Дисертації з теми "Métabolisme hépatique des lipides"

La schizophrénie est une maladie psychiatrique qui perturbe le fonctionnement social et mental des malades. Cette pathologie concerne plus de 1 % de la population mondiale et se caractérise par différents types de symptômes : positifs (hallucinations, illusions) et négatifs (perte de l’affect et de volonté, renfermement social). Ces symptômes sont contrôlés par les traitements antipsychotiques (APs) à travers la modulation des récepteurs à la dopamine et à la sérotonine. Malheureusement, certains de ces médicaments induisent d’importants effets secondaires métaboliques tels que des prises de poids (pouvant aller jusqu’à 10 kg la première année avec la clozapine par exemple), des dyslipémies, des altérations de l’homéostasie du glucose et l’apparition de diabète. Ces perturbations ont pour conséquence l’arrêt du traitement et l’augmentation des risques cardiovasculaires qui participent à la diminution de l’espérance de vie (de 10 ans en moyenne) et à l’augmentation du taux de mortalité (deux fois supérieur par rapport à la population générale). Les mécanismes d’induction de ces effets secondaires ne sont pas tous élucidés. Au niveau du système nerveux central, la liaison de ces molécules aux récepteurs sérotoninergiques, dopaminergiques ou histaminergiques est en partie responsable (en modifiant l’appétit ou l’homéostasie énergétique). Au niveau périphérique, ces APs perturbent certaines fonctions physiologiques essentielles telles que la sécrétion d’insuline par les cellules b du pancréas, le transport du glucose dans le muscle squelettique et la lipogenèse au niveau du tissu adipeux, ils altèrent également la sensibilité à l’insuline de différents tissus. Alors que le foie est l’organe de la métabolisation des xénobiotique, et qu’il est essentiel dans le maintien de l’homéostasie des nutriments, peu d’études se sont intéressées à l’influence directe de ces molécules sur ce tissu. L’objectif principal de cette thèse a consisté à examiner l’influence d’APs sur le métabolisme hépatique des lipides et du cholestérol à partir de modèles hépatocytaires adéquats, à l’aide de différents marqueurs : les synthèses de novo de lipides (acides gras, triglycérides et phospholipides) et de cholestérol (libre et estérifié), la quantification des facteurs de transcriptions matures SREBP-1 et SREBP-2 (sterol regulatory element binding protein) et l’évaluation de l’expression de gènes d’intérêt. Dans une première partie, nous avons sélectionné deux modèles cellulaires hépatocytaires (isolés de foie de rat et la lignée humaine IHH) et avons démontré leur pertinence pour l’étude des « effets adverses potentiels » de molécules sur le métabolisme des lipides et du cholestérol. Pour cela, le caractère physiologique et sensible de ces cellules a été validé au travers de leurs réponses aux variations nutritionnelles (ou hormonales) et aux traitements pharmacologiques. Dans une seconde partie, nous avons dressé un comparatif très clair des profils lipogéniques de ces molécules APs avec : -des molécules fortement inductrices de la lipogenèse et de la cholestérogenèse de novo (comme la clozapine, l’olanzapine, la risperidone et la NDMC), -des molécules avec des effets plus modérés (l’halopéridol et la palipéridone), -et des molécules avec peu ou pas d’effet(s) (l’aripiprazole, la quetiapine, le bifeprunox et la chlorpromazine). L’induction de la lipogenèse et de la cholestérogenèse de novo par certains APs est associée à la stimulation des voies SREBPs (facteurs de transcription et gènes cibles) et corrèle relativement bien avec les perturbations métaboliques cliniques observées chez les schizophrènes traités. Nous suggérons ainsi qu’une partie des effets adverses de ces molécules APs proviendrait d’une action directe sur le foie. De plus, nous avons constaté que les APs qui présentent les profils les plus délétères dans nos modèles in vitro, activent la voie PERK (protein kinase RNA-like ER kinase) de la réponse UPR (unfolding protein response), illustrant la présence d’un stress du RE. Or le stress du reticulum endoplasmique (RE) est décrit pour activer les voies SREBPs et provoquer sur du long terme des maladies telles que des stéatoses, des dyslipémies et du diabète. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes d’action de ces molécules. Plus précisément, nous montrons dans notre modèle d’hépatocytes humains que le traitement à la thapsigargine (inducteur de stress du RE par la déplétion du RE en calcium) stimule les voies SREBPs. Alors qu’aucune modification détectable des concentrations cytosoliques en calcium n’est observée dans les IHH suite aux traitements APs, l’utilisation d’agent chélateur de calcium réverse les effets de la clozapine sur les voies SREBP-1 et -2. Ainsi, nous supposons que la clozapine en perturbant sensiblement les flux de calcium, engendrerait un stress du RE qui activerait les voies SREBP-1 et -2 et la lipogenèse et cholestérogenèse associées. Pour compléter ces travaux, deux études expérimentales chez le rat et la souris soutiennent nos résultats in vitro. Chez le rat, l’étude en aigu, confirme que la clozapine, l’olanzapine et la risperidone provoquent à des temps précoces (1 h, 3 h) des dérégulations hépatiques transcriptionnelles de génes lipogéniques et cholestérogéniques et de la réponse UPR. Chez la souris, l’étude en chronique avec la risperidone montre des inductions significatives de la prise de poids en relation avec l’activation de la voie SREBP-1c et de FAS (fatty acid synthase). L’ensemble de ces données suggère qu’indépendamment de leurs effets spécifiques au niveau du SNC, les APs peuvent déréguler le métabolisme hépatique des lipides. En conclusion, les cultures primaires d’hépatocytes de rat et les cellules IHH sont des modèles d’intérêt pour la détection des effets adverses potentiels de molécules sur le métabolisme hépatique des lipides et du cholestérol. De plus, les voies SREBPs (protéines et gènes cibles) sont de véritables témoins des perturbations métaboliques cellulaires et peuvent être considérés comme des marqueurs pertinents de ces états métaboliques. Ces modèles pourraient ainsi être intégrés dans le processus de recherche et de sélection de nouveaux composés chimiques destinés à devenir des APs. Au niveau clinique, nos résultats soutiennent l’intérêt d’associer des traitements hypolipémiants ou hypocholestérolémiants (statines) aux patients traités avec la clozapine, l’olanzapine et la rispéridone
Schizophrenia is a psychiatric disorder that heavily impacts the mental functions and social relations of the patients concerned. More than 1 % of the world population suffers from this disease that is characterized by different kinds of symptoms which are commonly subclassified as either positive (hallucinations, illusions) or negative (loss of affect and motivation, social withdrawal). These symptoms can be controlled by treatment with antipsychotic drugs (APDs) which act primarily through the modulation of dopamine and serotonin receptors. Unfortunately, some of these drugs induce important metabolic side effects such as weight gain (as much as 10 kg the first year with clozapine for example), dyslipemia, alterations of glucose homeostasis and development of diabetes. The consequences of these disturbances are treatment disruption and an increase of cardiovascular risks which contributes to a death rate twice as high for schizophrenic patients versus the general population, associated with a reduction in the average life expectancy by 10 years. The mechanisms underlying the side effects by APDs are not completely understood. At the level of the central nervous system (CNS), actions on serotoninergic, dopaminergic or histaminergic receptors are believed to be implicated in metabolic side effects (particularly by modifying appetite or energy homeostasis). In the periphery, certain APDs perturb essential physiological functions such as insulin secretion by pancreatic b cells, glucose transport into skeletal muscle and lipogenesis at the adipose tissue level, as well as physiological parameters like the sensitivity of various tissues to insulin. Althoug the liver is an essential organ for maintaining the nutrients homeostasis, few studies show an interest for the direct impact of these molecules on this tissue. The main goal of this thesis is to characterise the impact of APDs on hepatic lipid and cholesterol metabolism using various markers from appropriate hepatocyte cellular models, such as de novo synthesis of lipids and cholesterol, the quantification of the mature transcription factors SREBP-1 and -2 (sterol regulatory element binding protein) as well as the evaluation of the expression of several genes of interest. In the first part, we selected hepatocyte cellular models (cells isolated from rat liver and the human IHH cell line) and showed their relevance for the study of the “potential adverse effects” of different compounds on lipid and cholesterol metabolism. For this, the physiological and sensitive character of these cultures was shown through their response to nutritional (or hormonal) changes and to pharmacological treatments. In the second part, we highlighted three profiles of APD molecules :-molecules strongly inducting de novo lipogenesis and cholesterogenesis (clozapine, olanzapine, risperidone and NDMC), -molecules with more moderate effects (haloperidol and paliperidone), -molecules with little or no effect(s) (aripiprazole, quetiapine, bifeprunox and chlorpromazine). Induction of de novo lipogenesis and cholesterogenesis by certain APDs is associated to the stimulation of the SREBP pathway (transcription factors and SREBP target genes) and correlate relatively well with the metabolic disturbances of schizophrenia patients under APD treatment. We therefore suggest that certain unfavourable effects of these APD molecules are due to a direct action on the liver. Furthermore we stated that those APDs that present the most unfavourable profiles in our in vitro models, activate the PERK pathway (protein kinase RNA-like ER kinase) of the UPR (unfolding protein response), illustrating the presence of endoplasmic reticulum (ER) stress. However, the ER stress is known to activate the SREBP pathways and to cause, in chronic, diseases such as steatosis, dyslipidemia and diabetes. This discovery opens new perspectives regarding the research for the action mechanisms of these molecules. More precisely, in our human hepatocyte model we show that the treatment with thapsigargine (inductive of ER stress by calcium depletion) stimulates the SREBP pathways. Whereas no detectable modification of the cytosolic calcium concentrations was observed following APD treatment, the use of calcium chelating agents reverses the effects of clozapine on the SREBP-1 and -2 pathways. We therefore presume that clozapine, by disturbing calcium homeostasis, generates ER stress which would activate the SREBPs pathways and lipogenesis and cholesterogenesis in consequence. To corroborate these findings, two experimental studies in rat and mouse were conducted that support our in vitro results. In the rat, a study employing acute drug administration confirms that clozapine, olanzapine and risperidone, at an early stage (1h, 3h), cause transcriptional deregulations of hepatic lipogenic, cholesterogenic and UPR genes. In the mouse, a study with chronic administration of risperidone indicates significant inductions of weight gain in relation to the activation of the SREBP-1c pathway and of FAS (fatty acid synthase). Altogether these data suggest that independent of their specific effects at the CNS level, APDs can modulate hepatic lipid metabolism. In conclusion, rat primary hepatocyte cultures and IHH cells are models of interest for the detection of potential unfavourable effects of molecules on hepatic lipid and cholesterol metabolism. Moreover, the SREBP pathways (proteins and target genes associated) are appropriate indicators of cellular metabolic disturbances and thus can be considered as pertinent markers of the respective processes. These models could therefore be integrated in the research process and in the selection of new chemical compounds destined to become APDs. With respect to the clinic, our results support the strategy to associate hypolipemic or hypocholesterolemic (statines) treatments to patients treated with clozapine, olanzapine and risperidone

