Дисертації з теми "Maladie de la tache noire"

Les cultures d’ananas de la Réunion sont soumises à une forte pression parasitaire favorisée par le climat subtropical de l’île. La maladie de la tache noire est causée par un cortège de champignons filamenteux dont Fusarium ananatum est l’espèce la plus décrite à ce jour. Le développement de taches noires dans les fruits matures constitue une problématique majeure de par son impact sur la qualité de l’ananas ‘Queen Victoria’ présentant une forte sensibilité à cette pathologie. La gestion des épisodes épidémiques repose actuellement sur des méthodes associant des pratiques culturales adaptées et l’utilisation de fongicides. Toutefois, ces stratégies s’avèrent infructueuses pour des conditions climatiques fortement favorables au développement et à la dispersion des agents pathogènes. L’accumulation de mycotoxines au sein des tissus infectés représente également une préoccupation d’envergure dans la préservation de la sécurité sanitaire des productions d’ananas. Dans l’objectif de développer de nouveaux leviers de résistance plus durables, des recherches visant à caractériser les déterminants de la sensibilité de l’ananas ‘Queen Victoria’ ont été menées sur chaque composante du pathosystème. Une approche épidémiologique a permis d’établir que l’occurrence de la tache noire est positivement corrélée à une contamination résultant d’une dispersion aérienne des spores d’espèces pathogènes. De plus, la prédominance d’espèces fongiques appartenant aux complexes Fusarium fujikuroi et Talaromyces purpureogenus au sein du mycobiome du fruit a démontré l’implication d’un cortège pathogène constitué de Fusarium proliferatum, Fusarium ananatum, Fusarium oxysporum, Fusarium sacchari, Talaromyces stollii et Talaromyces amestolkiae dans l’expression de cette pathologie. L’étude in vitro des profils d’interaction entre quatre de ces espèces a mis en évidence le pouvoir antagoniste de T. stollii sur la croissance des espèces pathogènes de Fusarium. D’importantes variations dans les concentrations en mycotoxines (fumonisines B1, B2 et beauvericine) ont également été mesurées au cours de confrontations entre les pathogènes. Enfin, l’analyse par comparaison variétale des voies de signalisation moléculaire conditionnant les réponses de défense précoces montre que la sensibilité du cultivar ‘Queen Victoria’ est en partie imputable à une faible expression constitutive des gènes impliqués dans la synthèse de protéines PR. Les résultats obtenus suggèrent la mise en œuvre d’une stratégie fongique basée sur la répression des signaux de défenses transduits chez l’ananas au cours des 72 premières heures de l’interaction hôte – pathogène menant à l’établissement de la maladie
In Reunion Island, pineapple crops are exposed to high parasitic pressure promoted by the subtropical climate of the island. The Fruitlet Core Rot (FCR) disease is caused by a set of fungal pathogenic species in which Fusarium ananatum has been the most described so far. The development of brown discoloration in mature fruits represents a major issue affecting notably the quality of the ‘Queen Victoria’ pineapple cultivar due to its high susceptibility to FCR. Until now, the management of epidemics lies on the combination of suitable agricultural practices and the use of fungicide treatments. Nevertheless, these strategies are unsuccessful in the presence of climatic conditions that favor the development and dispersion of causalagents. Mycotoxins accumulation in the flesh of infected fruits is also of concern in the preservation of sanitary quality of fruit productions. In order to develop novel alternatives for sustainable sources of FCR resistance, my research work focused on the determinants of ‘Queen Victoria’ pineapple susceptibility. An epidemiological approach permitted to establish that Fruitlet Core Rot occurrence ispositively correlated to contamination patterns resulting from aerial dispersion of the pathogen spores. Moreover, the prevalence of fungal species belonging to the complexes Fusarium fujikuroi and Talaromyces purpureogenus within the fruit mycobiome have demonstrated the role of a pathogenic fungal set composed of Fusarium proliferatum, Fusarium ananatum, Fusarium oxysporum, Fusarium sacchari, Talaromyces stollii and Talaromyces amestolkiae in the disease expression. The in vitro study of interaction profiles between four of those species have evidenced the growth antagonism of T. stollii on the pathogenic Fusarium species. Significant variations of mycotoxin contents (fumonisins B1, B2 and beauvericin) were also measured during dual culture of pathogens. Finally, the analysis based on varietal comparison of the molecular signal promoting early defense responses show that susceptibility of ‘Queen Victoria’ cultivar is partly supported by a low constitutive expression of genes involved in the synthesis of PR proteins. The results suggest a fungal strategy based on the repression of defense signal transduction in pineapple during the first 72 hours of the host - pathogen interaction leading to the disease establishment

La maladie de la tache noire affecte les fruits d’ananas mature, les rendant impropre à la consommation. Actuellement, aucune méthode de contrôle n'est disponible pour cette maladie. Une meilleure connaissance du pathosystème est nécessaire pour trouver des moyens de lutte efficaces.Des entretiens et échantillonnages menés auprès de producteurs durant l’hiver austral révèlent une prévalence de la maladie de 74%. Les champignons pathogènes appartiennent à plusieurs espèces : Fusarium ananatum (72% des isolats), Talaromyces stollii (21%), F. oxysporum (6%) et F. proliferatum (1%). Leur potentiel toxinogène a été déterminer, Les champignons du genre Fusarium ont produit des mycotoxines identifiées comme les fumonisines FB1, FB2 et la beauvericine. Sur un milieu de culture ananas, une concentration en beauvericine de 34959 µg kg-1 a été mesurée pour l’espèce F. proliferatum.Une méthode d’inoculation de Fusarium ananatum directement dans le parenchyme a permis de décrire la réponse du biochimique du fruit. La voie des phénylpropanoïdes est sollicitée, particulièrement avec l’élicitation du caffeoylisocitrate et du coumaroylisocitrate dans la zone infectée. Une comparaison des profils métaboliques montre que la réponse du fruit à une inoculation est plus importante chez le cultivar résistant ‘MD-2’ que chez le cultivar sensible ‘Queen’. La majorité des métabolites élicités par l’attaque sont déjà présents dans les fruits sains mature de la variété résistante. Le potentiel antifongique des composés phénoliques à était évalué. Les acides coumarique, caféoylquinique et férulique inhibent la croissance du mycélium à des concentrations similaires à celle trouvées dans les fruits infectés.Une approche par imagerie a permis de décrire l’anatomie des fruits des deux cultivars et notamment la fusion imparfaite des sépales et bractée chez ‘Queen’. Les nectaires et les parois carpellaires jouent un rôle clef dans le processus d'infection et de colonisation de Fusarium ananatum
Fruiltet core rot (FCR) disease affects the fruits of mature pineapples. Current disease controls are not available. A deeper knowledge of the pathosystem is needed to find an effective means of control FCR.A diagnostic survey conducted with producers during the southern winter revealed a prevalence of the disease of 74%. Pathogenic fungi belong to several species: Fusarium ananatum (72% isolates), Talaromyces stollii (21%), F. oxysporum (6%) and F. proliferatum (1%). Their toxinogenic potential was determined. Fusarium fungi produced mycotoxins identified as fumonisins FB1, FB2 and beauvericin. On a pineapple culture medium, a concentration of beauvericine of 34959 μg kg-1 was measured for the species F. proliferatum.A method of inoculating Fusarium ananatum directly into the parenchyma allowed to describe the biochemical response of the fruit. The phenylpropanoids pathway is involved, particularly with the elicitation of caffeoylisocitrate and coumaroylisocitrate in the infected zone. A comparison of the metabolic profiles shows that the response to inoculation of resistant cultivar 'MD-2' is higher than in the sensitive cultivar 'Queen'. Most of the metabolites elicited by the attack are already present in healthy mature fruits of the resistant variety. The antifungal potential of the phenolic compounds was evaluated. Coumaric, caffeoylquinic and ferulic acids inhibit mycelial growth at concentrations similar to those found in infected fruits.An imaging approach allowed to describe the anatomy of the fruits of the two cultivars, to identify the key roles played by nectaries and carpel margins in the infection and colonization process of Fusarium ananatum

Notre travail a suivi deux objectifs principaux, l'une sur la variabilite et le mode d'infection de phoma macdonaldii et l'autre sur l'etude genetique du tournesol vis-a-vis de cette maladie. Les resultats suivants ressortent de cette etude : 1) les souches de l'agent pathogene presentent une forte variabilite phenotypique au niveau de la croissance, de la production et de la taille des pycnides ainsi que la germination des pycniospores. Une methode de contamination artificielle a ete developpee pour apprecier le niveau d'agressivite des souches ainsi que le comportement du tournesol vis-a-vis de cette maladie. Les souches du pathogene montrent une agressivite tres variable. Aucune correlation entre l'agressivite des souches et les caracteres phenotypiques etudiees n'est observee. 2) l'etude du mode d'infection montre que, les spores sont entourees par une couche mucilagineuse de nature polysaccharidique qui joue un role important dans l'adhesion de l'agent pathogene a la surface de l'hote. Ce champignon developpe un coin d'infection qui perfore la cuticule, et penetre directement dans la plante par la cuticule et/ou par les stomates. Apres avoir traverse la cuticule il forme des hyphes subcuticulaires. 3) l'etude genetique montre une grande variabilite au niveau de la resistance entre les genotypes. Nous avons observe le phenomene d'heterosis ainsi qu'un effet nucleo-cytoplasmique sur la resistance du tournesol a cette maladie. Notre etude sur l'aptitude generale a la combinaison des differents genotypes du tournesol, montre que ces valeurs sont significative (positive ou negative). Ce qui prouve l'importance des effets additifs des genes dans le controle de la resistance. L'aptitude specifique a la combinaison de certains hybrides f1 est significative. Ce qui prouve l'existence de l'effet dominant et ou dominant incomplet de genes pour le controle de la resistance a cette maladie.

