Academic literature on the topic 'XH 3000'

Die von Tumorzellen exzessiv exprimierte Laktat-Dehydrogenase 5 (LDH-A) ist das Schlüssel-Enzym für den katalytischen Stoffwechsel um Pyruvat in Laktat unter Gewinnung von Energie umzuwandeln. Bei LDH handelt es sich um einen wichtigen prognostischen Marker für die Einstufung der Aggressivität und die Behandlung von Tumoren. Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen um die Funktion des Genproduktes von LDH-A (LDH-V) in Bezug auf die Proliferation von Tumorzellen, die Expression Angiogenese-Gene, maligne Konversion von Tumoren und die Metastasierung zu vertiefen. Zusätzlich sollte die Rolle von LDH auf die Genexpression HIF-regulierter Proteine, die das Überleben von Tumorzellen und vor allem der Glykolyse fördern, untersucht werden. Hierfür wurden LDH-A knockdown-Klone von dem murinen B16F10 Melanom und Lewis Lung Karzinom sowie dem humanem HT29 Kolonkarzinom generiert und in vitro und in vivo in den drei verschiedenen Tumormodellen untersucht. Der knockdown von LDH-A führte in vitro zu einer Hemmung der Proliferation in Lewis Lung und B16F10, während bei HT29 Tumorzellen kein solcher Effekt beobachtet werden konnte. Interessanterweise ließen sich nicht bei allen drei Zelllinien die durch limitierte LDH Aktivität ausgelösten Effekte auf die in vitro Proliferation auf das Tumorwachstum in vivo übertragen: Das Wachstum der Lewis Lung als auch der HT29 Tumoren in vivo war durch die Reduktion von LDH-A drastisch vermindert, während die Größe der B16F10 Tumoren davon nicht beeinflusst war. Es konnte gezeigt werden, dass B16F10 Tumoren unter LDH Suppression verstärkt VEGF exprimieren. Dadurch waren diese Zellen in vivo in der Lage, durch verstärkte Vaskularisierung des Tumors der durch LDH-A knockdown ausgelösten Hemmung des Tumorwachstums zu entkommen. Bei Lewis Lung Tumorzellen hingegen, führte die Unterdrückung von LDH-V zu einer beeinträchtigten Glukoseaufnahme unter normoxischen sowie hypoxischen Bedingungen. Die reduzierte Aufnahme von Glukose hatte in vivo, in einer vielschichtigen komplexen Struktur, deutlich größere Auswirkungen als auf einer eindimensionalen Zellkulturschale. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern neue Erkenntnisse zur Rolle von LDH-V während der Tumorprogression und können als Grundlage für zukünftige, neue Therapiestrategien bei Krebspatienten dienen.
LDH is an important prognostic marker in cancer staging and therapy. High serum LDH activity is associated with poor patient prognosis in different tumor types. LDH-A has been shown to play a major role in tumor malignancy, but the molecular mechanism behind this role is only starting to be understood. The objective of this work was to broaden our knowledge about the role of LDH-A gene product (LDH-V) in tumor cell proliferation, angiogenesis-related gene expression, tumor malignancy and metastasis. Herein, LDH-A shRNA knockdown clones of murine B16F10 melanoma, Lewis Lung carcinoma and human HT29 colon carcinoma were generated to uncover the molecular mechanisms between diminished ability of metabolizing pyruvate to lactate and tumor cell growth in vitro and in vivo. In this study, a significant correlation between tumor weight and serum LDH in in vivo tumor models was found, which additionally correlated with the in vitro LDH secretion. In vitro, suppression of LDH-A led to anti-proliferative effects in Lewis Lung and B16F10 tumor cells, while having no effect on HT29 cells. Interestingly, the consequence of limiting LDH activity in vitro did not show a direct correlation to the in vivo anti-tumor effects in LDH-deficient tumors: B16F10 tumor growth was unaffected by silencing LDH-A, while Lewis Lung and HT29 demonstrated a drastic reduction in tumor growth in vivo. B16F10 tumors were found to have increased VEGF expression upon LDH knockdown, and therefore were able to compensate the tumor growth inhibition-driven by LDH deficiency through increased tumor vascularization in vivo. In contrast, LDH-V suppressed Lewis Lung cells demonstrated an impeded glucose uptake ability under normoxic and hypoxic conditions. Subsequently, a genome-wide gene expression analysis and functional assays of LDH-A deficient and control HT29 clones revealed potential new oncogenic features of LDH-A in tumor migration and invasion as well as a feedback loop to HIF1alpha. In summary, the collective data presented in this thesis provide new insights of LDH-V in tumor progression and therapeutic strategies for the treatment of cancer.