Afin d’expliquer la différence d’engraissement intramusculaire observée entre canards de Barbarie et Pékin, nous avons comparé le métabolisme des lipides au niveau hépatique et musculaire de ces deux espèces. Chez des animaux nourris à volonté, nous avons démontré que la capacité de synthèse et de stockage hépatique de lipides était supérieure chez le canard de Barbarie ce qui pourrait expliquer, en partie, sa meilleure aptitude à la production de foie gras. Selon le niveau d’alimentation (canards nourris à volonté ou gavés), la sécrétion hépatique de lipides sous forme de VLDL est soit supérieure chez le canard de Barbarie par rapport au canard Pékin, soit équivalente pour les deux espèces. Néanmoins, le canard Pékin semblerait plus apte à limiter la stéatose hépatique en sécrétant des VLDL plus riches en triglycérides. Ce mécanisme associé à un captage musculaire plus intense des lipides circulants, une capacité de stockage intramusculaire des lipides supérieure et une lipogenèse musculaire plus active que ceux du canard de Barbarie, permettrait d’expliquer l’engraissement intramusculaire plus important du canard Pékin
In order to explain the observed difference in intramuscular fatness between Muscovy and Pekin ducks, we compared the lipid metabolism in liver and muscle of these two species. In ad ibitum- fed ducks, we demonstrated that Muscovy duck had a higher ability to synthesise and store lipids in liver than Pekin duck which could partly explain its highest ability to produce fatty liver. Depending on feeding level (ad libitum fed or overfed ducks), the hepatic secretion of lipids under VLDL form was higher in Muscovy duck than in Pekin duck or equivalent for the two species. However, Pekin duck exporting VLDL with higher triglyceride content than those of Muscovy duck could limit the development of hepatic steatosis. This mechanism associated to a highest muscle uptake of circulating lipids, a highest ability for the storage of intramuscular lipids and a more active muscle lipogenesis could explain the highest intramuscular fatness of Pekin duck

L'étude de l'absorption intestinale de l'acide érucique chez le rat est centrée sur la répartition des particules lipoprotéiques de la lymphe après ingestion soit d'huile riche en acide érucique administrée pure ou mélangée à un régime protéique soit d'acide érucique sous forme d'une émulsion. Dans chaque cas l'acide érucique montre une absorption plus lente que les autres acides gras testés, en particulier que l'acide oléique. L'absorption de l'acide érucique se fait presque exclusivement sous forme de VLDL (Very Low Density Lipoproteins). De plus, l'acide érucique tend à diminuer l'absorption de l'acide oléique. Un taux non négligeable de raccourcissement de l'acide érucique en acide oléique est aussi mis en évidence dans l'entérocyte.

Motivées par l'observation mondiale de l'augmentation de la morbidité et de la mortalité associées à des pathologies liées à l'obésité, dont la stéatose, les études pré-cliniques et cliniques s'intéressent à la recherche de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic de la stéatose. Actuellement, la stéatose est diagnostiquée et gradée par des analyses histologiques à partir d'une biopsie du foie. Dans l'intérêt du patient, et afin de permettre un suivi de la stéatose lors d'un régime ou d'un traitement, il est apparu important de se tourner vers des modalités de diagnostic moins invasives. Dans ce cadre, la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), non-invasive et non-ionisante, est une méthode de choix pour le diagnostic de la stéatose par la mesure de la fraction lipidique hépatique. De plus, à partir des informations observables sur un spectre de SRM acquis au niveau hépatique, il est possible d'envisager une quantification de la composition en acides gras (AG) des lipides hépatiques, potentiel biomarqueur pour le suivi d'une stéatose. Les travaux de cette thèse ont été réalisés à partir d'objets-tests, et dans le cadre d'études pré-cliniques (4,7 T) et cliniques (3,0 T). Une étude du protocole d'acquisition de spectres de SRM pour la quantification de la composition en AG des lipides a été réalisée, avec notamment un questionnement quant à la nécessité de l'utilisation d'un module de suppression du signal de l'eau. Un état de l'art des algorithmes de quantification de la composition en AG des lipides a été effectué, et des tests de validations de ces algorithmes ont été réalisés afin de déterminer le plus approprié à la problématique hépatique, dans nos conditions expérimentales. Enfin, toujours dans l'objectif de déterminer des nouveaux biomarqueurs de la stéatose, une méthode de mesure par SRM in vivo du T1 de l'eau et de la résonance majeure des lipides hépatiques (LOREEDE pour LOngitudinal RElaxation time Evaluation from Dynamic Equilibrium) a été développée, et validée au cours d'une étude préliminaire sur des objets-tests et in vivo sur modèles murins
In recent years, there has been an unprecedented increase in the morbidity and mortality associated with diseases such as the steatosis, linked to obesity. In this context, pre-clinical and clinical studies are of interest in the search for new biomarkers allowing the diagnosis of steatosis. Currently, steatosis is diagnosed and graded by histological analyzes from a liver biopsy. On the other hand, it is advantageous to use non-invasive diagnostic modalities, especially in longitudinal studies. In this context, magnetic resonance spectroscopy (MRS), as a non-invasive and non-ionizing approach, is an attractive alternative method for the diagnosis of steatosis by measuring the hepatic fat fraction. Moreover, from the MRS spectrum acquired in the liver, it is possible to quantify the fatty acids (FA) composition of the hepatic lipids, which could be a potential biomarker for the follow-up of steatosis. The work of this thesis has been performed in vitro and in vivo, in the context of pre-clinical (4.7 T) and clinical (3.0 T) studies. An investigation of the optimal MRS acquisition protocol for the quantification of FA was carried out, with particular attention to the role of the water signal suppression module. Different quantification algorithms of the lipid composition were studied and validation of these algorithms was carried out in vitro and in vivo. Finally, still with the objective of determining new biomarkers of steatosis, a method (LOREEDE: LOngitudinal RElaxation time Evaluation from Dynamic Equilibrium) for the measurement in vivo of the T1 of the water resonance and the major lipid resonance, by MRS, was developped and validated in a preliminary study