Une étude approfondie de l'agent causal de la maladie des tâches noires de la mangue (Xanthononas campestris pv. Mangiferaeindicae) a permis de mettre en évidence une assez large variabilité des caractères métaboliques, sérologiques, de la sensibilité à une gamme de bactériophages, d'antibiotiques ou de sels de métaux lourds et du contenu plasmidique des 94 isolats étudiés. Une variabilité existe également en ce qui concerne le pouvoir pathogène sur différentes plantes hôte. L'étude des caractéristiques biologiques et épidémiologiques de l'agent pathogène dans les conditions de l'ile de la réunion a permis de mettre en évidence les périodes de sensibilité et réceptivité des tissus de l'hôte et l'influence des paramètres climatologiques sur leur développement. Une survie épiphyte de l'agent pathogène a été démontrer sur feuilles, bourgeons et jeunes fruits. Les modalités de sa dissémination ont été précisées. L'efficacité de différentes formulations chimiques a été étudiée. Des résultats encourageants concernant les possibilités de lutte biologique par utilisation de souches de Bacillus subtilis ou B. Amyloliquefaciens antagonistes ont été obtenus
An extensive study was undertaken to characterize 94 isolates of Xanthomonas campestris pv. Mangiferaeindicae responsible for bacterial black spot of mangoes. Studies on carbohydrates assimilation, susceptibility to antibiotics and to heavy metal salts, serotyping and phage-typing, plasmid patterns as well as to pathogenicity to several hosts have revealed a large variability within the isolates. Biological and epidemiological studies of the pathogen under Reunion Island conditions have allowed us to establish susceptibility and receptivity periods of host tissues and their relations to climatic conditions. The pathogen is able to survive as an epiphyte on leaves, buds and immature fruit. Its mode of spread has been studied. Chemical and biological disease control were evaluated and resuls show that disease control may be achieved by using an antagonistic strain of Bacillus subtilis or B. Amyloliquefaciens

La caractéristique neuropathologique majeure de la maladie de Parkinson (MP) est la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SN). Nous avons examiné si un dysfonctionnement aigu des EAATs pourrait contribuer au cercle vicieux entretenant la progression des pertes DA. Les effets du PDC, un inhibiteur substrat des EAATs, ont été analysés chez le rat. L'analyse cinétique (4-120 jours) des effets d'une seule injection intranigrale de PDC montre une perte progressive spécifique des neurones DA, avec une évolution unilatérale vers bilatérale et caudo-rostrale. Le processus dégénératif associe déplétion en glutathion et augmentation de l'activité de la γ-glutamyltranspeptidase, stress oxydatif, processus excitotoxiques, autophagie et réactivités gliales. L'antioxydant N-acétylcystéine et les antagonistes des récepteurs NMDA ifenprodil et mémantine exercent un effet neuroprotecteur. Des effets compensatoires transitoires au niveau de marqueurs de la fonction DA dans la SN et le striatum accompagnent la perte cellulaire et des dystrophies axonales. Des troubles moteurs apparaissent de façon tardive lorsque la perte neuronale ipsilatérale avoisine les 50%. Ces résultats montrent un lien fonctionnel entre dysfonctionnement des EAATs et plusieurs mécanismes pathogéniques ainsi que des caractéristiques neuropathologiques majeures de la MP, et fournissent le premier modèle progressif de la maladie induit de façon aiguë
Parkinson's disease (PD) is characterized by the progressive degeneration of substantia nigra (SN) dopaminergic neurons. Central players in PD pathogenesis, including mitochondrial dysfunction and oxidative stress, might affect the function of excitatory amino acid transporters (EAATs). Here, we investigated whether acute EAATs dysfunction might in turn contribute to the vicious cycles sustaining the progression of dopamine neuron degeneration. PDC application on nigral slices triggered sustained glutamate-mediated excitation selectively in dopamine neurons. In vivo time-course study (4-120 days) revealed that a single intranigral PDC injection triggers progressive degeneration of exclusively dopamine neurons with unilateral to bilateral and caudorostral evolution. This degenerative process associates GSH depletion and specific increase in γ-glutamyltranspeptidase activity, oxidative stress, excitotoxicity, autophagy and glial reaction. The anti-oxidant N-acetylcysteine and the NMDA receptor antagonists ifenprodil and memantine provided significant neuroprotection Transient compensatory changes in dopamine function markers in SN and striatum accompanied cell loss and axonal dystrophy. Motor abnormalities (hypolocomotion and forelimb akinesia) showed late onset, when ipsilateral neuronal loss exceeded 50%. These findings outline a functional link between EAATs dysfunction and several PD pathogenic mechanisms and pathological hallmarks, and provide the first acutely-triggered rodent model of progressive parkinsonism

L’analyse à grande échelle de l’expression des gènes dans le cerveau est une approche puissante et relativement nouvelle, susceptible d’identifier des gènes candidats pour l’analyse des fonctions cérébrales. Nous avons utilisé la méthode Serial Analysis of Gene Expression pour établir un profil d’expression quantitatif de 11 régions du cerveau de souris, dont plusieurs régions corticales, le noyau accumbens, le striatum, le thalamus, la substance noire et l’aire tegmentale ventrale. Plus d’un million d’étiquettes SAGE ont été générées, permettant la détection de transcrits peu abondants. La comparaison des banques SAGE a mis en évidence 308 gènes différentiellement exprimés dans le cerveau de souris, dont la majorité n’a pas de fonction connue. Ces données ont été validées par la RT-PCR quantitative ou l’hybridation in situ (HIS). Le cerveau étant un organe de composition hétérogène, nous avons utilisé une technique combinant l’HIS et l’immunohistochimie afin d’étudier la distribution cellulaire des ARNm de trois marqueurs mésencéphaliques. Nous avons également entrepris d’étendre à l’homme les analyses d’expression réalisées chez la souris. Nos données montrent que les patterns d’expression génique entre des régions comparables du cerveau humain et du cerveau murin sont généralement conservés. Par ailleurs, nous nous sommes interrogés sur la régulation des gènes différentiellement exprimés dans un contexte physiopathologique affectant des régions cérébrales spécifiques. Ainsi, nous avons montré la régulation de plusieurs marqueurs striataux, corticaux et mésencéphaliques dans des modèles murins des maladies de Huntington et Parkinson
In order to get a better understanding of brain complexity at a molecular level, we explored the mouse brain transcriptome using the Serial Analysis of Gene Expression method. SAGE libraries were generated from 11 mouse brain territories, including six cortical regions, striatum, accumbens nucleus, thalamus, substantia nigra and ventral tegmental area. The entire project delivered 1. 2 million SAGE tags, allowing the detection of rare mRNAs. Comparison of all transcriptomes revealed 308 transcripts differentially expressed, a number of which have no documented function. We further analyzed the expression profiles by real-time RT-PCR or in situ hybridization (ISH). Since the brain is a heterogeneous organ, it was important to determine the cell types that are expressing the novel markers. A combination of in situ hybridization with immunohistochemistry showed the expression of 3 midbrain-enriched mRNAs in dopaminergic neurons. We tested whether mouse markers could be human markers. There was a good overall conservation of expression patterns in both species. To evaluate the assumption that genes predominantly expressed in a given brain structure may indeed be relevant to its function, we chose pathophysiological conditions that target specific neuron populations. Using quantitative RT-PCR, we so far measured the abundance of striatum- or cortex-enriched transcripts in the mouse R6/2 genetic model of Huntington’s disease. Likewise, we showed the regulation of transcripts enriched in the striatum or substantia nigra in pharmacological rodent models of Parkinson’s disease, in which the nigro-striatal dopaminergic pathway has been lesioned