Störung des G1-Restriktionspunkts des Zellzyklus und Verlust der Wachstumskontrolle in Folge der Inaktivierung des Rb-Signalwegs ist ein häufiges Ereignis in malignen Tumoren. Gemeinsam mit der Hemmung von Apoptose-Signalwegen sind solche genetischen Ereignisse zentrale pathogenetische Faktoren der Tumorentstehung. Diese Veränderungen prägen aber auch entscheidend die Tumorbiologie und bestimmen somit intrinische und erworbene Therapieresistenz und konsequenterweise auch die klinische Prognose der Tumorerkrankung. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen im Rb- und im p53-Signalweg in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus untersucht. Diese retrospektive Studie wurde an Tumorproben von 53 mit kurativer Intention R0-resezierten Patienten durchgeführt. Proteinexpression wurde mittels Immunhistochemie und Mutationen mittels SSCP-PCR analysiert. Aktivierende Punktmutationen des K-ras Onkogens wurden mittels mutationsselektiver genomischer PCR und eines sequenzspezifischen Festphasen-Hybridisierungstests nachgewiesen. Die Analyse der individuellen Gene zeigte, dass Expressionsverlust der Rb-Signalwegskomponenten p16INK4a, p21CIP/WAF-1, p27KIP1 und von Rb selbst, sowie die Überexpression von Cyclin D1 bzw. Verlust des pro-apoptotischen Bcl-2 Homologs Bax mit schlechter Prognose, d.h. kürzerem Überleben korrelierte. Überexpression von Cyclin E, p53 oder Bcl-2, sowie Mutation von p53 bzw. K-ras zeigten hingegen keinen Einfluss auf die Prognose. Das längste Überleben wurde in einer Subgruppe von Patienten beobachtet deren Tumore eine Kombination günstiger Genotypen zeigte, und zwar niedrige Cyclin D1 Expression, sowie hohe Expression von Rb, p21CIP/WAF-1, p16INK4a und Bax. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Multigen- oder "Multimarker"-Analyse von Genen, die konsekutiv oder synergistisch in Zellzyklus- und Apoptose-Signalwegen agieren, zur Prognoseabschätzung der Analyse individueller Gene deutlich überlegen ist. Die Identifikation solcher genetischer Markerprofile sollte sich auch zukünftig als nützlich für die klinische Entscheidungsfindung in der Therapie maligner Tumore erweisen und wird konventionelle klinische und pathologische Faktoren komplementieren, die bisher keine ausreichende Prognoseabschätzung erlauben.
