Organismen und ist gegenüber allen möglichen Störungen in seiner internen Balance sehr empfindlich. Gefährliche Krankheiten können auftreten, wenn einige Enzyme nicht richtig funktionieren. Mit Hilfe des Konzeptes des elementaren Flussmodus erklären wir das Auftreten und den Schweregrad von Krankheiten, die auf Enzymdefizienzen basieren. Wenn ein Enzym vollständig gehemmt wird, werden einige metabolische Wege blockiert. Wenn jedoch einige alternative Wege noch bestehen, ist die Krankheit weniger gefährlich. Unsere Analyse ist darauf gerichtet, alternative Wege, wesentliche Enzyme und solche Enzyme, die immer zusammenarbeiten zu finden. Der letzte Begriff ist auch als "Enzyme subset" bekannt und stellt einen intermediären Schritt im Algorithmus zur Berechnung der elementaren Flussmoden dar. Wir diskutieren bereits bekannte und bisher nur hypothetische Mechanismen einiger Krankheiten (proliferative Krankheiten, Immundefizienzen), die auf Störungen des Nukleotidmetabolismus oder seiner Ausbeutung durch Viren und Parasiten beruhen. Die meisten Strategien, die für das Bekämpfen solcher Krankheiten eingesetzt werden, basieren auf der Unterbrechung des Nukleotidmetabolismus an bestimmten Stellen. Diese Strategien können aber auch zur Akkumulation toxischer Stoffe führen und dadurch Nebenwirkungen hervorrufen. Deswegen hilft ein besseres Verständnis dieses Systems, wirkungsvollere Medikamente zu entwickeln, und eine gute strukturelle Analyse kann viele experimentelle Bemühungen ersparen. Konzepte aus der Theorie der Petri-Netze liefern zusätzliche Werkzeuge für das Modellieren metabolischer Netzwerke. In Kapitel 4 werden die ähnlichkeiten zwischen einigen Konzepten in der traditionellen biochemischen Modellierung und analogen Konzepten aus der Petri-Netztheorie besprochen. Zum Beispiel entspricht die stochiometrische Matrix eines metabolischen Netzwerkes der Inzidenzmatrix des Petri-Netzes. Die Flussmoden und die Erhaltungs-Relationen haben die T-Invarianten beziehungsweise P-Invarianten als Gegenstücke. Wir decken die biologische Bedeutung einiger weiterer Begriffe aus der Theorie der Petri-Netze auf, nämlich "traps", "{siphons", "deadlocks" und "Lebendigkeit". Wir konzentrieren uns auf der topologischen Analyse anstatt auf die Analyse des dynamischen Verhaltens. Die geeignete Behandlung der externen Stoffwechselprodukte wird ebenfalls besprochen. Zur Illustration werden einige einfache theoretische Beispiele vorgestellt. Außerdem werden einige Petri-Netze präsentiert, die konkreten biochemischen Netzen entsprechen, um unsere Resultate zu belegen. Zum Beispiel wird die Rolle der Triosephosphatisomerase (TPI) im Metabolismus von Trypanosoma brucei ausgewertet, indem "traps" und "siphons" ermittelt werden. Alle behandelten Eigenschaften von Petri-Netzen werden anhand eines Systems illustriert, das aus dem Nukleotidmetabolismus stammt. Während viele Bemühungen für das Zerlegen metabolischer Systeme, (elementare Flußmoden, extreme Wege) erfolgt sind, sind bisher unseres Wissens keine Versuche in dieser Richtung für Signalübertragungssysteme unternommen worden. Eine spezielle Eigenschaft von Signalnetzwerken in lebenden Zellen ist, dass Aktivierungen, Hemmungen und biochemische Reaktionen normalerweise gleichzeitig anwesend sind. Selbst wenn sie nicht Reaktionen enthalten, machen Mehrfach-Aktivierungen oder Mehrfach-Hemmungen die Netzwerke in hohem Grade verzweigt. Es ist eine schwierige und sehr zeitraubende Aufgabe, alle Faktoren, die einen Einfluss auf ein gegebenes Ziel haben, ohne eine automatische Methode zu ermitteln. Bereits in Kapitel 1 heben wir die ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den metabolischen und Signal-Netzwerken hervor. In Kapitel 5 errichten wir einen Rahmen und präsentieren einen Algorithmus für die Zerlegung von Signalnetzwerken in kleinere Einheiten, die einfacher zu studieren und zu verstehen sind. Zwei Fälle werden untersucht: ein einfacheres, wenn nur monomolekulare Aktivierungen oder Reaktionen anwesend sind, und ein komplizierterer Fall, wenn die Aktivierungen und die Reaktionen multimolekular sein können. Ihre Beschreibung erfordert unterschiedliche Methoden: klassische Graphen bzw. Petrinetze. Wir besprechen die Probleme, die in unserem Modell wegen des Vorhandenseins von Hemmungen oder von unbekannten Effekten im Netz auftreten. Der vorgeschlagene Algorithmus ermittelt die Faktoren, die zusammenwirken und die Zielsubstanzen, die auf dem gleichen Weg beeinflusst werden. Die Zyklen, die im System auftreten, und mögliche fehlende Reaktionen werden ebenfalls ermittelt . Theoretische Beispiele veranschaulichen unsere Resultate. Anhand der T-Zell-Antigen-Rezeptor-Signalkaskade zeigen wir, wie die Methoden in realen Systemen angewendet werden können.<br>The living organisms are too complex when considering them as a whole. The present thesis deals with the topological properties of two important parts of living organisms: the metabolic and the regulatory systems. The topological properties are those features that are determined by the network structure. A classification in metabolic and regulatory systems is often used. A signalling system is a special kind of regulatory system. Between metabolic and signalling networks, there are important differences that impose their treatment in different ways. In metabolic pathway analysis, the elementary flux mode concept is already established as a proper tool for identifying the smallest essential routes in biochemical systems. We examine its features and advantages in some particular cases. Firstly, many enzymes operate with low specificity (e.g. nucleoside diphosphokinase, uridine kinase, transketolase, transaldolase), so that various substrates and products can be converted. Also the enzymatic mechanisms are diverse, as we have illustrated with reaction schemes for