Une etude de la variabilite genetique des populations de xanthomonas pv. Mangiferaeindicae a permis de mettre en relation la diversite de ce pathovar avec l'hote d'origine des souches. Cette separation en deux groupes, l'un infeode au manguier, l'autre au faux poivrier existe egalement a petite echelle, dans un verger contenant les deux hotes, alors que toutes les conditions pour le passage des bacteries d'un hote a l'autre sont remplies. Par inoculations croisees de souches isolees de manguier et de faux poivrier sur le manguier et le faux poivrier, nous avons montre qu'il existe une specialisation du pouvoir pathogene qui favorise les souches inoculees sur leur hote d'origine. La symptomatologie, les populations dans les symptomes, la dynamique de croissance bacterienne dans les lesions, la creation d'inoculum secondaire par exsudation des symptomes permettent d'expliquer la predominance des souches sur l'hote homologue. Microscopiquement, l'interaction heterologue sur manguier se caracterise par une reaction de type hypersensible incomplete de la plante et par une incapacite de la bacterie a causer l'hypertrophie des tissus caracteristique de la relation compatible entre x. Pv. Mangiferaeindicae et le manguier. Ces elements peuvent expliquer le faible pouvoir pathogene des souches isolees de faux poivrier sur cet hote et leur role negligeable dans l'epidemiologie de la maladie des taches noires du manguier, mais il est possible que d'autres aspects du cycle biologique de la bacterie aient une importance. Le role des homologues de genes d'avirulence comme revelateurs de la diversite genetique du pathovar en ces deux sous-populations suggere l'implication de ces genes dans la symptomatologie, l'agressivite et le spectre d'hote de x. Pv. Mangiferaeindicae sur le manguier et sur le faux poivrier.

Ce travail de thèse concerne la caractérisation des variations du phénotype électrique des neurones DA de la SNc chez les animaux KOs SK3 et Kv4.3, en conditions physiologiques et physiopathologiques. Dans une première étude, j'ai analysé un grand nombre de paramètres électrophysiologiques chez ces animaux. En association avec des blocages pharmacologiques aigus de ces canaux, la délétion chronique du canal Kv4.3 conduit à une variation phénotypique semblable au blocage aigu du canal tandis que la délétion du canal SK3 semble compensée par d'autres canaux (notamment le SK2). Dans une seconde étude, préliminaire, nous avons utilisé un modèle de lésion bilatérale partielle pour étudier les répercussions comportementales et électrophysiologiques de la délétion du canal SK3 dans le développement de la maladie de Parkinson. Nos résultats suggèrent qu’en condition "Parkinson", la suppression constitutive du canal SK3 est associée à un léger effet anxiolytique, à l’abolition de l’hypersensibilité aux agonistes dopaminergiques mais aussi à des déficits de l’apprentissage moteur. Du point de vue électrophysiologique, les neurones DA de la SNc présentent un profil de décharge régulier similaire à la condition non-traitée. Ces deux études suggèrent que l'activité électrique des neurones DA de la SNc présente une robustesse partielle et variable à la délétion des canaux potassium qui peut être révélée dans des contextes physiologiques et physiopathologiques. Ce travail devrait permettre de mieux comprendre comment les mutations génétiques de canaux ioniques pourraient altérer la vulnérabilité des neurones DA de la SNc dans le contexte de la maladie de Parkinson
During my PhD, I precisely characterized the variations in electrical phenotype of the SNc DA neurons in Kv4.3 and SK3 KO animals, in physiological and pathophysiological conditions. In a first study, I analyzed a large number of electrophysiological parameters in these animals Combined with acute pharmacological blockade of these ion channels, I showed that Kv4.3 chronic deletion leads to a phenotypic change similar to the one induced by acute blockade of the channel while SK3 deletion appears to be compensated by other ion channels (in particular SK2). Motor behavior testing of Kv4.3 and SK3 KO animals confirmed the robustness of SK3 animals and the absence of robustness of Kv4.3 animals. In a second preliminary study, we used a bilateral partial lesion model to assess the behavioral and electrophysiological consequences of SK3 deletion on Parkinson's disease development. Our results suggest that in "Parkinson's" conditions, the chronic deletion of SK3 channel is associated with a slight anti-anxiety effect, the suppression of dopaminergic agonist hypersensitivity but also with motor deficits. From an electrophysiological viewpoint, the SNc DA neurons display a pacemaking behavior similar to the untreated condition. These two studies suggest that SNc DA neuron activity displays a partial and variable robustness to potassium channel deletion (robust to SK3 deletion, sensitive to Kv4.3 deletion) that can be revealed in physiological and pathophysiological conditions. This work will help understanding how ion channel mutations may alter SNc DA neuron vulnerability in Parkinson's disease

Dans les sols résistants, la communauté microbienne rhizosphérique protège la plante des maladies, mais la recherche des microorganismes impliqués n’a pas été systématique et peu de microorganismes contribuant à cette protection sont connus. L’objectif de cette thèse était de caractériser la communauté bactérienne rhizosphérique du tabac dans les sols résistant à la pourriture noire des racines (causée par Thielaviopsis basicola) par la comparaison de différents sols, résistants ou sensibles. L’analyse par puce à ADN (développée dans ce travail à partir de prototypes préexistants) a révélé des différences importantes entre un sol résistant et un sol sensible, suggérant que la résistance du sol pourrait résulter de la contribution de consortia bactériens à la santé de la plante. Au champ, la communauté bactérienne dépendait principalement de l’année et de l’espèce de plante échantillonnée, mais un patron de communauté caractéristique des sols résistants a été identifié. Azospirillum, Herbaspirillum et Sphingomonadaceae sont ainsi proposés comme bioindicateurs de la résistance au champ. La comparaison de sols résistants ou non, prélevés dans différentes régions, a montré que la communauté rhizobactérienne dépendait plus de la région de prélèvement que du caractère résistant des sols. En conclusion, des bioindicateurs de la résistance du sol à la pourriture noire des racines ont été identifiés dans ce travail, ce qui élargit la gamme des taxa bactériens potentiellement impliqués dans la résistance du sol
In disease suppressive soils, the rhizosphere microbial community protects plants from disease but only few microorganisms contributing to suppressiveness have been identified so far. The objective of the thesis was to characterize the rhizosphere bacterial community of soils suppressive to tobacco black root rot (caused by Thielaviopsis basicola) with a 16S taxonomic microarray (developed from previous prototypes). Microarray analysis of rhizobacterial communities from tobacco grown under greenhouse conditions revealed many differences in community composition between suppressive and conducive soil, indicating that black root rot suppressiveness may be brought about by the contribution of different plant-beneficial bacteria. In farmers’ fields, the rhizobacterial community was largely influenced by sampling year and plant species, however, a community pattern characteristic for suppressive soils could be identified despite varying field conditions. Based on these findings, Azospirillum, Herbaspirillum and Sphingomonadaceae were proposed as suppressiveness bioindicators in fields. Comparison of black root rot suppressive and conducive soils from different regions revealed that the rhizobacterial community was mainly determined by the region of origin, while suppressiveness was a less important factor. In conclusion, this work identified novel bacterial taxa that could serve as disease suppressiveness indicators, and it extends the range of bacterial taxa hypothesized to participate to black root rot suppression

Reproduction de : Thèse de doctorat : Physiologie, biologie des organismes, populations, interactions : Poitiers : 2008.
Textes en français et en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 240 réf.