Malignant tumors frequently show inactivation of the Rb pathway and, as a result, deregulation of the G1 restriction point of the cell cycle and loss of growth control. Together with the inhibition of apoptosis signaling pathways, such events are key pathogenetic factors in tumor development. Moreover, these aberrations are decisive in determining tumor biology and characteristics such as intrinisic or acquired resistance to therapy and, consequently, the clinical prognosis of the malignant disease. In the present work, aberrations in the Rb and the p53 pathway were analysed. This retrospective study was undertaken in a cohort of 53 patients with esophageal squamous cell carcinoma who underwent R0 resection with a curative intent. Protein expression in tumor samples was analysed by means of immunohistochemistry and mutations were investigated by the use of genomic SSCP-PCR. Activating point mutations of the K-ras oncogene were detected by the use of mutation-selective genomic PCR and a sequence specific solid phase hybridization assay. The analysis of individual genes showed a correlation between poor prognosis, i.e. short overall survival, and loss of the Rb pathway components p16INK4a, p21CIP/WAF-1, p27KIP1, and Rb itself, or overexpression of cyclin D1 or loss of the pro-apoptotic Bcl-2 homolog Bax. In contrast, overexpression of cyclin E, p53 or Bcl-2 and mutation of p53 or K-ras had no influence on disease prognosis. The longest survival was found in a subgroup of patients whose tumors exhibited a combination of favorable genotypes, i.e. low expression of cyclin D1, and high expression of Rb, p21CIP/WAF-1, p16INK4a and Bax. These results demonstrate that a multigene or "multimarker"-analysis of genes that act consecutively or synergistically in cell cycle and apoptosis signaling pathways is far superior to determine disease prognosis when compared to the analysis of individual genes. The identification of such genetic marker profiles should proove beneficial in clinical decision making in the therapy of malignant tumors. In the future, such diagnostic tools may be useful to complement conventional clinical and pathologic factors which in most instances do not allow prediction of disease prognosis.

Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) ist ein 28meres Neuropeptid, das eine Vielzahl biologischer Aktivitäten ausübt, welche durch die Bindung an die heptahelikalen Transmembranrezeptoren VPAC1 und VPAC2 vermittelt werden. VPAC1 ist auf der Oberfläche vieler Tumorzellen überexprimiert. Daher ist VIP gekoppelt mit Signalmolekülen wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen eine interessante Zielstruktur für die optische Detektion von Tumoren. Der Einsatz von VIP in der Tumordiagnostik ist jedoch aufgrund der schnellen proteolytischen Degradation stark limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden VIP-Analoga mit höherer in vitro und in vivo Stabilität identifiziert und synthetisiert. Hierfür wurde eine neue Synthesestrategie entwickelt, welche die hochparallele Herstellung von löslichen VIP-Farbstoff-Konjugaten auf Cellulosemembranen (Spotsynthese) erlaubt. Es wurden 533 N-terminal Carbocyanin-farbstoff-markierte VIP-Analoga synthetisiert, wobei jeder VIP-Rest durch alle übrigen 19 L-Aminosäuren ausgetauscht wurde (Substitutionsanalyse). Alle Analoga wurden mittels Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindung/Internalisierung an VPAC1-überexprimieren-den Zellen getestet. Diese Ergebnisse führten zur Identifizierung von VIP Aminosäureresten, die für die Wechselwirkung mit VPAC1 essentiell sind und lieferten weiterhin Hinweise über eine vorwiegend helikale Struktur des Rezeptor-gebundenen VIPs. Durch Einbau des Farbstoffs an alle VIP-Reste wurden die für die Wechselwirkung mit VPAC1 günstigen Positionen ermittelt. In Kompetitionstudien und cAMP-Assays ausgewählter Farbstoff-markierter VIP-Konjugate wurde demonstriert, daß sowohl die Spezifität als auch die Produktion von cAMP mit Hilfe der Modifikation der Farbstoffposition gesteigert werden konnte. Für die in Rattenleber getestete metabolische Stabilität der VIP-Analoga zeigte die Farbstoffposition nur einen geringen Einfluß. Die metabolische Stabilität konnte jedoch durch eine einzige Modifikation an Position 8 (Asp8 ® Arg8) erhöht werden. Weiterhin wurde das [Arg8]-VIP-Analogon als Kontrastmittel in in vivo Imaging-Experimenten mit VPAC1-überexprimierenden Tumoren inokulierter Mäuse appliziert. Hierbei wurden die Ergebnisse der Stabilitätstests in Rattenleber bestätigt. Das N-terminal farbstoffmarkierte [Arg8]-VIP-Derivat zeigte gegenüber dem nativen N-terminal markierten VIP-Konjugat eine höhere Halbwertszeit in vivo. Darüber hinaus konnte mit [Arg8]-VIP ein höherer Fluoreszenzkontrast zwischen normalen und Tumorgewebe induziert werden.