bifunctional enzymes. Therefore, there are two different approaches to describe multifunctional enzymes (We considered only the case when a certain active site hosts several reactions. The case when the studied enzyme has several such active sites can be transformed into that of several enzymes having only one active site. If a disease alters the initial enzyme, also all substituting enzymes are altered.): in terms of overall reactions and in terms of reactions steps (hemi-reactions, half-reactions). For enzymes with two or more functions, it is important to consider only linearly independent functions, because otherwise cyclic elementary modes would occur which do not perform any net transformation. However, the choice of linearly independent functions is not a priori unique. In Chapter 2, we give a method for making this choice unique by considering the convex basis of the hemi-reactions system. The set of linearly independent functions provided by our algorithm coincides, in the case of transketolase in pentose phosphate pathway, with the set of linearly independent functions mentioned in literature. A formal application of the algorithm for computing elementary flux modes (pathways) yields the result that the number of such modes sometimes depends on the level of description if some reactions are reversible and the products of the multifunctional enzymes are external metabolites or some multifunctional enzymes partly share the same metabolites. However, this problem can be solved by appropriate interpretation of the definition of elementary modes and the correct choice of independent functions of multifunctional enzymes. The analysis is illustrated by a biochemical example taken from nucleotide metabolism, comparing the two ways of description for nucleoside diphosphokinase and adenylate kinase, and by several smaller examples. The nucleotide metabolism plays an important role in living organisms and is very sensitive to any perturbations in its internal balance. Dangerous diseases may occur if some enzymes do not work properly. With the help of elementary flux mode concept, we explain the occurrence and severity of diseases based on enzyme deficiencies. If an enzyme is completely inhibited, some metabolic routes are blocked. If, however, some alternative routes still exist, the disease is less dangerous. In Chapter 3, we focus on finding alternative routes, essential enzymes and enzymes operating together. The latter notion is also known as ,,enzyme subset`` and represents an intermediary step in calculating the elementary flux modes. The known or hypothesised mechanisms of several disorders, occurred due to the malfunctioning of nucleotide metabolism (proliferative diseases, immunodeficiency diseases) or due to its hijacking by viruses and parasites, are given. Most strategies adopted for curing such diseases are based on nucleotide metabolism interruption. Therefore, a better understanding of this system helps developing more effective drugs and a good structural analysis can spare many experimental efforts. Petri net concepts provide additional tools for the modelling of metabolic networks. In Chapter 4, the similarities between the counterparts in traditional biochemical modelling and Petri net theory are discussed. For example, the stoichiometry matrix of a metabolic network corresponds to the incidence matrix of the Petri net. The flux modes and conservation relations have the T-invariants, respectively, P-invariants as counterparts. We reveal the biological meaning of some notions specific to the Petri net framework (traps, siphons, deadlocks, liveness). We focus on the topological analysis rather than on the analysis of the dynamic behaviour. The treatment of external metabolites is discussed. Some simple theoretical examples are presented for illustration. Also the Petri nets corresponding to some biochemical networks are built to support our results. For example, the role of triose phosphate isomerase (TPI) in Trypanosoma brucei metabolism is evaluated by detecting siphons and traps. All Petri net properties treated in above-mentioned chapter (4) are exemplified on a system extracted from nucleotide metabolism. While for decomposing metabolic systems, many efforts have been done (elementary flux modes, convex basis, extreme pathways), for signalling maps, as far as we know, no attempt in this direction has been made. A special characteristic of signalling networks is that activations, inhibitions, and biochemical reactions are normally present in parallel. Even if they do not contain reactions, multi-part activations or inhibitions make them highly branched. To detect all factors that have an influence on a given target, without using an automatic method, is a difficult and very time-consuming effort. Already in Chapter 1 (Backgrounds), we highlight the similarities and differences between metabolic and signalling networks. In Chapter 5, we build a framework and algorithm for decomposing signalling networks in smaller units, which are easier to study and understand. Two cases are investigated: a simpler one, when only monomolecular activations or reactions are present, and a more complex case, when the activations and reactions can be multimolecular. Their description requires different instruments: classical graphs and Petri nets, respectively. We discuss the problems that occur in our model due to the presence of some inhibitions or unknown effects in the network. The algorithm that we propose detects the factors that are acting together and the targets that are affected on the same route. The cycles that occur in the system are also highlighted. We point out possible missing reactions. Theoretical examples illustrate out findings. Using the T cell antigen-receptor signalling cascade, we show how it can be applied to real systems.