La commande motrice de l’appareil respiratoire requiert une coordination précise des muscles des voies aériennes supérieures (VAS) et de la pompe thoracique. Une modulation différentielle de ces deux groupes de muscles respiratoires est observée dans le sommeil normal ou les apnées obstructives. Nous avons exploré dans ce cadre de façon sélective les noyaux du raphe médullaire (RM) par stimulation électrique haute-fréquence (HFS) ainsi que le système sérotoninergique par modulation centrale des récepteurs 5-HT1A chez le rat anesthésié. La modulation différentielle des VAS a été reproduite par les agonistes et antagonistes 5-HT1A et par HFS des noyaux du raphe pallidal (RPa) et partie ventrale du raphe Obscurus. L’étude CFos a précisé les cibles cérébrales respiratoires. Nos données supportent l’hypothèse de l’implication du RM et du système sérotoninergique dans la modulation respiratoire différentielle des VAS lors des phases de transitions veille-sommeil. Dans ce travail nous avons examiné la fonctionnalité des cellules embryonnaires du mésencéphale ventral transplantées dans la substance noire dans un modèle animal de la maladie de Parkinson. Deux mois après transplantation, la mesure in-vivo de l’activité électrophysiologique par méthode extracellulaire des cellules transplantées montrait la présence d’une activité électrique identique à celle de neurones normaux de la SNc suggérant la maturation et fonctionnalité de type dopaminergique-like des neurones greffés. Les modulations par stimulations striatales anti et orthodromiques de ces neurones transplantés ont suggéré également la restitution de la fonctionnalité de la boucle nigrostriée
Breathing requires a fine coordination of the motor command distributed to the various respiratory muscles, including upper airway (UAM) and pump muscles. The differential respiratory modulation of the UAM and the diaphragm (DIA) muscles is poorly understood although it is relevant for the understanding of both physiological and pathological conditions such as sleep-wake stages transitions and Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS). In this context, we investigated the respiratory effects induced by high-frequency stimulation (HFS) of various nuclei of the medullary raphe (MR) or by pharmacological manipulations of the serotonergic transmission in the anesthetized rat. Our results showed that a differential respiratory modulation of UAM/DIA occurred after HFS of Raphe Pallidus (RPa) and ventral Raphe Obscurus (vROb), as well as after injections of agonist and antagonist acting on 5HT1A receptors. Experiments based on c-Fos expression revealed several brainstem structures potentially involved in these respiratory effects. These findings support the hypothesis that MR and serotonergic system are key structure in differential respiratory modulation of UAM during sleep-wake states transitions. We explored embryonic cells originated from ventral mesencephal and transplanted within substantia nigra in a model of Parkinson disease by using extracellular electrophysiology. Two months after transplantation, transplanted cells showed electrophysiological characteristics of dopaminergic-like neurons and orthodromic and antidromic stimulations also suggested functional recovery of nigro-striatal loop

Les protéines alpha-synucléine (α-syn) et leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sont deux protéines ayant un rôle majeur dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson (MP) et interviennent aussi bien dans les formes dites sporadiques que dans les formes familiales. La mutation G2019S du gène codant pour LRRK2 est la mutation la plus fréquente. Cette mutation induit une augmentation de l’activité kinase de LRRK2 qui conduit à sa toxicité. Plusieurs hypothèses convergent vers l’idée que LRRK2 et l’α-syn interagiraient pour conduire à la dysfonction et/ou la mort des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SNc) dans la MP. Dans la première partie de cette étude, différentes formes sauvage (WT) ou mutée (G2019S) de LRRK2 ont été surexprimées spécifiquement dans les neurones de la SNc via l’utilisation de vecteurs lentiviraux (LV) et adéno-viraux associés (AAV). La question principale de cette étude était d’évaluer si l’expression spécifiquement neuronale de LRRK2 induisait la dégénérescence des neurones DA de la SNc. Nous avons généré des constructions comportant uniquement la partie C-terminale de LRRK2 (ΔLRRK2) en aval du domaine LRR. In vitro, le fragment ΔLRRK2G2019S présente une activité kinase supérieure au fragment ΔLRRK2WT avec une augmentation d’activité comparable à la forme entière de LRRK2. In vivo, six mois après l’injection (PI) de ΔLRRK2 WT ou G2019S dans la SNc, les mesures du nombre de neurones montrent que seul le fragment ΔLRRK2G2019S induit une mort neuronale significative (30%) comparé à la forme ΔLRRK2WT, uniquement lorsque l’expression est générée via des vecteurs AAV. Ces résultats suggèrent que l’expression purement neuronale d’un fragment contenant le domaine kinase de LRRK2 est suffisante pour induire une dégénérescence de la SN. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié l’hypothèse que ΔLRRK2G2019S via son activité kinase amplifiée, pourrait augmenter la toxicité le l’α-syn mutée A53T. Pour répondre à cette question, les vecteurs AAV codant pour ΔLRRK2 G2019S ou une forme inactive de la kinase (ΔLRRK2G2019S/D1994A), et celui codant pour l’α-syn A53T ont été co-injectés dans la SNc. Les analyses réalisées à 6 et 15 semaines PI montrent que ΔLRRK2G2019S augmente la mort neuronale induite par l’α-syn A53T d’une manière kinase dépendante. Tous ces résultats supportent l’hypothèse que l’existence d’une interaction fonctionnelle entre LRRK2 et l’α-syn pourrait jouer un rôle fondamental dans la physiopathologie de la MP offrant des possibilités de stratégie de neuroprotection ciblant l’interaction LRRK2/α-syn
Alpha-synuclein (α-syn) and leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) proteins are likely to play crucial roles both in sporadic and familial forms of Parkinson’s disease (PD). The most prevalent mutation in LRRK2 is the G2019S substitution which induces neurotoxicity through a marked increase of its kinase activity. A possible interplay between LRRK2 and α-syn may be involved in the dysfunction and/or in the death of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SNc) in PD. In the first part of the study, we evaluated whether the overexpression of LRRK2G2019S using lentiviral vectors (LVs) and adeno-associated virus (AAV2/9), which can overexpress transgenes selectively in neurons could trigger neurodegeneration in the SNc, in other words, whether cell-autonomous mechanisms are sufficient to trigger the degeneration of DA neurons. We generated constructs corresponding to the C-terminal domain of LRRK2 (ΔLRRK2) containing the kinase domain. Results of assays performed in vitro indicated that ΔLRRK2 retains biochemical properties of full length LRRK2. Six months after the stereotaxic injection of LV-ΔLRRK2G2019S in the SNc, the number of DA neurons was unchanged, however, the infection of the SNc with AAV-ΔLRRK2G2019S but not with AAV-ΔLRRK2WT induced a significant ~30% loss of DA neurons. These results suggested that neuronal overexpression of the mutant kinase domain of LRRK2 was sufficient to trigger neurodegeneration in the SNc in the adult brain. In the second part of the study, we aimed at studying whether ΔLRRK2G2019S could increase the neurotoxicity of a mutant form of α-syn (A53T mutation) in vivo in DA neurons. We used a co-infection approach with AAV vectors encoding the α-synA53T, and ΔLRRK2 G2019S alone or with the D1994A mutation (ΔLRRK2G2019S/D1994A) that inactivates the kinase activity of LRRK2. AAVs were stereotaxically co-injected into the rat SNc and histological evaluation was performed at 6 and 15 weeks (early and late time points) post-infection. Results showed that ΔLRRK2G2019S increased the toxicity of α-synA53T in a kinase-dependent manner. Altogether, the present study supports the hypothesis that a functional interaction between LRRK2 and α-syn may play a key role in PD pathogenesis. The new “double hit” model we developed in rats may be of interest to test novel neuroprotective strategies targeting LRRK2/α-syn in vivo

Les troubles du sommeil, tels que la somnolence diurne excessive et les attaques narcoleptiques, sont fréquemment observés chez les patients Parkinsoniens. Malgré de nombreux efforts cliniques à l’échelle mondiale, il reste à déterminer si ces troubles sont causés par les lésions neuronales dopaminergiques (DAergiques) ou non DAergiques, par les troubles moteurs ou par les effets délétères des médicaments anti-parkinsoniens. Par une approche pluridisciplinaire (analyse EEG; mesure de l’activité locomotrice; tests pharmacologiques; immunohistochimie) chez le félin traité au MPTP, nous avons étudié la corrélation possible entre perte DAergique et troubles du cycle veille-sommeil (V/S). Le MPTP (5mg/kg/jour x5, i.p.) induit en période aiguë, une hypersomnie en sommeil lent (SL), une suppression du sommeil paradoxal (SP), ainsi qu’une diminution de la locomotion et une difficulté à l’initiation des mouvements. Les agonistes DAergiques (L-dopa; ropinirole) empêchent l’hypersomnie en SL de façon transitoire. Durant la période chronique, les taux d’éveil et de SL reviennent à la normale. Le SP augmente transitoirement et s’associe à des épisodes narcoleptiques. Les analyses ex-vivo révèlent une diminution du marquage TH (corps cellulaire de la substance noire ; fibres du striatum). Le marquage des neurones cholinergiques (cerveau antérieur basal et tegmentum mésopontique) semblent inchangée. Nos résultats montrent donc que le MPTP induit chez le félin des symptômes moteurs et des troubles du sommeil proches de ceux observés chez les patients parkinsoniens. Cette étude suggère également une corrélation possible entre les troubles du cycle V/S et la perte des cellules DAergiques
Motors disorders are not the only symptoms of Parkinson disease (PD), and sleep disorders such as somnolence and narcolepsy are frequently reported in PD patients. Despite much investigation worldwide, it remains unknown whether these disorders are caused by dopaminergic (DArgic), non-DArgic neural lesions, nocturnal motor disability or deleterious effect of anti-PD drugs. Using multiple experimental approaches (EEG and sleep-wake recordings/pharmacological dosing / immunohistochemistry) in cats treated with MPTP, which causes DArgic neuronal loss, we have studied the possible correlation between the induced effects on the sleep-wake (S/W) cycle and those on DArgic neurons. MPTP (5mg/kg/day x 5, i.p.) caused, during the acute period, a slow wave sleep hypersomnia (SWS, up to 80% of recorded time) and a suppression of paradoxical sleep (PS), accompanied with pronounced behavioural somnolence, marked decrease in locomotion and difficulty to initiate movements. DArgic agonists L-dopa and ropinirole transiently prevented hypersomnia in SWS. During the chronic period, whereas the amount of W and SWS returned to control, PS transiently increased, associated with narcolepsy-like episodes. Ex-vivo analyses revealed marked decrease in TH labelling (cell bodies in the substantia nigra and terminal-like dots in the striatum) whereas cholinergic neurons in the basal forebrain and mesopontine-tegmentum seemed unchanged. Thus, MPTP treated cats showed major signs of motor and S/W disorders similar to those seen in PD patients and so could serve as useful animal model. Our results also suggest a possible correlation/causality between the MPTP-induced S/W disorders and DArgic cell loss