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) is a 28meric neuropeptide with a broad range of biological activities which are mediated via binding to the heptahelical transmembrane receptors VPAC1 and VPAC2. Since VPAC1 is overexpressed on the surface of numerous tumour cells, VIP coupled with signal structures like fluorescence dyes is an interesting target for the tumour detection in the near-infrared range. The use of VIP in tumour diagnosis is limited due to the rapid proteolytic degradation and therefore suggests need for optimised VIP-analogues with enhanced stability. In the present work a complete substitutional analysis of VIP N-terminally labelled with carbocyanine dyes was performed. For that reason a new synthetic strategy has been developed, which allows the parallel production of soluble VIP-dye conjugates using the spot synthesis technique. The resulting 560 derivatives were tested for binding and internalisation using VPAC1-overexpressing cells by means of flow cytometry. Based on these results a VIP binding motif has been delineated, which facilitates the modification of VIP concerning stability enhancement and preservation of binding characteristics. Using a dye-walk the dye-coupling positions beneficial for cell binding were identified. Radioactive competitions studies and cAMP assays of selected dye-labeled VIP-conjugates demonstrated that specifity as well as production of cAMP or biological activity has been increased by alteration of the dye-position. For increasing metabolic stability of labelled VIP-analogues the dye-position showed little influence. But is has been shown that stability of VIP was increased by only one modification at position 8 (Asp8®Arg8). Furthermore [Arg8]-VIP-derivative has been used as a contrasting agent in in vivo-Imaging experiments with VPAC1-overexpressing tumours inoculated in mice. Here the results of stability test in rat liver extract were confirmed. N-terminally dye-labelled [Arg8]-VIP analogue revealed higher half-life-time in vivo towards N-terminally labelled native VIP-derivative. In addition the [Arg8]-VIP induced a higher tumour contrast between normal and tumour tissue.

Tumorzellen entwickeln häufig Resistenzen gegen verschiedene strukturell und funktionell unabhängige Zytostatika, was als Multidrug-Resistenz (MDR) bezeichnet wird und die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie ist. Mit Hilfe von in vitro-Untersuchungen wurden erhöhte Genexpressionen der ABC-Transporter MDR1, MRP2 und BCRP als maßgebliche Resistenzfaktoren identifiziert, wie z.B. in den Magenkarzinomzellinien EPG85-257RDB (MDR1) und EPG85-257RNOV (BCRP) sowie in der Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS (MRP2). Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines auf Ribozym-Technologie basierenden Therapieansatzes, welcher die Expressionen der oben genannten ABC-Transporter simultan inhibiert und dessen Anwendung zur Reversion der zellulären MDR führt. Dazu wurde ein Multitargetmultiribozym (MTMR) entwickelt, das aus in trans-aktiven Ribozymen besteht, die gegen die ABC-Transporter mRNAs gerichtet sind sowie aus in cis-spaltenden Ribozymen und aus Spacer-RNA-Sequenzen. Durch autokatalytische Spaltung in cis konnten die in trans-aktiven Ribozyme aus dem Gesamt-MTMR freigesetzt werden. Die Analyse der kinetischen Parameter des MTMRs ergab, daß die autokatalytisch entstandenen MTMR-Fragmente ihre Substrat-RNAs im Vergleich zu den korrespondierenden Monoribozymen ohne Einbuße an Effizienz spalten können. Darüber hinaus wurde die MTMR-Sequenz stabil in den drei eingangs genannten MDR-Zellinien exprimiert, was in einer signifikanten Reduktion der jeweiligen Ziel-mRNAs (97 % MDR1-, 80 % BCRP-, 96 % MRP2-mRNA) und der entsprechenden Proteine resultierte. Die Multidrug-Resistenz konnte aufgrund der MTMR-Expression um 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV), 100% (257RDB) und die Zytostatikumsakkumulation um 90% (257RNOV-Zellen) sowie 100% (257RDB-Zellen) revertiert werden. Das MTMR stellt erstmalig ein RNA-Konstrukt dar, welches in der Lage ist, simultan mehrere unabhängige Gene funktionell auszuschalten. Es besitzt daher ein großes Potential für zukünftige gentherapeutische Ansätze.