Es wird allgemein angenommen, dass Proteine exponentiell degradiert werden. Das bedeutet, dass neu synthetisierte als auch alte Proteine mit gleicher Wahrscheinlichkeit degradiert werden. Es tauchen jedoch immer mehr Hinweise dafür auf, dass das nicht immer der Fall sein muss. Um diese Fragestellung systematisch anzugehen, haben wir eine Methode zur metabolischen Pulsmarkierung mit der nichtkanonischen Aminosäure Azidohomoalanine (AHA) entwickelt. AHA ermöglicht die Anreicherung von neu synthetisierten Proteinen direkt nach einem Puls oder nach einer „chase“ (Nachverfolgung) Periode in AHA freiem Medium. Wir kombinierten diese Methode mit SILAC und Shotgun Proteomik um zu quantifizieren wieviel Protein nach verschiedenen chase-Perioden übrig bleibt. Damit konnten wir Degradationsprofile für tausende von Proteinen erstellen. Unsere Daten zeigen, dass mehr als 10 % der Proteine nicht exponentiell degradiert werden (NED). Diese Proteine werden mit fortschreitendem Alter ausschließlich stabiler. Proteasomale Degradation von überschüssigen Proteinkomplexuntereinheiten scheint einen Großteil der NEDs zu erklären. Beim Vergleich zwischen murinen und humanen Zellen stellte sich heraus, dass NED teilweise konserviert ist. Das liegt scheinbar daran, dass diese Zellen trotz unterschiedlichem Ursprungs einheitlich bestimmte Untereinheiten überproduzieren. Da überschüssige NED Proteine bereits unter Standardbedingungen degradiert werden, nahmen wir an, dass die zusätzliche Überproduktion eines NED Proteins seine Level im stationären Zustand nicht verändern sollte. Um dies zu zeigen, quantifizierten wir Degradationskinetiken von Proteinen einer aneuploidenZelllinie. Wir fanden, dass NED Proteine, die auf trisomischen Chromosomen codiert sind, nicht in gleichem Maße ihr stationäres Level steigerten wie exponentiell degradierte Proteine. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese verzeichneten wir stattdessen eine Zunahme der anfänglichen Degradationsraten dieser NED Proteine.<br>Proteins are thought to be degraded exponentially. That means that newly synthesized proteins have the same probability to be degraded as old proteins. However, evidence has accumulated showing that this is not true in all cases. To analyze this more systematically, we developed a method employing metabolic pulse-labeling by the non-canonical amino acid azidohomoalanine (AHA). AHA enables enrichment of newly synthesized proteins directly after pulse or after chase in AHA-free medium. We used SILAC and shotgun proteomics to quantify how much protein remains after different lengths of chase to create degradation profiles for thousands of proteins. Importantly, these degradation profiles allowed us to detect changes in degradation kinetics as the proteins age. We found that more than 10 % of proteins are non-exponentially degraded (NED). These protein are exclusively stabilized by age. Proteasomal degradation of excess protein complex subunits seems to explain a large fraction of NED. Comparing NED in mouse and human cells, we found that NED is at least partially conserved, seemingly due to cells consistently making too much of certain subunits. These overproduced subunits are on average shorter and more structured than the exponentially degraded proteins within the same complex. Finally, since excess NED proteins are degraded during baseline conditions, we hypothesized that making more of a NED protein would not increase its steady state levels. We employed an aneuploidy cell model and found that indeed NED proteins encoded on trisomic chromosomes did not increase in steady state levels to the same extent as exponentially degraded proteins. Instead, we recorded an increase in initial degradation of these proteins. In summary, we present a method for global pule-chase experiments allowing the detection of age-dependent protein degradation with possible implications for the understanding of aneuploidy and cancer.