Ces dernières années de nombreux marqueurs de l’atteinte nigrostriatale ont été élaborés et testés dans la maladie de Parkinson (MP). Ces marqueurs peuvent détecter et quantifier la neurodégénérescence dans la substance noire (SN) des patients ainsi que dans les formes précoces prémotrices de la maladie. Leur performance diagnostique reste mal connue de même que l’atteinte extra-nigrale.Dans ce travail nous avons étudié l’atteinte de la SN dans les formes précliniques et prémotrices de la MP. La charge en fer était augmentée chez des porteurs des mutations symptomatiques mais également chez des porteurs sains. De plus, nous avons observé une atteinte pré-motrice de la SN chez des sujets touchés par les troubles des comportements en sommeil paradoxal (TCSP) qui n’ont pas encore développé un syndrome parkinsonien. Chez ces sujets, l’atteinte de la SN a été le mieux mise en évidence par l’imagerie sensible à la neuromélanine et le tenseur de diffusion avec la fraction d’anisotropie, suggérant un intérêt dans la caractérisation prodromale de la MP. Ces mêmes marqueurs présentaient également la meilleure performance diagnostique dans la MP. Finalement, nous avons trouvé des anomalies bulbaires en tenseur de diffusion dans la MP, qui étaient corrélées aux symptômes dysautonomiques cardiaques et respiratoires, suggérant l’intérêt de ce marqueur pour étude de l’atteinte bulbaire. Ceci ouvre une possibilité d’étude bulbaire chez des sujets présymptomatiques car une atteinte bulbaire devrait apparaître avant les symptômes moteurs selon le modèle de Braak. Ces marqueurs sont peut-être la première étape vers un diagnostic présymptomatique de la MP dans la pratique clinique
In recent years numerous biomarkers of nigro-striatal damage were proposed in Parkinson's disease (PD). These markers are able to detect and quantify neurodegenative changes in the substantia nigra (SN) of patients with PD as well as in subjects with premotor conditions. Their diagnostic performances to detect PD as well as the extent of extranigral pathology remain incompletely understood.In this work we observed the damage of the substantia nigra in preclinical and premotor forms of PD. Iron load was increased in both symptomatic and asymptomatic mutations carriers, suggesting the interest of the biomarker in PD related genetic mutations. In addition, we found a pre-clinical impairment of the SN in subjects affected by idiopathic sleep in REM behavioral disorders (iRBD) who have not yet converted to Parkinsonism. In these subjects, the SN damage was best demonstrated by neuromelanin-sensitive imaging and diffusion tensor imaging (DTI) with fractional anisotropy measure, suggesting an interest of these measures in the prodromal characterization of PD. These same markers had the best performance for PD diagnosis.Finally, we found medulla oblongata damage patients with PD using DTI. This damage was correlated with cardiac and respiratory autonomic symptoms, suggesting the importance of this biomarker in medulla oblongata damage exploration. It also opens a possibility of medulla oblongata study in presymptomatic subjects as medulla oblongata damage should appear before motor symptoms based on the Braak model.These biomarkers may be the first step towards a presymptomatic diagnosis of PD in clinical practice

L'anlyse phénotypique et le pouvoir pathogène de 84 souches bactériennes isolées de la moëlle noire au Portugal, ont montrée que P. Corrugata, P. Mediterranea, P. Viridiflava et les pseudomanas fluorescents "oxydase positive" représentent les bactéries prépondérantes dans l'étiologie de la maladie. Pour la première fois il est montré que P. Marginalis peut être un pathogène associé à cette maladie de la tomate. La présence de P. Cichorii est signalée également. L'analyse phénotypique de 119 caractéristiques a montrée que la majorité des isolats se place dans deux phénons, correspondant à P. Corrugata et P. Mediterranea. L'identification par multiplex-PCR a conduit à l'obtention de quatre profils différents à l'intérieur de l'espèce P. Corrugata. L'identification de souches portugaises (Pmc) qui présentent des caractéristiques intermédiaires entre P. Corrugata et P. Mediterranea, a montrée que le 2-cétogluconate n'est plus un caractère discriminant pour ces deux espèces. La diversité génétique de 63 isolats de P. Corrugata et P. Mediterranea évaluée par REP, ERIC et BOX-PCR et par ITS-HMA a mis en évidence trois groupes génétiques : P. Corrugata, P. Mediterranea et un nouveau lignage constitué uniquement par des souches portugaises (Pmc). Les résultats des hybridations DNA-DNA suggèrent l'existence de nouvelles espèces ou sous-espèces. La Bio-PCR s'est révélée une technique de choix pour la détection de P. Corrugata, P. Mediterranea, Pmc et P. Viridiflava, sur les racines et les organes aériens de la tomate, en absence de tout symptôme de maladie
Phenotypic and pathogenic characterization of 84 strains isolated from tomato with symptoms of pith necrosis (TPN) in Portugal, showed that P. Corrugata, P. Mediterranea, P. Viridiflava and fluorescents Pseudomonas "oxydase positive", are the most imortant bacteria associated with the etiology of this disease. We discovered that, together with P. Cichorii, P. Marginalis is also a pathogen of TPN. Numerical analysis of 119 phenotypic characteristics placed the majority of the isolates in two distinct groups corresponding to P. Corrugata and P. Mediterranea species. Comparing these results with multiplex-PCR identification, we found four distinct profiles within P. Corrugata, some of strains sharing characteristics of P. Mediterranea. Consequently, we propose that the 2-ketogluconate to be no longer used as a discriminant substrate of these two species. The genetic diversity of 63 strains of P. Corrugata and P. Mediterranea evaluated by REP, ERIC and BOX-PCR, and by the ITS-HMA technique, allowed discrimination of three genetic groups corresponding to P. Corrugata and P. Mediterranea species, and a new genetic group, consisting of portuguese strains only (Pmc). Together with DNA-DNA hybridization studies, these results suggested the existence of new Pseudomonas species or sub-species. Bio-PCR used to detect and monitoring populations of P. Corrugata, P. Mediterranea, Pmc and P. Viridiflava in the soil and on tomato tissues in the absence of symptoms, provided new information on the epidemiology of the disease

Les bactéries du sol produisant des antifongiques comme le 2,4-diacétylphloroglucinol(DAPG) protègent les racines des plantes vis-à-vis des champignons phytopathogènes. Néanmoins, les conditions de fonctionnement de ces populations bactériennes dans le sol restent très mal connues. Dans certains sols, dits résistants aux maladies, ces bactéries phytoprotectrices sont présentes à des effectifs importants et leur activité est suffisante pour protéger la plante malgré la présence du pathogène. L'objectif de cette thèse a été de comprendre la relation entre la résistance des sols à la maladie de la pourriture noire des racines de tabac, et la fonction de synthèse du DAPG chez les bactéries du genre Pseudomonas. Dans la situation de référence de Morens (Suisse), les sols résistants diffèrent des sols sensibles par la présence de vermiculite, argile capable de relarguer du fer. On sait que la présence de vermiculite améliore la phytoprotection assurée par les Pseudomonas producteurs de DAPG, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Dans un premier temps, la quantification de ces bactéries par une nouvelle méthode de PCR quantitative développée ici, a confirmé que leurs effectifs sont élevés dans les sols résistants, mais aussi dans les sols sensibles, suggérant que la résistance puise plutôt dépendre d'une plus forte expression de la fonction de synthèse du DAPG. Dans un second temps, l'étude de l'expression des gènes de synthèse du DAPG en système de sol artificiel, à l'aide de la souche rapportrice P. protegens phlA-gfp, a montré que la présence de vermiculite dans le sol se traduit par une plus forte biodisponibilité du fer pour les Pseudomonas, induisant une plus forte expression des gènes de synthèse du DAPG et la protection du tabac. En conclusion, la résistance des sols de Morens à la maladie de la pourriture noire des racines est conditionnée par plusieurs facteurs abiotiques et biotiques, dont la biodisponibilité du fer qui régule l'expression des gènes de synthèse du DAPG chez Pseudomonas
Soil bacteria producing antimicrobial compounds like 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) protect plants from soil-borne phytopathogens. Nevertheless, the functioning of these bacterial populations in the soil is largely unknown. In certain soils, termed disease- suppressive soils, these bacteria are present at high numbers and their activity is sufficient to assure effective plant protection in the presence of the pathogen. The aim of this thesis was to understand the relation between soil suppressiveness towards black root rot of tobacco, and the 2,4-diacetylphloroglucinol synthesis ability of certain Pseudomonas. In Morens region (Switzerland), suppressive soils differ from conducive soil by the presence of vermiculite, an iron-releasing clay. It is known that DAPG-producing Pseudomonas provide better plant protection in the presence of vermiculite, but the molecular basis of this interaction is still unknown. First, the quantification of these bacteria, through a new real-time PCR method developed here, confirmed that high numbers of DAPG-producing Pseudomonas occur in suppressive soils, as well as in conducive ones, raising the possibility that suppressiveness depends rather on a higher expression of DAPG synthetic genes. Second, expression studies of DAPG synthetic genes using a P. protegens ph/A- gfp reporter strain and artificial soil systems, confirmed that the presence of vermiculite in the soil can translate into higher iron bioavailability for Pseudomonas, triggering higher expression of DAPG synthetic genes and effective plant protection. In conclusion, black root rot suppressiveness of Morens soils is determined by several abiotic and biotic factors, among which iron bioavailability regulating the expression of DAPG synthetic genes in plant-protecting Pseudomonas