Cancer cells are often insensible against structurally and functionally unrelated drugs that is known as multiple drug resistance (MDR) and the main cause for treatment failure. Overexpression of the ABC-transporters P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), and BCRP (ABCG2) is associated with MDR in several cancer cell lines, e.g. in the stomach carcinoma cell lines EPG85-257RDB (P-gp), EPG85-257RNOV (BCRP), and in the ovarian carcinoma cell line A2780RCIS (MRP2). We aimed the development of a novel hammerhead ribozyme-based therapeutic approach capable of simultaneous silencing of the prementioned ABC-transporters, and consequently of reversing MDR phenotypes. We designed a so-called multitarget multiribozyme (MTMR) consisting of trans-acting hammerhead ribozymes directed against the MDR1, MRP2, and BCRP transcripts, of MDR1 homologous spacer sequences, and of cis-acting ribozymes against the spacer sequences. Autocatalytic cleavage in cis excised the full-length MTMR, and released trans-acting hammerhead ribozymes. We also evaluated the catalytic features of the MTMR using large RNA target molecules. Comparison of the kinetic values of the autocatalytically derived MTMR fragments with those of corresponding mono-ribozymes demonstrated an MTMR-mediated substrate cleavage without distinct loss in catalytic efficiency. Moreover, the MTMR was stably expressed in the prementioned multidrug-resistant cancer cell lines, and decreased the targeted transcripts about 97% (MDR1), 80% (MRP2), and 96% (BCRP) as well as the corresponding protein levels, respectively. Cellular MDR could be reverted about 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV), and 100% (257RDB). Additionally, the MTMR reversed mitoxantrone accumulation entirely, and daunorubicin accumulation about 90% in stomach carcinoma cells, respectively. Taken together, the MTMRs capability of simultaneous silencing of multiple genes provides an effective instrument to knockdown genes of interest.

EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9) hat als unabhängiger prognostischer Marker viel Aufmerksamkeit erregt, da in einigen Tumoren hohe Expressionsraten und Tumorentwicklung korrelieren. In diesen Fällen ist eine hohe EBAG9 Expression häufig mit einer schlechten klinischen Prognose verbunden. EBAG9 ist ein ubiquitär exprimiertes Golgi Protein. Aktuelle Daten demonstrieren, dass es in sekretorischen Zellen an der regulierten Exozytose und an der zytotoxischen Funktion von Lymphozyten beteiligt ist. In epithelialen Zellen führt es zur Generierung von Tumor-assoziierten O-Glykanen, welche ein Erkennungsmerkmal vieler Krebsarten sind. In dieser Arbeit wurde der pathogenetische Zusammenhang zwischen EBAG9 Expression und der Veränderung des zellulären Glykoms untersucht. Um einen tieferen Einblick in die zelluläre Funktion von EBAG9 in epithelialen Zellen zu gewinnen, wurden Zellen mit tumorähnlicher EBAG9 Expression verwendet. Innerhalb dieser Arbeit wurde demonstriert, dass EBAG9 mit anterograden COPI Vesikeln assoziiert und zwischen dem ER-Golgi intermediären Kompartiment und cis-Golgi pendelt. EBAG9 verursacht eine Verzögerung des anterograden Transportes vom ER zum Golgi und verändert die Lokalisation von Komponenten der ER Qualitätskontrolle und des Glycosylierungsapparates. Auf der anderen Seite beschleunigt die verminderte Expression von EBAG9 den Proteintransport durch den Golgi und verstärkt die Aktivität von Mannosidase II. Mechanistisch betrachtet verhindert EBAG9 die Rekrutierung von ArfGAP1 an die Membran. Dies beeinträchtigt das Auflösen der COPI Vesikelhülle und somit die Fusion von Vesikeln am cis-Golgi. Damit agiert EBAG9 in epithelialen Zellen als negativer Regulator des COPI-abhängigen ERGolgi Transportes und stellt damit ein neues phatogenetisches Prinzip dar, bei dem die Beeinflussung des intrazellulären Transportes zu der Entstehung von Tumor-assoziierten Glykanen führt.
The estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9 (EBAG9) has received increased attention as an independent prognostic marker for disease-specific survival since in some human tumor entities high expression levels correlate with tumor progression and poor clinical prognosis. Interestingly, EBAG9 was identified as an ubiquitously expressed Golgi protein. Recent data demonstrate an involvement in regulated exocytosis in secretory cells and the cytotoxic functions of lymphocytes. However, EBAG9 is expressed in essentially all mammalian tissues, and in epithelial cells it has been identified as a modulator of tumorassociated O-linked glycan expression, a hallmark of many carcinomas. This thesis addresses the pathogenetic link between EBAG9 expression and the alteration of the cellular glycome. To gain further insights into the cellular functions of EBAG9 in epithelial cells, tumor-associated EBAG9 overexpression was mimicked in living cells. It was demonstrated that EBAG9 associates with anterograde COPI-coated carriers and shuttles between the ER-Golgi intermediate compartment and cis-Golgi stacks. EBAG9 overexpression imposes a delay in anterograde ER-to-Golgi transport and mislocalizes components of the ER quality-control and glycosylation machinery. Conversely, EBAG9 downregulation accelerates glycoprotein transport through the Golgi and enhances mannosidase activity. Functionally, EBAG9 impairs ArfGAP1 recruitment to membranes and consequently, interferes with the disassembly of the coat lattice at the cis-Golgi prior to fusion. Thus, EBAG9 acts as a negative regulator of a COPI-dependent ER-to-Golgi transport pathway in epithelial cells and represents a novel pathogenetic principle in which interference with intracellular membrane trafficking results in the emergence of a tumor-associated glycome.

Es wurde ein Expertensystem zur Prognoseabschätzung entwickelt und evaluiert, welches eine neue Art der Regelbewertung anwendet. Als Krankheitsbild wurden exemplarisch Hirnstammgliome im Kindesalter gewählt. HISTAGLI besteht aus einer Informationskomponente, die einen inhaltlichen Überblick über das Krankheitsbild gibt, einer Datenbank, in der sämtliche Patienteneingaben sowohl als Text, als auch graphisch einsehbar ist und einer Prognoseerstellungskomponente, in der eine Prognose in sechs verschiedenen Kategorien unter Berücksichtigung verschiedener Therapieschemata für einen neu eingegebenen Patienten erstellt und der Weg zur Prognoseerstellung erläutert wird. Die der Prognoseerstellungskomponete zugrundeliegende Wissensbasis wurden aufgrund der klinischen und histopathologischen Daten von 23 Kindern, die an einem Hirnstammgliom erkrankt waren, halbautomatisch von einem Experten bewertet. Es fand sich dabei eine hohe Korrelation von 78,26% (bzw. 86,96% bei einer Kategorie Toleranz) Übereinstimmung mit den tatsächlichen Prognosen der Patienten. Dieses Ergebnis ist nur mit Einschränkungen auf neue Patienten übertragbar, da die Fallzahl zu gering für statistische Aussagen ist. Bei entsprechender Pflege des Systems ist mit wachsenden Fallzahlen mit einer immer höher werdenden Genauigkeit zu rechnen.
An expert system for the estimation of a prognosis was developed and evaluated which uses a new kind of valuation. Brainstem gliomas in the childhood were chosen as an example of a disease. HISTAGLI consists of an information component which gives an overview about the disease, a database in which all patient data is presented as text and graphics, and a prognosis creation component which creates a prognosis for newly inserted patients in six categories under consideration of different therapy pattern and explains the way towards the estimation of the prognosis. The knowledge base of the prognosis creation component was made out of the clinical and histopathological data of 23 children with brainstem gliomas halfautomaticly valued by an expert. There was a high correlation of 78,26% (with one category toleranz 86,96% ) accordance with the real prognosis of the patients. This result is only restricted transferable to new patients because of the number of cases which is too small for statistical evidence. Higher precision is expected with appropriate maintenance and an increasing number of cases.