Certains types de glucides et de lipides sont capables de modifier la prise alimentaire et l'adiposité chez les rongeurs. À long terme, une alimentation riche en graisses et en fructose peut augmenter la prise alimentaire et provoquer une stéatose hépatique chez les mammifères. De tels régimes combinés avec du sirop de maïs à haute teneur en fructose (HFCS) dans l'eau pourraient entrainer un phénotype similaire chez les canards destinés à la production de foie gras. Les buts de ces deux études étaient donc dans un premier temps, d'évaluer les effets à court terme d'un régime alimentaire riche en graisse et en fructose chez le canard mulard et dans un second temps, d'évaluer l'impact à long terme de ce type régime combiné à de l'eau de boisson sucrée. Pour les deux études, 48 canards mulards mâles ont été bloqués en fonction de leur poids et répartis au hasard dans différents groupes suivant un dispositif en blocs complets. Pour la première étude, ils ont été répartis dans deux groupes : Témoin (C); régime riche en gras et en fructose (FF). 12 canards supplémentaires du même lot ont été euthanasiés le jour 0 pour les mesures de base. Après 14 jours, le sang ainsi que le foie d'une partie des animaux ont été aléatoirement collectés (n=12/groupe). Pour la seconde étude qui a duré 92 jours, les canards ont été répartis dans quatre traitements (n=12 par groupe) : régime témoin (C) ; régime de contrôle et eau sucrée (CSW); régime riche en graisses, riche en fructose (FF) ou régime riche en matières grasses, riche en fructose et eau sucrée (FFSW). Le HFCS-55 a été mélangé avec de l'eau du robinet (13% v/p) et fourni ad libitum aux groupes CSW et FFSW. À court terme, nous avons pu constater une consommation énergétique plus faible pour les canards témoin ce qui suggère une altération potentielle des signaux de satiété. Cependant, à long terme, l'alimentation ainsi que l'eau de boisson sucrée a altéré négativement la consommation. Contrairement à nos attentes, ces types de régimes ont donc eu impact limité sur les canards mulards
Different types of dietary carbohydrate and lipids are known to alter feed intake and adiposity in rodents. Long-term feeding of high-fat, high-fructose diets has been shown to alter feed intake and cause fatty liver in mammals. Such diets in combination with the addition of high fructose corn syrup (HFCS) in the drinking water may result in a similar phenotype in ducks destined for the production of foie gras. The aims of these studies were therefore firstly to assess the short-term effects of a diet rich in fat and fructose in mulard ducks and secondly to assess the long-term impact of this type of diet combined with sugar water. Despite its higher energy content, feed intake was not reduced by the FF diet, suggesting a potential alteration of satiety signals, which may impact body liver and weight under longer-term interventions in ducks destined to produce foie gras. However, HFCS in the drinking water reduced voluntary feed intake, whereas overall, FF and C had similar feed intake. In contrast to rodent and human studies, FF diets failed to induce hyperphagia and liver steatosis. In the absence of overfeeding, the long-term feeding of high-fructose, highfat diets, does not promote fatty liver.

Plusieurs études génétiques d’association de gènes ont mis en évidence le locus CDKN2A, codant notamment la protéine p16INK4a (p16), un gène suppresseur de tumeur, comme étant associé au risque de développement du diabète de type 2 (T2D) et des maladies cardiovasculaires. Le T2D, caractérisé par une hyperglycémie et/ou une insulinorésistance, s’accompagne fréquemment d’une stéatose hépatique prédisposant au développement de la NASH (Non Alcoholic Steatohepatitis), et contribuant à un risque accru de complications cardiovasculaires. Nous avons montré que la déficience de p16 augmente la néoglucogenèse hépatique lors d'un jeûne suggérant un rôle de p16 dans le T2D. Cependant, le rôle de p16 dans l’homéostasie hépatique des lipides n’est à ce jour pas connu. Afin de déterminer le rôle de p16 dans le métabolisme hépatique des lipides, nous avons utilisé des hépatocytes primaires isolés de souris p16+/+ et p16-/- ainsi que les lignées d’hépatocytes murins AML12 et humains IHH transfectées respectivement avec un siRNA-CDKN2A ou siRNA-p16.Nous avons montré par l’étude transcriptomique des hépatocytes primaires de souris par puces à ADN, que l’absence de p16 module les voies métaboliques associées à PPARα et contrôle préférentiellement l’expression de certains gènes cibles de PPARα, associés au catabolisme des acides gras. _x000D_Dans les lignées cellulaires hépatocytaires, certains de ces gènes sont également modulés après diminution de l’expression de p16 par siRNA. Ces effets sont associés à une meilleure réponse à l’agoniste de PPARα, le GW647, et abolis par un siRNA ciblant PPARα. Afin d’étudier par quel(s) mécanisme(s) l’absence de p16 module l’expression des gènes cibles de PPARα, le rôle de certains de ses coactivateurs transcriptionnels a été étudié par l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques ou de siRNA. De manière intéressante, nous avons pu montrer que l’absence de p16 active la voie AMPK-SIRT1 afin d’augmenter l’expression des gènes cibles de la β-oxydation et de la cétogenèse. De plus, ces effets sont indépendants du rôle de p16 dans le cycle cellulaire. In vitro, les hépatocytes primaires p16-/-, incubés avec de l’oléate radiomarqué, présentent une β-oxydation augmentée comparés aux hépatocytes primaires p16+/+. Au cours du jeûne, l’acétyl-CoA provenant de la β-oxydation est redirigé vers la production de corps cétoniques. De manière intéressante, les souris p16-/- injectées avec du sodium octanoate, un acide gras à chaîne courte préférentiellement utilisé via la cétogenèse, ont une tendance à avoir une production plus importante de corps cétoniques.Nous avons ainsi pu mettre en évidence que la déficience de p16 dans les hépatocytes favorise l’utilisation des acides gras, via l’activation de la voie SIRT1-AMPK-PPAR&#945
P16INK4a is a tumor suppressor protein that is a well described cell cycle regulator. Recently, genome-wide association studies (GWAS) associated the CDKN2A locus, from which p16INK4A is encoded, with increased risk for development of type 2 diabetes. A pathophysiological link between p16INK4a and hepatic glucose homeostasis has been unraveled recently, through the control of gluconeogenesis. Patients with T2D also present with disturbances in fat metabolism, associated with an increased prevalence to Non Alcoholic Fatty liver diseases (NAFLD). In this context, we investigated the role of p16INK4a in hepatic lipid metabolism in vitro using primary hepatocytes, the murin AML12 and human IHH hepatocyte cell line transfected respectively with siRNA-CDKN2A and siRNA-p16 and in vivo using p16+/+ and p16-/- mice.Transcriptomic analyses of p16+/+ and p16-/- primary hepatocytes using microarrays revealed that metabolic and PPARα signaling pathways were among the most modulated in p16 absence. Moreover, in primary hepatocytes and in hepatocyte cell lines, p16 deficiency modulates a subset of PPARα target genes associated to fatty acids oxidation (FAO). These effects were associated with an increased response to GW647, a PPAR945; agonist, and reversed by siRNA targeting PPAR45;. Investigating known PPAR945; activators and transcriptional co-activators in vitro, we found that upregulation of FAO genes expression was linked to SIRT1. AMPK is a known activator of FAO and has been shown to induce SIRT1 activation through increase of NAD/NADH ratio. Interestingly, downregulation of p16 expression in vitro led to increased AMPK phosphorylation and activation.In vitro, p16-/- primary hepatocytes demonstrated enhanced fatty acid oxidation of oleate compared to p16+/+. During fasting, enhanced FAO leads to a shift of acetyl-coA utilization from the TCA cycle to ketogenesis. Interestingly, p16-/- mice showed a tendency to produce more ketone bodies than their control littermate after sodium octanoate injection. These findings describe a new function for p16INK4a in hepatic lipid metabolism through activation of AMPK-SIRT1-PPARα pathway