Ce travail de thèse porte sur l'étude de la réaction microgliale et des interactions microglie/neurones dans un modèle murin de neurodégénérescence dopaminergique induit par l'injection de 6‐hydroxydopamine (6‐ OHDA). Dans ce modèle, nous décrivons tout d'abord les cinétiques d'activation microgliale, de perte neuronale et d'altérations comportementales en relation avec le déficit dopaminergique. Dans la substance noire lésée ont été observées une perte progressive des neurones dopaminergiques TH+ (Tyrosine Hydroxylase) ainsi qu'une activation microgliale précoce mais transitoire. Le rôle délétère de cette activation microgliale est fortement suggéré par la mise en évidence d'une protection partielle contre la toxicité induite par la 6‐OHDA dans des souris génétiquement modifiées DAP12 Knock‐In, dont la densité microgliale est constitutivement diminuée. Par ailleurs, nous avons identifié différents types de contacts intercellulaires entre les neurones et la microglie de la substance noire lésée. Ces interactions physiques sont matérialisées entre autres sous la forme de contacts intimes entre le corps cellulaire des cellules microgliales et le soma des neurones dopaminergiques. De façon intéressante, ce type d'interaction se met en place quelques jours avant le pic de mort neuronale et dans la grande majorité des cas, concerne des neurones présentant des signes morphologiques d'apoptose. Finalement, nous avons également identifié un nouveau type d'interaction physique entre neurones et microglie sous la forme de ramifications microgliales pénétrant le soma des neurones. Ces interactions s'apparentent aux "tunelling nanotubes" décrits dans la littérature et représentent un type particulier de ramifications microgliales perforantes que nous avons nommées "tunelling ramifications". La présence de vacuoles TH+ dans le cytoplasme de nombreuses cellules microgliales suggère que les ramifications microgliales pénétrantes sont le support d'un processus de microphagocytose ciblant le cytoplasme des neurones dopaminergiques. La fonction précise de ces interactions et les mécanismes moléculaires qui les suscitent restent à définir. Toutefois, ce travail de thèse apporte un ensemble de données originales sur le dialogue microglie/neurones dans un modèle murin de la maladie de Parkinson
This thesis work is aimed to study microglial reaction and microglia/neuron interactions in a murine model of dopaminergic neurodegeneration induced by the injection of 6‐hydroxydopamine (6‐OHDA). In this model, we first describe the kinetics of microglial activation, neuronal cell loss and behavioral alterations in relation with the dopaminergic defect. In the injured substantia nigra, we observed a progressive loss of TH+ (Tyrosine Hydroxylase ‐positive) dopaminergic neurons and an early but transient microglial activation. The deleterious role of microglial activation is strongly suggested by the observation of a partial neuroprotection against 6‐OHDA‐induced toxicity in genetically DAP12 Knock‐In mice, in which microglial cells are defective in regard to their number and function. In addition, we identified various types of cell‐tocell contacts between neurons and microglia in the injured substantia nigra. Such physical interactions were established between microglia and neuronal cell bodies several days before the peak of neuronal death and in the majority of cases in neurons showing morphological signs of apoptosis. Finally, we also identified a new type of physical interactions consisting in microglial ramifications penetrating the soma of TH+ neurons. These interactions present similarities with the so‐called « tunelling nanotubes » previously described in the literature and represent a particular type of penetrating microglial ramifications the we named "tunelling ramifications.". Interestingly, in the injured substantia nigra, the presence of TH+ vacuoles in the cytoplasm of numerous microglial cells strongly suggests that microglial ramifications support microphagocytosis targeted toward the cytoplasm of dopaminergic neurons. The precise function and molecular mechanisms of such unique interactions need to be further assessed. However, our work provides a set of original data that deepens our knowledge on the dialogue between microglia and neurons in a mouse model of Parkinson's disease

Ce travail de thèse décrit et analyse la réaction neuro-inflammatoire accompagnant la mort cellulaire neuronale dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Dans ce modèle, induit par l’injection intrastriatale d'un analogue toxique de la dopamine, la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), nous décrivons les caractéristiques et la cinétique de l’activation microgliale, de l'infiltration lymphocytaire T, de la perte de neurones dopaminergiques TH+ (Tyrosine Hydroxylase) et des altérations du comportement moteur. Nos observations sont complétées par une étude neuropathologique de la substance noire chez des patients atteints de maladie de Parkinson. Les résultats montrent que, chez l'homme comme chez la souris, la mort de neurones dopaminergiques induit une infiltration T de faible intensité, limitée à la substance noire et s'accompagnant d'une activation microgliale. Dans un deuxième temps, nous analysons l'impact d'une déficience lymphocytaire T génétiquement déterminée sur les paramètres histologiques et fonctionnels caractérisant le modèle 6-OHDA. Nos résultats montrent que, comparées à des souris contrôles immunocompétentes, les souris immunodéficientes de souche Foxn1 KO, CD3 KO, NOD SCID ou RAG1 KO présentent toutes, à des degrés divers, une susceptibilité significativement accrue aux effets neurotoxiques de la 6-OHDA. L'aggravation observée de la perte neuronale s'accompagne d'une accentuation majeure des troubles du comportement moteur et de l'activation microgliale. Ce travail démontre l'importance de la neuro-inflammation et de l'immunité adaptative dans la physiopathologie du modèle 6-OHDA. Il suggère également que les LyT infiltrant la substance noire des patients atteints de maladie de Parkinson exercent un rôle inhibiteur sur l'activation microgliale et pourraient par ce mécanisme ralentir l'évolution de la perte neuronale dopaminergique. En résumé, ce travail de thèse apporte un ensemble de données originales sur les interactions entre LyT, microglie et neurones dopaminergiques dans le contexte de la maladie de Parkinson et du modèle murin 6-OHDA
This thesis work describes and analyzes the neuroinflammatory reaction that accompanies neuronal cell death in a murine model of Parkinson's disease. In this model, induced by the intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA), a toxic dopamine analog, we report on the main features and kinetics of microglial activation, T-cell infiltration, loss of TH+ (Tyrosine Hydroxylase) dopaminergic neurons and motor behavior alterations. We also assessed the presence of T-cells in the susbstantia nigra of Parkinson's disease patients and found that, as observed in the 6-OHDA murine model, the neuronal cell death of dopaminergic neurons triggers a low-grade T-cell infiltration that accompanies microglial activation. We then studied the impact of genetically-determined T-cell immunodeficiency on histological and functional outcomes in the 6-OHDA model. Our results show that, as compared to immunocompetent control mice, immunodeficient strains consisting in Foxn1 KO, CD3 KO, NOD SCID or RAG KO mice consistently presented, at varied levels, a highest susceptibility to 6-OHDA induced dopaminergic neurodegeneration. The observed accentuation of neuronal cell loss was accompanied by a marked increase of microglial activation and motor behavior alterations. Our work demonstrates the pathophysiological role of neuroinflammation and adaptative immunity in the 6-OHDA model. It also suggests that T-cells infiltrating the substantia nigra of Parkinson's disease patients dampen microglial activation and could, via this inhibitory effect, slow the progression of dopaminergic cell loss. Overall this thesis work provides original data on the interactions between T-cells, microglia and dopaminergic neurons in the context of Parkinson's disease and the murine 6-OHDA model

Lily leaf spot is an emerging disease of the globally rare Lilium grayi S. Wats., a species endemic to the southern Appalachian Blue Ridge, USA. The species is considered Threatened or Endangered in the three states where it naturally occurs (North Carolina, Tennessee, Virginia). Disease leads to premature senescence of aboveground tissues and curtailment of sexual reproduction. Spore morphology, completion of Koch’s postulates, and DNA sequence data showed the causative agent of lily leaf spot to be Pseudocercosporella inconspicua (G. Winter) U. Braun, a Lilium-specific basidiomycete. Diagnostic disease symptomatology includes amphigenous necrotic lesions with tan to green margins encircling a white to grey powdery mass of conidia. Studies conducted in the field at Roan Mountain, NC/TN, in the largest known population, showed that a visual disease diagnosis based on morphology can be highly accurate in predicting P. inconspicua infection, and that high concentrations of conidia of P. inconspicua are strongly associated with infected L. grayi, but are largely absent or few on uninfected L. grayi and other species. Field inoculation trials using infected L. grayi leaf tissue as inocula resulted in transmission of disease and induction of premature senescence under natural conditions.

Reliant le cerveau à la moelle épinière, le tronc cérébral (TC) est une zone de convergence des voies motrices et sensitives. Il comporte différents noyaux, responsables de diverses fonctions comme la motricité, la régulation des rythmes respiratoires et cardiaques, l'origine de nerfs crâniens. Malgré une importance dans différentes pathologies neurodégénératives, l'exploration in vivo du TC reste encore aujourd'hui un enjeu à relever. La résolution employée, le faible contraste et sa localisation rendent son étude difficile en imagerie par résonance magnétique (IRM) conventionnelle. A partir de différentes séquences IRM avancées, nous avons réalisé, chez une population de patients parkinsoniens, une étude de la substance noire (SN), zone située dans la partie haute du TC. Les résultats montrent que l'imagerie du fer associée à l'imagerie de l'eau libre suggère des processus physiopathologiques sous-jacents différents. Néanmoins, aux vues de la taille des structures étudiées, le besoin de précision reste nécessaire pour une identification avec plus de fiabilité. L'originalité de la proposition est de développer une méthode dédiée au TC, afin de pallier au mieux, les difficultés de son observation. Par une optimisation des acquisitions IRM, et plusieurs traitements d'images, les résultats obtenus montrent la possibilité d'identifier facilement certaines structures et une stabilisation des valeurs quantitatives. Pour terminer, toujours dans l'objectif de l'amélioration des mesures IRM, nous nous sommes intéressés à l'IRM sur pièces anatomiques humaines. L'IRM post-mortem est utilisé dans le cadre de cette thèse pour la mise en évidence et la quantification des métaux (fer) et la corrélation avec des techniques histologiques
Connecting the brain to the spinal cord, the brain stem Brainstem (BST) is an area of convergence of motor and sensory pathways. It has different nuclei, responsible for various functions such as motor skills, regulation of respiratory and cardiac rhythms, the origin of cranial nerves. Despite its importance in various neurodegenerative diseases, in vivo exploration of BST is still a challenge today. The resolution used, the low contrast and its location make it difficult to study in conventional magnetic resonance imaging (MRI). Based on various advanced MRI sequences, we carried out a study of the substantia nigra (SN) in a population of Parkinson's patients, an area located in the upper part of the BST. The results show that iron imaging combined with free water imaging suggests different underlying pathophysiological processes. Nevertheless, given the size of the structures studied, the need for precision remains necessary for more reliable identification. The originality of the proposal is to develop a method dedicated to BST, in order to best overcome the difficulties of its observation. By optimizing MRI acquisitions and several image processing, the results obtained show the possibility of easily identifying certain structures and stabilizing quantitative values. To conclude, still with the objective of improving MRI measurements, we were interested in MRI on human anatomical parts. Post-mortem MRI is used in this thesis for the detection and quantification of metals (iron) and correlation with histological techniques

La sequence de l'arn-2 de l'isolat s comporte une seule phase de lecture ouverte qui correspond a une proteine de p. M. 150 k. La proteine de la coque est localisee dans la region c terminale de la proteine 150 k. Une proteine "de diffusion" se situerait en amont de la proteine de la capside. Les sequences des arn satellites issus d'isolats appartenant aux serotypes s (s et l) et g (g, e et c) comportent toutes une seule phase de lecture ouverte correspondant a une proteine de 48 k. La comparaison des sequences permet de distinguer 2 groupes: les arn s et l d'une part, les arn g, e et c, d'autre part. A l'interieur de chaque groupe, les arn presentent plus de 90% d'homologie de sequence tandis que 63% des nucleotides sont communs aux 5 arn etudies

RESUME

La Trypanosomiase Humain Africaine (THA) demeure un problème de santé publique pour plusieurs pays en Afrique subsaharienne. Le contrôle de la THA est basé essentiellement sur la stratégie de dépistage actif suivi du traitement des personnes infectées. Le dépistage actif est réalisé par des unités mobiles spécialisées, bien que les services de santé fixes jouent un rôle important en détectant « passivement » des cas. Le dépistage reposait jadis sur la palpation ganglionnaire mais, depuis le développement du test d’agglutination sur carte (CATT), trois possibilités se sont offertes aux programmes de contrôle à savoir: i) continuer avec la palpation ganglionnaire ii) combiner la palpation ganglionnaire avec le CATT iii) recourir au CATT seul. Certains programmes comme celui de la République Démocratique du Congo (RDC) ont opté pour la combinaison en parallèle de la palpation ganglionnaire avec le CATT. Toute personne ayant une hypertrophie ganglionnaire cervicale et/ou un CATT positif est considéré comme suspecte de la THA. Elle sera soumise aux tests parasitologiques de confirmation à cause de la toxicité des médicaments anti-THA. Les tests parasitologiques classiques sont l’examen du suc ganglionnaire (PG), l’examen du sang à l’état frais (SF), la goutte épaisse colorée (GE). La sensibilité de cette séquence a été estimée insuffisante par plusieurs auteurs et serait à la base d’une grande perte de l’efficacité de la stratégie dépistage-traitement. D’autres techniques de concentration ont été développées comme la mini-Anion Exchange Concentration Technique (mAECT), la Centrifugation en Tube Capillaire (CTC) et le Quantitative Buffy Coat (QBC), mais ces techniques de concentration ne sont pas utilisées en routine.

En RDC, une interruption des activités de contrôle en 1990 a eu comme conséquence une réémergence importante de la maladie du sommeil. Depuis 1998 les activités de contrôle ont été refinancées de manière structurée.

Ce travail vise deux buts à savoir le plaidoyer pour la continuité des activités de contrôle et la rationalisation des stratégies de contrôle. Nous avons évalué l’évolution de la maladie du sommeil en rapport avec le financement, son impact sur les ménages ainsi que la communauté. L’exercice de rationalisation a porté sur les outils de dépistage et de confirmation. Nous avons d’abord évalué la validité des tests, leur faisabilité ainsi que les coûts et ensuite nous avons effectué une analyse décisionnelle formelle pour comparer les algorithmes de dépistage et pour les tests de confirmation.

Pendant la période de refinancement structurel de la lutte contre la THA en RDC (1998-2003), le budget alloué aux activités a été doublé lorsqu’on le compare à la période précédente (1993-1997). Le nombre des personnes examinées a aussi doublé mais par contre le nombre des nouveaux cas de THA est passé d’un pic de 26 000 cas en 1998 à 11 000 en 2003. Le coût par personne examinée a été de 1,5 US$ et celui d’un cas détecté et sauvé à 300 US$. Pendant cette période, les activités ont été financées par l’aide extérieure à plus de 95%. Cette subvention pourrait laisser supposer que l’impact de la THA au niveau des ménages et des communautés est réduit mais lorsque nous avons abordé cet aspect, il s’est avéré que le coût de la THA au niveau des ménages équivaut à un mois de leur revenu et que la THA fait perdre 2145 DALYs dans la communauté. L’intervention par la stratégie de dépistage-traitement a permis de sauver 1408 DALYs à un coût de 17 US$ par DALYs sauvé. Ce coût classe l’intervention comme « good value for money ».