La stéatose est une lésion hépatique rapportée avec de nombreux médicaments. Des études antérieures ont montré qu'une altération sévère de la β-oxydation mitochondriale des acides gras (mtFAO) conduit constamment à une accumulation de lipides dans le foie. Cependant, on en sait beaucoup moins sur le(s) mécanisme(s) de la stéatose induite par les médicaments en l'absence de dysfonction mitochondriale sévère, bien que des études antérieures aient suggéré l'implication d'une inhibition légère à modérée de la mtFAO, une augmentation de la lipogenèse de novo (LDN) et une altération de la sécrétion des very low-density lipoprotein (VLDL). L'objectif de notre étude, principalement réalisée dans la lignée cellulaire humaine HepaRG, était d'étudier ces 3 mécanismes avec 12 médicaments capables d'induire une stéatose chez l’homme : l'amiodarone (AMIO, utilisé comme contrôle positif), l'allopurinol (ALLO), la D-pénicillamine (DPEN), le 5-fluorouracile (5FU), l’indinavir (INDI), l’indométhacine (INDO), le méthimazole (METHI), le méthotrexate (METHO), la nifédipine (NIF), la rifampicine (RIF), le sulindac (SUL) et la troglitazone (TRO). Les cellules hépatiques ont été exposées à des médicaments pendant 4 jours avec des concentrations induisant une perte d'ATP cellulaire toujours inférieure à 30% par rapport aux témoins et ne dépassant pas 100xCmax. Parmi les 12 médicaments, AMIO, ALLO, 5FU, INDI, INDO, METHO, RIF, SUL et TRO ont induit une stéatose dans les cellules HepaRG. AMIO, INDO et RIF ont diminué le mtFAO. AMIO, INDO et SUL ont induit la LDN. ALLO, 5FU, INDI, INDO, SUL, RIF et TRO ont altéré la sécrétion des VLDL. Ces 7 derniers médicaments ont réduit les niveaux d'ARNm des gènes jouant un rôle majeur dans l'assemblage des VLDL et induit également un stress du réticulum endoplasmique (RE). Ainsi, en l'absence de dysfonction mitochondriale sévère, la stéatose induite par les médicaments peut être déclenchée par différents mécanismes, bien que l'altération de la sécrétion de VLDL semble plus fréquemment impliquée, peut-être en raison d’un stress du RE
Steatosis is a liver lesion reported with numerous pharmaceuticals. Prior studies showed that severe impairment of mitochondrial fatty acid oxidation (mtFAO) constantly leads to lipid accretion in liver. However, much less is known about the mechanism(s) of drug-induced steatosis in the absence of severe mitochondrial dysfunction, although previous studies suggested the involvement of mild-to-moderate inhibition of mtFAO, increased de novo lipogenesis (DNL) and impairment of very low-density lipoprotein (VLDL) secretion. The objective of our study, mainly carried out in human hepatoma HepaRG cells, was to investigate these 3 mechanisms with 12 drugs able to induce steatosis in human: amiodarone (AMIO, used as positive control), allopurinol (ALLO), D-penicillamine (DPEN), 5-fluorouracil (5FU), indinavir (INDI), indomethacin (INDO), methimazole (METHI), methotrexate (METHO), nifedipine (NIF), rifampicin (RIF), sulindac (SUL) and troglitazone (TRO). Hepatic cells were exposed to drugs for 4 days with concentrations inducing loss of cellular ATP always below 30% of the controls and not exceeding 100xCmax. Among the 12 drugs, AMIO, ALLO, 5FU, INDI, INDO, METHO, RIF, SUL and TRO induced steatosis in HepaRG cells. AMIO, INDO and RIF decreased mtFAO. AMIO, INDO and SUL enhanced DNL. ALLO, 5FU, INDI, INDO, SUL, RIF and TRO impaired VLDL secretion. These 7 drugs reduced the mRNA levels of genes playing a major role in VLDL assembly and also induced endoplasmic reticulum (ER) stress. Thus, in the absence of severe mitochondrial dysfunction, drug-induced steatosis can be triggered by different mechanisms, although impairment of VLDL secretion seems more frequently involved, possibly as a consequence of ER stress

La glycogénose de type I (GSDI) est une maladie génétique rare, due à une déficience en glucose-6 phosphatase (G6Pase), enzyme clé de la production endogène de glucose. En plus des hypoglycémies sévères, la perte de l'activité G6Pase conduit à l'accumulation de glycogène, mais aussi de lipides dans le foie et les reins. A long-terme, la plupart des patients développent des tumeurs hépatiques et une maladie rénale chronique (MRC).Le but de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la MRC grâce à des modèles murins viables et uniques, avec une délétion de la G6Pase spécifiquement dans le foie ou les reins, reproduisant respectivement toutes les caractéristiques de la pathologie hépatique ou rénale.Au niveau du foie, notre étude a permis de mettre en évidence une reprogrammation métabolique « Warburg-like » très similaire à celle des cellules cancéreuses, associée à une perte des défenses cellulaires et des suppresseurs de tumeur. De plus, nous avons montré que les adénomes hépatocellulaires, se transformant ensuite en carcinomes, se développent en absence de fibrose, en accord avec l'absence d'activation des voies pro-fibrotiques. Au niveau des reins, l'étude de la MRC a mis en évidence le développement de kystes rénaux chez les souris atteintes de GSDI, observés aussi chez les patients à un stade avancé de la MRC. Finalement, une dernière étude portant sur l'activation de l'oxydation des lipides, par un traitement des souris au fénofibrate, a permis de suggérer le rôle délétère de l'accumulation des lipides dans le développement des pathologies hépatique et rénale
Glycogen storage disease type I (GSDI) is a rare genetic disease, due to a deficiency in glucose-6 phosphatase (G6Pase), a key enzyme in the endogenous glucose production. Besides severe hypoglycemia, the loss of G6Pase leads to the accumulation of glycogen and lipids in the liver and kidneys. On the long term, most patients develop hepatic tumors and chronic kidney disease (CKD).The goal of this thesis was to characterize the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis and CKD, thanks to viable and unique mouse models with specific deletion of G6Pase in the liver or kidneys, which exhibit all hallmarks of hepatic and renal pathologies, respectively.On a hepatic level, our study allowed us to highlight a « Warburg-like » metabolic reprogramming, very similar to what is observed in cancer cells, associated with a loss of cellular defenses and tumor suppressors. Furthermore, we showed that formation of hepatocellular adenoma, which transform later in carcinoma, occurs in the absence of liver fibrosis, due to the fact that pro-fibrotic pathways are not activated. In the kidneys, the study of CKD highlighted the development of renal cysts in mice with GSDI, as well as in the patients presenting an advanced stage of CKD. Finally, the last study on the activation of the oxidation of lipids, by treating the mice with fenofibrate, allowed us to suggest a deleterious role of lipid accumulation in the development of the hepatic and renal pathologies

Le but de notre travail a ete d'evaluer et de comparer chez le veau preruminant, les effets de deux sources d'acides gras, l'une riche en acides gras (ag) satures et monoinsatures a 18 atomes de carbone (suif), l'autre riche en ag essentiels de la famille n-6 (acide linoleique) (huile de soja) en combinaison ou non avec l'apport de cholesterol (1% de la ms). Cette etude a permis de mettre en evidence les points suivants: l'huile de soja, riche en acide linoleique provoque a la difference de l'homme et des rongeurs, une hypercholesterolemie due a la forte accumulation de hdl de type 1 riches en esters de cholesterol. Ce regime riche en agpi, entraine simultanement une hypotriglyceridemie en raison de la chute de la teneur plasmatique en chylomicrons. L'addition de cholesterol renforce l'effet hypercholesterolemiant en favorisant l'accumulation des idl et ldl plasmatiques probablement par un effet negatif sur le recepteur tissulaire ldl. Le cholesterol associe au regime huile de soja stimule la secretion de vldl par le foie par un mecanisme independant de l'expression du gene de l'apo b. Les regimes a base d'huile de soja, riches en acide linoleique, stimulent l'accumulation de triglycerides dans le tissu hepatique, intestinal ou musculaire. Ils entrainent l'incorporation massive de l'acide linoleique dans les lipides tissulaires, notamment dans les triglycerides du muscle au detriment de l'acide palmitique, ameliorant ainsi la qualite dietetique de la viande de veau