Le recours au CATT seul s’est avéré comme la stratégie la plus efficiente pour le dépistage actif. Le gain marginal lorsque l’on ajoute la palpation ganglionnaire en parallèle est minime et n’est pas compensé par le coût élevé lié à un nombre important des suspects soumis aux tests parasitologiques. Les techniques de concentration ont une bonne sensibilité et leur faisabilité est acceptable. Leur ajout à l’arbre classique améliore la sensibilité de 29 % pour la CTC et de 42% pour la mAECT. Le coût de la CTC a été de 0,76 € et celui de la mAECT de 2,82 €. Le SF a été estimé très peu sensible. L’algorithme PG- GE-CTC-mAECT a été le plus efficient avec 277 € par vie sauvée et un ratio de coût-efficacité marginal de 125 € par unité de vie supplémentaire sauvée. L’algorithme PG-GE-CATT titration avec traitement des personnes avec une parasitologie négative mais un CATT positif à un seuil de 1/8 devient compétitif lorsque la prévalence de la THA est élevée.

Il est donc possible dans le contexte actuel de réduire la prévalence de la THA mais à condition que les activités ne soient pas interrompues. Le recours à un algorithme recourant au CATT dans le dépistage actif et à la séquence PG-GE-CTC-mAECT est le plus efficient et une efficacité de 80%. La faisabilité et l’efficacité peut être différent d’un endroit à l’autre à cause de la focalisation de la THA. Il est donc nécessaire de réévaluer cet algorithme dans un autre foyer de THA en étude pilote avant de décider d’un changement de politique. Le recours à cet algorithme implique un financement supplémentaire et une volonté politique.

SUMMARY

Human African Trypanosomiasis (HAT) remains a major public health problem affecting several countries in sub-Saharan Africa. HAT control is essentially based on active case finding conducted by specialized mobile teams. In the past the population screening was based on neck gland palpation, but since the development of the Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) three control options are available to the control program: i) neck gland palpation ii) CATT iii) neck gland palpation and CATT done in parallel .Certain programs such as the one in DRC opted for the latter, combining CATT and neck gland palpation. All persons having hypertrophy of the neck gland and/or a positive CATT test are considered to be a HAT suspect. Confirmation tests are necessary because the screening algorithms are not 100 % specific and HAT drugs are very toxic. The classic parasitological confirmation tests are lymph node puncture (LNP), fresh blood examination (FBE) and thick blood film (TBF). The sensitivity of this combination is considered insufficient by several authors and causes important losses of efficacy of the screening-treatment strategy. More sensitive concentration methods were developed such as the mini Anion Exchange Concentration Techniques (mAECT), Capillary Tube Centrifugation (CTC) and the Quantitative Buffy Coat (QBC), but they are not used on a routine basis. Main reasons put forward are low feasibility, high cost and long time of execution.

In the Democratic Republic of Congo, HAT control activities were suddenly interrupted in 1990 and this led to an important re-emergence or the epidemic. Since 1998 onwards, control activities were financed again in a structured way.

This works aims to be both a plea for the continuation of HAT control as well as a contribution to the rationalization of the control strategies. We analyzed the evolution of sleeping sickness in the light of its financing, and we studied its impact on the household and the community. We aimed at a rationalization of the use of the screening and confirmation tools. We first evaluated the validity of the tests, their feasibility and the cost and we did a formal decision analysis to compare screening and confirmation algorithms.

The budget allocated to control activities was doubled during the period when structural aid funding was again granted (1998-2003) compared with the period before (1993-1997). The number of persons examined per year doubled as well but the number of cases found peaked at 26 000 in 1998 and dropped to 11 000 in the period afterwards. The cost per person examined was 1.5 US$ and per case detected and saved was 300 US$. The activities were financed for 95 % by external donors during this period. This subvention could give the impression that the impact of HAT on the household and the household was limited but when we took a closer look at this aspect we found that the cost at household level amounted to one month of income and that HAT caused the loss of 2145 DALYs in the community. The intervention consisting of active case finding and treatment allowed to save 1408 DALY’s at a cost of 17 US$ per DALY, putting the intervention in the class of “good value for money”.

The use of CATT alone as screening test emerged as the most efficient strategy for active case finding. The marginal gain when neck gland palpation is added is minor and is not compensated by the high cost of doing the parasitological confirmation test on a high number of suspected cases. The concentration methods have a good sensitivity and acceptable feasibility. Adding them to the classical tree improves its sensitivity with 29 % for CTC and with 42 % for mAECT. The cost of CTC was 0.76 US$ and of mAECT was 2.82 US$. Sensitivity of fresh blood examination was poor. The algorithm LNP-TBF-CTC-mAECT was the most efficient costing 277 Euro per life saved and a marginal cost effectiveness ratio of 125 Euro per supplementary life saved. The algorithm LNP-TBF-CATT titration with treatment of persons with a negative parasitology but a CATT positive at a dilution of 1/8 and more becomes competitive when HAT prevalence is high.

We conclude that it is possible in the current RDC context to reduce HAT prevalence on condition that control activities are not interrupted. Using an algorithm that includes CATT in active case finding and the combination LNP-TBF-CTC-mAECT is the most efficient with an efficacy of 80 %. Feasibility and efficacy may differ from one place to another because HAT is very focalized, so it is necessary to test this novel algorithm in another HAT focus on a pilot basis, before deciding on a policy change. Implementation of this algorithm will require additional financial resources and political commitment.

Doctorat en Sciences de la santé publique
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Les neurones dopaminergiques de la substance noire (SNc) sont les plus vulnérables à la dégénérescence dans la maladie de Parkinson et ses modèles animaux. Suite à des travaux antérieurs et à des résultats préliminaires du laboratoire Trudeau, notre hypothèse actuelle suggère que la très grande taille de l'arborisation axonale des neurones de la SNc soit un facteur clé à l'origine de leur vulnérabilité, puisque cet état devrait être associé à un taux élevé de phosphorylation oxydative et de production de radicaux libres. En accord avec cette hypothèse, les autres populations dopaminergiques, dotées d'arborisations de moindre taille, résistent mieux aux lésions expérimentales et à la maladie chez l'humain. L'objectif du présent projet était de développer un modèle murin dans lequel les neurones de la SNc présentent une taille d'arborisation axonale plus grande, se rapprochant davantage de celle observée chez l'humain et en reproduisant la vulnérabilité, ce qui pourrait représenter une percée importante dans l'identification de nouvelles approches thérapeutiques. Basée sur le bourgeonnement axonal compensatoire des neurones dopaminergiques suite à des lésions partielles, la méthode utilisée fut l'injection unilatérale intranigrale de la toxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) à quelques jours de vie (P5), en visant l'élimination de 50% des neurones de la SNc. Un immunomarquage contre la tyrosine hydroxylase (TH), enzyme de synthèse de la dopamine, ainsi qu'une quantification du signal TH dans le striatum et des comptes neuronaux stéréologiques ont permis de quantifier la lésion partielle et de mettre en évidence la présence d'une croissance axonale compensatoire des neurones dopaminergiques survivants, à 10 et 90 jours post-lésion, suggérant une compensation précoce. Afin de mettre en évidence l'origine du bourgeonnement axonal, nous avons injecté un vecteur viral de type AAV encodant une protéine fluorescente (EYFP) dans la SNc ou la VTA des animaux adultes. Nos résultats confirment la présence de neurones nigrostriés à plus grande arborisation suivant une lésion unilatérale précoce à la 6-OHDA, dont la vulnérabilité accrue pourra être évaluée dans des expériences à venir par des protocoles lésionnels au MPTP, une toxine permettant de modéliser la maladie de Parkinson chez la souris.
Dopaminergic neurons of the substantia nigra (SNc) are amongst the most vulnerable to neurodegeneration in Parkinson's disease and its animal models. According to previous work and preliminary results in our laboratory, our present hypothesis postulates that the large axonal arborisation size of SNc neurons is a key driving factor in their vulnerability, since this characteristic is associated with increased oxidative phosphorylation levels and free radicals production. In agreement with this hypothesis, other dopaminergic populations with smaller axonal arbors better resist to experimental lesions and to the disease process in humans. The current project aims to develop a mouse model in which SNc neurons present an axonal arborisation of increased size, closer to what is encountered in humans, thus reproducing their vulnerability, which could represent an important breakthrough in the identification of new therapeutic approaches. Based on compensatory axonal sprouting of dopaminergic neurons following partial lesions, the method used was the unilateral intranigral injection of the toxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) at an early age (P5), to induce the loss of approximately 50% of SNc neurons. Immunostaining against tyrosine hydroxylase (TH), an enzyme required for the synthesis of dopamine, TH signal quantification in the striatum and stereological counting of neurons allowed for the quantification of the partial lesion and demonstrated compensatory axonal sprouting at 10 and 90 days post-lesion, with our results suggesting an early compensation. To better characterize the origin of axonal sprouting, we injected an AAV viral vector encoding a fluorescent protein (EYFP) in either the SNc or the VTA of adult animals. Our results confirm the presence of nigrostriatal neurons with increased arborisation sizes following early unilateral lesion using 6-OHDA, whose increased vulnerability will be evaluated in future experiments through lesion protocols using MPTP, a toxin used to model Parkinson's disease in mice.