La stéatose hépatique affecte 20 à 40% de la population et progresse de façon constante. Il s’agit d’une pathologie chronique fortement associée au syndrome métabolique. Sa pathogenèse est mal comprise. Une altération du métabolisme des lipides dans le foie entraînant une accumulation intra-hépatique de lipides est probablement la cause majeure de la stéatose hépatique. A ce jour, il n’existe pas de traitement spécifique de la stéatose hépatique. La protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) est un régulateur clé du métabolisme énergétique. Notamment, l’AMPK contrôle le métabolisme des lipides en inhibant la synthèse des acides gras et du cholestérol, et en stimulant l'oxydation des acides gras. Plusieurs études ont montré l’existence d’une association entre l’accumulation intracellulaire de lipides et une perte d’activité de l’AMPK dans le foie. Ces observations suggèrent que l’AMPK pourrait être un facteur impliqué dans la physiopathologie de la stéatose hépatique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons généré un nouveau modèle de souris knockout dépourvu des sous-unités catalytiques α1 et α2 de l’AMPK spécifiquement dans le foie. Nous avons analysé les conséquences de cette délétion sur le métabolisme lipidique dans différentes situations nutritionnelles. La délétion de l’AMPK dans le foie ne modifie pas le contenu hépatique en triglycérides et en cholestérol au cours d’un jeûne ou après une réalimentation riche en glucides. Egalement, l’expression des gènes de la lipogenèse n’est pas modifiée dans le foie de ces animaux. De plus, l’oxydation des acides gras n’est pas altérée même après un jeûne de 24h. Etonnamment, l’absence de l’AMPK dans le foie n’amplifie pas la stéatose hépatique, ni l’hyperglycémie ou l’intolérance au glucose lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en lipides. Cependant, l’activation de l’AMPK in vivo avec l'activateur direct, A-769662, normalise la stéatose hépatique chez des souris lipodystrophiques aP2-SREBP-1c et chez des souris obèses nourries avec un régime riche en lipides. Cet effet est dépendant de l’AMPK car il est totalement perdu chez des souris dépourvues d’AMPK dans le foie. Dans des hépatocytes de souris en culture primaire, l’activation de l'AMPK par un activateur direct (A-769662) ou par des activateurs indirects (metformine et AICAR) réduit le flux lipogénique et augmente l’oxydation des acides gras. Ces effets sont totalement abolis dans des hépatocytes AMPK KO, démontrant l’action spécifique de l'AMPK sur le métabolisme lipidique en réponse à ces composés. Ces résultats obtenus chez la souris sont extrapolables à l'homme puisque nous avons montré que l'activation de l'AMPK dans des hépatocytes humains en culture primaire inhibe de manière efficace la synthèse des acides gras et du cholestérol. En conclusion, nos résultats démontrent que l’inactivation de l’AMPK dans le foie n’est pas un facteur déclenchant ou aggravant dans la physiopathologie de la stéatose hépatique. En revanche, l’activation pharmacologique de l’AMPK améliore efficacement la stéatose hépatique. Ainsi, l’AMPK est une cible potentielle pour le développement d'activateurs dans le but de traiter la stéatose hépatique chez l’homme
Fatty liver disease affects between 20-40% of the population. This pathology is usually associated with metabolic disease. Its pathogenesis is poorly understood. Altered lipids metabolism in the liver resulting on hepatic fat accumulation is probably due to fatty liver. There is no specific treatment for fatty liver disease. AMP-activated protein kinase (AMPK) is a key regulator of energy metabolism. In particular, AMPK regulates lipid metabolism by inhibiting fatty acids and cholesterol synthesis, and stimulating fatty acids oxidation. Several studies have shown an association between intracellular lipid accumulation and loss of AMPK activity in the liver. These observations suggest that AMPK may be a factor involved in the pathogenesis of hepatic steatosis. To investigate this hypothesis, we generated a new model of knockout mice lacking the catalytic subunits of AMPK α1 and α2 specifically in the liver. We analyzed the consequences of this deletion on lipid metabolism in different nutritional conditions. Deletion of AMPK in the liver does not affect hepatic triglyceride and cholesterol content in fasted or in refed conditions with a high carbohydrate diet. Also, lipogenic genes expression is not altered in the liver of these animals. Moreover, the oxidation of fatty acids is not impaired after 24 hour of fasting. Surprisingly, lacking AMPK specifically in the liver does not aggraving fatty liver, hyperglycemia, or impaired glucose tolerance when the mice are on high fat diet condition. However, the activation of AMPK in vivo with a direct activator, A-769662, normalizes hepatic steatosis in lipodystrophyc aP2-SREBP-1c mice and in obese mice placed on high-fat diet. This effect is AMPK dependent because it is completely abolished in mice lacking AMPK specifically in liver. In primary mice hepatocytes, AMPK activation by a direct activator (A-769662) or by indirect activators (metformin and AICAR) reduces lipogenesis rates and increases fatty acids oxidation rates. These effects were completely abolished in hepatocytes lacking AMPK, showing the specific action of AMPK on lipid metabolism in response to these compounds. These results obtained in mice can be extrapolated to humans. Indeed, we have shown that AMPK activation in primary humain hepatocytes inhibits effectively fatty acid and cholesterol synthesis rates. In conclusion, our results showed that inactivation of AMPK in the liver is not a triggering or an aggraving factor in the pathogenesis of hepatic steatosis. Nevertheless, AMPK re-activation has a therapeutic benefit for the treatment of fatty liver disease. Thus, AMPK is a potential target to treat fatty liver disease in human

L'adiponectine (ApN) est une adipokine de 30 KDa produite abondamment par le tissu adipeux qui a été décrite pour la première fois en 1995. Dès lors qu'une corrélation inverse entre les taux circulants d'ApN et l'adiposité a été mise en évidence, de très nombreuses études ont été initiées pour chercher à établir un lien avec les pathologies liées au syndrome métabolique. Ainsi, chez les patients obèses et diabétiques, une perte de poids induite par un traitement médicamenteux ou un régime hypocalorique s'accompagne d'une augmentation des taux circulants d'ApN et d'une amélioration des paramètres biochimiques. Il ressort de ces études que des taux élevés d'ApN sont corrélés à une amélioration de la sensibilité à l'insuline, des paramètres lipidiques et une diminution du risque cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes d'action conduisant à l'amélioration du métabolisme lipidique et glucidique restent encore mal connus. Au cours de cette étude, nous avons, dans un premier temps, cherché à déterminer les conséquences d'une variation de la masse grasse sur la production de l'ApN chez la souris. Pour cela, différentes stratégies nutritionnelles et pharmacologiques, conduisant à une fonte ou à une augmentation de la masse grasse, ont utilisées. Les résultats obtenus suggèrent que la production d'ApN n'est pas dépendante de la taille des adipocytes mais plutôt de leur état inflammatoire. Dans un second temps, grâce à un modèle d'explants de foie en culture, nous avons cherché à déterminer les effets directs de l'ApN sur le métabolisme lipidique du foie. Une première approche a consisté à tester les effets à long terme c'est à dire susceptibles de correspondre à des modifications d'expression génique et de synthèse protéique en incubant les explants pendant 21h dans un milieu de culture contenant de l'ApN en présence ou non d'insuline. Les résultats suggèrent que l'ApN accentue les effets de l'insuline, ce qui se traduit par une meilleure utilisation du glucose avec en contre partie une stimulation de la lipogenèse et une réduction de la ß-oxydation en présence d'insuline. De plus, l'ApN apparaît exercer un effet sur les voies de catabolisme des HDL. Par une seconde approche, nous avons testé les effets à court terme de l'ApN sur les capacités β-oxydatives en traitant les explants pendant 45 min. Dans ces conditions plus appropriées pour mettre en évidence l'activation des voies de régulation rapides, la présence d'ApN entraine une stimulation de la ß-oxydation qui s'accompagne d'une augmentation de la p- AMPK. En conclusion, ces résultats suggèrent que l'ApN exerce des effets directs sur le métabolisme hépatique du glucose compatible avec l'effet insulino-sensibilisateur observé in vivo. En revanche, les résultats ne permettent pas, à ce stade, d'établir une relation entre une induction par l'ApN de l'activité ß-oxydative des acides gras dans le foie et ces effets bénéfiques sur les paramètres lipidiques.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
L’obésité et le diabète de type 2 (T2D) sont étroitement associés à la résistance à l’insuline, une maladie métabolique qui se développe suite à un défaut causé par une réduction de la signalisation de l’insuline et de sa clairance. Afin de comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline plusieurs molécules qui régulent les voies de signalisation ainsi que la clairance sous contrôle du récepteur à l’insuline ont été étudiées, incluant la protéine tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 et la molécule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1) qui est régulée en aval sous le contrôle de SHP1. Les nombreuses isoformes de CC1 contribuent à différentes fonctions cellulaires. Dans le foie, l’isoforme CC1-L, qui est phosphorylée sur tyrosine (Tyr), joue un rôle métabolique essentiel dans la régulation de la clairance de l’insuline et dans la suppression de l’activité de la synthase des acides gras (FAS). Nous avons démontré que des souris invalidées pour CC1 (Cc1-/-) sous un régime standard faible en gras (SD) développent néanmoins une importante stéatose hépatique qui est démontré par une augmentation de triglycérides, de cholestérol total ainsi que de cholestérol estérifié dans le foie. Sous un régime contenant 55% de gras (HFD) ces mêmes souris démontrent une prédisposition au développement de la stéatose et dysfonction hépatique induite par le régime, indiqués par une accumulation de lipides hépatiques et une augmentation d’enzymes marqueurs de dommage hépatique dans la circulation. La stéatose hépatique dans la souris Cc1-/- est liée à une augmentation significative d’importantes enzymes lipogéniques et de la synthèse du cholestérol qui sont régulés suite à une augmentation de l’activité nucléaire des facteurs de transcription Srebp1c et Srebp2. Comparées aux souris contrôle sauvages (WT) les souris CC1-/- ont démontré une réduction de la clairance de l’insuline, une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline hépatique et une augmentation d’expression des activateurs transcriptionels hépatiques PGC-1 et FoxO1. L’absence de CC1 a aussi exacerbé l’intolérance au glucose et la résistance à l’insuline hépatique induite par le régime à haute teneur de gras mais la clairance de l’insuline n’était pas diminuée dans les souris Cc1 -/-. Nos donnés indiquent que CC1 est un important régulateur de la lipogénèse hépatique et que les souris CC1-/- sont prédisposées à développer une stéatose hépatique qui mène à une résistance à l’insuline hépatique et des dommages dans le foie qui sont surtout évidentes sous un régime riche en lipides. Une importante Tyr phosphatase de CC1 est SHP1. Précédemment nous avons démontré que SHP1 est un important régulateur de l’homéostasie du glucose et de la clairance de l’insuline par le foie, cependant son rôle dans l’obésité liée au diabète reste méconnu. Nous rapportons ici que l’expression de SHP1 est significativement augmentée dans les tissus métaboliques de souris obèses sous régime HFD. Nous avons généré des souris invalidées pour SHP1 spécifiquement dans les hépatocytes (Ptpn6H-KO) pour investiguer le rôle de SHP1 dans le développement de la résistance à l’insuline et de la stéatose hépatique. Sous régime HFD les souris Ptpn6H-KO deviennent aussi obèses que les souris non invalidées pour SHP1 (Ptpn6f/f). Malgré ceci les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration de la glycémie à jeun et une protection contre la résistance à l’insuline induite par l’obésité qui est confirmée par la suppression de la synthèse de glucose hépatique ainsi qu’une amélioration de l’activation du récepteur pour l’insuline avec une augmentation concomitante des voies de signalisation Akt. Il est aussi possible que la clairance de l’insuline accrue qu’on observe dans les souris Ptpn6H-KO soit due à une augmentation de la phosphorylation sur tyrosine de CC1. Les souris obèses Ptpn6H-KO montrent une augmentation de stéatose hépatique qui est le résultat de 1) une augmentation de lipogénèse hépatique associée à une augmentation importante de l’activité et de l’expression de SREBP-1 et des enzymes lipogéniques en aval FAS et ACC, 2) une augmentation de la captation postprandiale des acides gras qui est possiblement liée à une augmentation de l’expression du gène et de l’activité nucléaire de PPARγ, 3) une diminution de la sécrétion des triglycérides et de l’apolipoprotéine B sous le forme de lipoprotéines de très basse densité (VLDL). Étonnamment, malgré le niveau élevé de stéatose hépatique, le profil inflammatoire dans le foie des souris Ptpn6H-KO était similaire ou même amélioré comparé aux souris contrôles Ptpn6f/f et ceci était accompagné d’une diminution de dommage hépatocellulaire. Ces résultats démontrent que SHP1 est un nouveau médiateur de la résistance à l’insuline dans les hépatocytes et contribue à la détérioration du métabolisme du glucose induite par l’obésité. Chez la souris Ptpn6H-KO la stéatose hépatique induite par le régime suggère par ailleurs un autre rôle de SHP1 dans la régulation du métabolisme hépatique des lipides. Malgré le fait que CC1 et SHP1 se retrouvent dans le même complexe que Cdk2 et le récepteur de l’insuline, ils jouent des rôles opposés, CC1 étant un régulateur positif et SHP1 un régulateur négatif de la clairance de l’insuline. Ceci est en accord avec la régulation hépatique par le glucose des voies de signalisation de l’insuline pour ces deux molécules car les souris Cc1-/- démontrent une détérioration du métabolisme du glucose et de la signalisation de l’insuline alors que les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration. Notre observation de stéatose hépatique chez ces deux modèles animaux suggère que CC1 et SHP1 limitent la synthèse et l’entreposage des lipides hépatiques de façon dépendante ou indépendante de la signalisation de l’insuline. Les résultats de ces études utilisant des modèles invalidés pour CC1 ou SHP1 révèlent des mécanismes du contrôle de la synthèse de glucose hépatique et du métabolisme des lipides qui sont très complexes et distincts. En plus ces résultats nous apportent une compréhension importante de la régulation hépatique de l’action et de la clairance de l’insuline.
Obesity and type 2 diabetes mellitus (T2D) are tightly associated with a common link, insulin resistance, a metabolic disorder developed from defective insulin action involving impaired insulin signaling and clearance. To investigate the pathogenesis of insulin resistance, many molecules modulating its signaling pathways as well as insulin receptor-mediated insulin clearance have been studied, including the protein tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 and its regulated downstream molecule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1). CC1 in multiple isoforms contributes differentially to various cellular functions, the tyrosine (Tyr)-phosphorylated isoform of CC1 (CC1-L) is known to play an essential metabolic role in the hepatic regulation of insulin clearance and insulin-mediated acute inhibition of fatty acid synthase (FAS) activity. We have found that CC1-deficient (Cc1-/-) mice on standard diet (SD) already develop spontaneous hepatic steatosis with significantly elevated accretion of triglyceride (TG), total and esterified cholesterol. When challenged with a 55% kcal high-fat diet (HFD), these mice show greater susceptibility to the development of diet-induced hepatic steatosis and dysfunction, indicated by higher hepatic lipid content and serum levels of hepatic enzymes as markers of liver damage. Hepatic steatosis in the Cc1-/- mice is linked to a significant increase of key lipogenic (FAS, ACC) and cholesterol synthetic (HMGCR) enzymes, which is a result of increased nuclear activity of their positive gene transcription factors Srebp1c and Srebp2. Compared to their wild-type (WT) littermate controls, Cc1-/- mice exhibited impaired insulin clearance, glucose intolerance, liver insulin resistance, and elevated hepatic key gluconeogenic transcriptional activators Pgc1 and FoxO1. Lack of CC1 also exacerbated the HFD-induced glucose intolerance and hepatic insulin resistance, while insulin clearance was not further deteriorated. These data demonstrate that CC1 is a key regulator of hepatic lipogenesis and that Cc1-/- mice are predisposed to liver steatosis, leading to hepatic insulin resistance and liver damage, particularly when chronically exposed to dietary fat. An important Tyr phosphatase of CC1, SHP1, has been found previously by our lab to regulate glucose homeostasis and liver insulin clearance, but its potential implication in obesity-linked insulin resistance and hepatic steatosis has not yet been examined. We hereby report that SHP1 expression is significantly upregulated in metabolic tissues of HFD-fed obese mice. We have also further investigated the role of hepatocyte SHP1 in promoting insulin resistance and hepatic steatosis by generating hepatocyte-specific SHP1 knockout mice (Ptpn6H-KO). Upon HFD feeding, Ptpn6H-KO mice develop obesity as their Ptpn6f/f littermates. With consistently improved fasting glycemia, these mice are protected from obesity-induced liver insulin resistance as revealed by normalized insulin suppression of hepatic glucose production and hepatic insulin signaling with improved activation of insulin receptor and downstream signaling through Akt. More rapid insulin clearance in Ptpn6H-KO mice due to heightened CC1 tyrosine phosphorylation is also a possible contribution to the improved insulin action. Unexpectedly, obese Ptpn6H-KO mice exhibit enhanced hepatic steatosis. In detailed mechanisms, this is a result of 1) augmented hepatic lipogenesis, marked by upregulated activity and expression of SREBP-1 as well as the downstream regulated lipogenic enzymes such as FAS and ACC, 2) increased postprandial fatty acid uptake, possibly linked to the upregulation of PPAR gene expression and nuclear activity, and 3) decreased postprandial TG output in apolipoprotein B (ApoB)-associated lipoprotein particles, i.e. very low density lipoprotein (VLDL). More interestingly, the steatotic livers of these Ptpn6H-KO mice display comparable or even reduced level of inflammation accompanied by significantly less hepatocellular damage than that in their Ptpn6f/f counterparts. These results present hepatocyte SHP1 as a novel mediator of insulin resistance compromising hepatic glucose metabolism in diet-induced obesity. The enhanced diet-induced hepatic steatosis in Ptpn6H-KO mice provides a new role for SHP1 in liver lipid metabolism and further supports the bifurcation of insulin signaling in the regulation of hepatic glucose and lipid homeostasis or also confirms a possible disconnection between hepatic regulation of glucose and lipid metabolism. Although both CC1 and SHP1 are found in the same complex with Cdk2 and insulin receptor to regulate insulin clearance, they play opposing roles as CC1 is the positive regulator and SHP1 being the negative one. This is in accordance with the hepatic glucoregulation of insulin signaling for both molecules, since Cc1-/- mice show impaired glucose metabolism and insulin signaling whereas Ptpn6H-KO mice exhibit improvement. Interestingly, our observation of hepatic steatosis in both animal models, though with different characteristics, suggests that both CC1 and SHP1 limit hepatic lipid synthesis and storage, dependent or independent of insulin signaling. Findings from these studies using animal models lacking CC1 and SHP1 reveal complex and differential regulatory mechanisms of hepatic glucose and lipid metabolism, and they also provide important understanding of the hepatic regulation of insulin action and clearance.

La stéatose hépatocytaire, définie par l’accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l’hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l’hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d’une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L’objectif de ce travail a été d’identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l’hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d’hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l’accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d’une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d’autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l’expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l’expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l’interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l’induction d’une stéatose par le VHC de génotype 3. L’absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d’autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d’une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a
Hepatocellular steatosis is common in patients with chronic hepatitis C. Steatosis can be considered as a true cytopathic lesion induced by hepatitis C virus genotype 3, suggesting that one or more viral proteins produced during genotype 3 infection are involved in the steatogenic process, while the same proteins produced during infection by other genotypes are not. Our objective was to identify the viral determinants of HCV-induced steatosis and to understand the underlying mechanisms. Extensive analysis performed on HCV sequences selected on their genotype and their association with in vivo steatosis are revealed putative viral determinants of viral-induced steatosis in E1-E2 and NS3 proteins coding regions. However, we can not rule out the potential role of these positions in HCV-induced steatosis and experimental study should be drawn to explore this issue. In addition, the FATG164-167 motif, which has been implicated in HCV core protein induced steatosis, was constantly present on genotype 3a sequences independently of the original presence or absence of liver steatosis. We examined in vitro interactions between lipid droplets and full-length core protein isolated from patients with HCV genotype 3a infection, with and without steatosis, and from steatosis-free patients infected by hepatitis C HCV 1b. We also examined morphological changes in the lipid droplets according to the HCV genotype and the presence of steatosis in vivo. We showed that the core protein of both HCV genotypes 1b and 3a binds tightly to the surface of intracellular lipid droplets. However, cells transfected with genotype 3a contain more neutral lipids in lipid droplets, and more large lipid droplets, than cells transfected with genotype 1b sequences. This suggests that hepatitis C virus core protein-lipid droplet interaction could play a role in virus-induced steatosis. Importantly, we found no genetic or functional differences between genotype 3a core proteins from patients with and without hepatitis C virus-induced steatosis. This suggests that other viral proteins and/or host factors are involved in the development of hepatocellular steatosis in patients infected by hepatitis C virus genotype 3a

La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est une pathologie émergente dans nos pays industrialisés du fait de l'obésité et de l'insulino-résistance. A ce jour, la pathogenèse de la NASH est mal connue et il n'existe pas de traitement prévenant son évolution cirrhogène chez certains patients. Le but de ce travail consistait à étudier les modifications bioénergétiques et métaboliques de mitochondries hépatiques et d'hépatocytes isolés de rats atteints de NASH.
Dans un premier temps, nous avons élaboré un régime alimentaire enrichi en acides gras saturés afin d'induire une NASH. Au terme de 14 semaines de régime, nous n'avons pas mis en évidence de surcharge lipidique au niveau du foie des animaux recevant ce régime enrichi. Les mesures effectuées avec des mitochondries isolées de foies et avec des hépatocytes isolés n'ont montré aucune différence au niveau de la bioénergétique ou du métabolisme hépatique entre les différents groupes de rats. En revanche, une modification de la répartition tissulaire a été observée, avec une augmentation des masses des tissus adipeux blanc et brun. Dans cette étude, l'absence de stéatose hépatique et de NASH semble due à une augmentation du stockage des lipides au niveau du tissu adipeux blanc, et à une augmentation de leur oxydation par un processus thermogène au niveau du tissu adipeux brun, permettant ainsi de « brûler » l'excès calorique.
La deuxième partie du travail concernait l'étude des modifications bioénergétiques et métaboliques induites par un régime carencé en choline et méthionine connu pour induire une NASH chez le rat. Nous avons montré que les mitochondries de foie et les hépatocytes isolés de rats traités, avaient une respiration augmentée. Cette stimulation de la respiration était due à un découplage de la chaîne respiratoire par un mécanisme de « proton leak » ET de « redox slipping » au niveau de la cytochrome c oxydase. Ce découplage avait pour conséquence de stimuler l'utilisation de substrats lipidiques et de diminuer la production de radicaux libres de l'oxygène. En parallèle, l'étude avec des hépatocytes isolés nous montre une augmentation de l'oxydation lipidique et de la néoglucogenèse.
Ces résultats suggèrent des adaptations des fonctions mitochondriales et métaboliques des foies de rats atteints de NASH qui permettraient de limiter la surcharge lipidique et le stress oxydant

Influence de quantités croissantes de phytostérols et de cholestérol alimentaires sur la cholestérolémie, le métabolisme lipidique et l'agrégation des thrombocytes. Effet hypolipémiant en fonction du rapport phytostérols/cholestérol alimentaire

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l’adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l’adiponutrine dans le foie, d’une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l’insuline et au glucose et d’autre part, en étudiant l’impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L’adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l’adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l’insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l’orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d’animaux résistants à l’insuline, suggérant qu’elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique
The prevalence of metabolic syndrome (MetS) has increased in industrial countries. The hallmark of MetS in the liver is an excessive accumulation of triglyceride, which is called hepatic steatosis. Different SNP (Single Nucleotide Polymorphism) are associated with hepatic steatosis or MetS. One of them is found on adiponutrin/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) gene (SNP I148M) and is now considered as a new marker of hepatic steatosis and severity of NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). In order to understand the physiological role of adiponutrin in the liver, we studied its transcriptional regulation by SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) and ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein), mediators of insulin and glucose respectively. Moreover, by overexpressing adiponutrin in mice liver, we investigated its role in hepatic carbohydrate and lipid metabolism. We showed that adiponutrin is regulated as lipogenic genes and could have a role lipid metabolism. As for adiponutrin I148M, different SNP are found on substrats of Wnt/β-catenin pathway, a major pathway controlling acinus zonation. We examined the regulation of this pathway by nutritionnal status and in a pathophysiological context of insulin resistance and steatosis. We showed that Wnt/β-catenin pathway is regulated by pancreatic hormones (insulin and glucagon) in the liver in order to adapt hepatocyte phenotype to energetic needs. Moreover, this pathway is dysregulated in insulin resistant mice liver. These data may suggest a link between Wnt/β-catenin pathway deregulation and hepatic metabolic disorders

Le carcinome hépatocellulaire est l'une des tumeurs malignes les plus répandues. La caractérisation de la lignée d'hépatome humain HepaRG nous a permis de démontrer i) sa bipotence liée à la différenciation en hépatocytes ou cellules biliaires ii) le potentiel de transdifférenciation de ces cellules différenciées iii) l'autorenouvellement des hépatocytes différenciés. Les communications cellulaires sont importantes dans ces processus via les voies de signalisation Notch et Wnt/-caténine corrélées à l'expression de facteurs de transcription hépatocytaires. Ces résultats suggèrent que la croissance tumorale est associée à la prolifération des hépatocytes et que la transdifférenciation est un mécanisme susceptible d'alimenter le pool de progéniteurs hépatiques présents au sein de tumeurs différenciées. L'étude du métabolisme des lipides révèle que HepaRG exprime des enzymes fonctionnelles impliquées dans la transformation des acides gras, tout comme les hépatocytes humains normaux.

La stéatose hépatique non-alcoolique (NAFLD) est l’affection hépatique chronique la plus fréquente à l’heure actuelle dans le monde industrialisé car fortement liée au développement du syndrome métabolique et des dyslipidémies associées. À ce jour, les mécanismes de la pathologie restent mal définis et les moyens thérapeutiques disponibles ont une efficacité modérée. Des études épidémiologiques ont rapporté un effet bénéfique de la consommation de thé pour lutter contre les désordres hépatiques et les facteurs de risque cardiovasculaires tel que la dyslipidémie. Cependant, les mécanismes par lesquels le thé atténue la stéatose hépatique et la dyslipidémie restent méconnus. Par conséquent, l’objectif de ce travail de thèse était d’évaluer les effets et les mécanismes d’action d’un mélange de thés vert, oolong et Pu-erh, le thé Hao Ling, sur la NAFLD et la dyslipidémie, à travers deux approches, l’une sur modèle cellulaire et l’autre sur modèle animal.Les résultats ont permis de mettre en évidence que le thé Hao Ling permettait de diminuer la lipogenèse hépatique in vitro et in vivo et ainsi d’atténuer la stéatose induite par un régime hyperlipidique et riche en saccharose chez le rat Wistar. Nous avons observé que ce thé permettait d’améliorer le profil lipidique sanguin en augmentant le taux de HDL plasmatique. Nous avons également pu mettre en évidence que le thé possédait des propriétés antioxydantes et hépato-protectrices permettant de lutter contre un inducteur de stress oxydant in vitro et de diminuer la peroxydation lipidique in vivo. Enfin, nous avons démontré que le stress oxydant "per se" entraînait une accumulation de lipides intracellulaires sur hépatocytes isolés et que le thé, grâce à ses propriétés antioxydantes, prévenait ce phénomène. Le thé Hao Ling constitue une bonne approche nutritionnelle dans la prévention de la NAFLD et dans le maintien du rapport LDL-Cholestérol/HDLCholestérol
Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common chronic liver disease in industrializedcountries because being strongly associated with the development of metabolic syndrome and relateddyslipidemia. To date, the mechanisms of pathology remain poorly defined and available therapeutic meanshave moderate efficacy. Epidemiological studies have reported a beneficial effect of tea consumption in thefight against liver disorders and cardiovascular risk factors such as dyslipidemia. However, the mechanismsby which a blend of green tea, oolong tea and Pu-erh tea, Hao Ling tea, reduces fatty liver and dyslipidemiaremain unknown. Therefore, the objective of this thesis was to evaluate the effects and mechanisms of actionof Hao Ling tea on NAFLD and dyslipidemia, through two approaches, one on cellular model and the other onanimal model. Our results show that Hao Ling tea reduces the hepatic lipogenesis in vitro and in vivo and thusattenuates steatosis induced by a high fat-high sucrose diet in a rat model. We observed that this tea improvesthe blood lipid profile by increasing plasma HDL levels. We were also able to highlight that tea ownsantioxidant and hepato-protective properties to counteract an inducer of oxidative stress in vitro and todecrease lipid peroxidation in vivo. Finally, we have shown that the oxidative stress per se resulted in anaccumulation of intracellular lipid in isolated hepatocytes and that the tea, due to its antioxidant properties,prevented this phenomenon. The Hao Ling tea is a good nutritional approach in preventing NAFLD and tomaintain LDL/HDL ratio

L’obésité est un problème majeur de santé publique en France puisque 50% de la population est en surpoids ou obèse. Plusieurs complications hépatiques de l’obésité existent dont la NASH, pathologie caractérisée par l’association de lésions de stéatose et d’hépatite, d’anomalies des tests hépatiques. Chez un tiers des patients, la NASH conduit à l’apparition d’une fibrose puis d’une cirrhose. Elle favorise l’apparition du carcinome hépatocellulaire.La physiopathologie de la NASH est caractérisée par une dérégulation du métabolisme lipidique qui conduit à l’accumulation de lipides au niveau des hépatocytes. Celle-ci est toxique. La composition et le rôle des lipides comme promoteur de la NASH est de plus en plus étudié.Le premier volet de la thèse concerne la mise en évidence de marqueurs diagnostiques de la NASH. Dans cette étude, nous avons établi pour la première fois une signature lipidique de la NASH sur la base de la quantification de 32 lipides. Aucun des lipides identifiés ne permettait par lui-même de discriminer la stéatose de la NASH.En revanche, la signature lipidique globale permettait de distinguer les témoins patients des NAFL et des NASH. Nous avons également mis en évidence une dérégulation de la voie métabolique impliquée dans la synthèse des acides gras dans la NASH.Le deuxième volet avait pour objectif l’identification de nouveaux marqueurs pronostiques de la NASH. L'analyse par microarray d'expression de gènes a montré 1549 gènes discriminant les patients ayant une stéatopathie, NAFL ou NASH, des obèses sains ou des contrôle. Parmi eux, 58 gènes discriminaient la NASH de la stéatose simple. Ces gènes étaient impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire et l'inflammation. Le gène le plus discriminant était FABP4. Parmi les gènes fortement associés à une expression élevée de FABP4, la métalloprotéinase MMP9 était surexprimée chez 55% des patients NASH. Nous avons identifié un total de 330 gènes régulés de manière différentielle, dont 229 gènes étaient surexprimés chez des patients NASH présentant un niveau d'expression élevé de MMP9. En utilisant les niveaux d'expression génique des gènes FABP4 et MMP9 hépatiques comme indicateurs de la progression de la maladie dans une cohorte indépendante de patients atteints de NAFLD, nous avons identifié les patients atteints de NAFL et NASH susceptibles d'avoir un mauvais pronostic.Enfin, dans le troisième volet, nous nous sommes intéressés à la valeur diagnostique et pronostique de la stéatose des greffons hépatiques, mesurée par FTIR. En effet, la stéatose en particulier lorsqu’elle dépasse 60% et macrovacuolaire, est connue pour impacter significativement la fonction et la survie des greffons hépatiques. Dans notre étude, parmi 58 prélèvements de greffons, le pourcentage moyen de stéatose macrovacuolaire et de stéatose microvésiculaire, évalué par le pathologiste, était de 2% à 30%, respectivement. La concentration moyenne en triglycérides hépatiques mesurée par chromatographie couplée en phase gazeuse à la spectrométrie était de 214 nmol/mg de tissu hépatique. L'estimation de la teneur en triglycérides obtenue par FTIR était significativement corrélée (r2 = 0,812) avec les résultats de la concentration moyenne en triglycérides hépatiques mesurée par chromatographie couplée en phase gazeuse à la spectrométrie. Trente-quatre (58%) patients ont présenté des complications définies par un stade Dindo-Clavien ≥2, dont 2 non-fonction primaire du greffon et 5 décès. Le seuil le plus discriminant entre le niveau de triglycérides et l’échec de la TH était de 54,02 nmol/mg de tissu hépatique obtenu par FTIR. La quantification du contenu hépatique en triglycérides par GC/MS était significativement associée à la survie du patient à la fin du suivi (p<0,0001) et à un échec de la transplantation (p <0,0001). L'estimation du contenu hépatique en triglycérides à l'aide de FTIR était significativement associée à la survie après greffe d'un an (p<0,0001)
Obesity is a major public health problem in France since 50% of the population has overweight. Several hepatic complications of obesity exist including NASH, pathology characterized by the combination of histological lesions of hepatic steatosis and hepatitis, liver test abnormalities and the absence of known liver disease, particularly toxic (alcohol) or virus. In one third of patients, NASH leads to fibrosis and then cirrhosis. It also promotes the development of hepatocellular carcinoma.The pathophysiology of NASH is characterized by a deregulation of lipid metabolism that leads to the accumulation of lipids in the hepatocytes. This accumulation of lipids is toxic and one of the causes of insulin resistance and the development of diabetes mellitus. All stages of lipid metabolism are affected by an accumulation of triglycerides, an increase in hepatic lipogenesis and a decrease in ß-oxidation. The composition and the role of lipids as a promoter of NASH is being increasingly studied.The first part of the thesis concerns the detection of diagnostic markers of NASH. In this study, we established for the first time a lipid signature of nonalcoholic steatohepatitis by quantification of 32 lipids. The overall lipid signature allowed distinguishing controls from NAFL and NASH. We have also demonstrated a deregulation of the metabolic pathway involved in the synthesis of fatty acids in NASH. This deregulation has been observed in both humans and animal models in our study.The second part aimed to identify new hepatic prognostic markers of NASH. Microarray analysis of gene expression showed 1549 genes discriminating patients with NAFL or NASH, healthy obese or controls. Among them, 58 genes discriminated NASH from simple steatosis. These genes were involved in extracellular matrix remodeling and inflammation. The most discriminating gene was FABP4 (fatty acid binding protein 4). Among genes strongly associated with high expression of FABP4, matrix metalloproteinase-9 (MMP9) was overexpressed in 55% of NASH patients. We identified a total of 330 differentially regulated genes, of which 229 genes were overexpressed in NASH patients with high levels of MMP9 expression. Using the gene expression levels of the liver FABP4 and MMP9 genes as indicators of disease progression in an independent cohort of NAFLD patients, we identified patients with NAFL and NASH who may have a poor prognosis.Finally, in the third part, we looked at the diagnostic and prognostic value of steatosis of liver grafts, measured by FTIR (Infrared Fourier Transform Microspectroscopy). Indeed, steatosis, when it exceeds 60% and is macrovacuolar, is known to significantly impact the function and survival of liver grafts. In our study, among 58 graft samples, the average percentage of macrovacuolar steatosis and microvesicular steatosis assessed by the pathologist was 2% to 30%, respectively. The average concentration of liver triglycerides measured by gas chromatography-spectrometry was 214 [10-1045] nmol/mg liver tissue. The FTIR triglyceride content estimate was significantly correlated (r2=0.812) with the results of the average hepatic triglyceride concentration measured by gas chromatography-spectrometry. Thirty-four (58%) patients had complications defined by a Dindo-Clavien stage ≥2, including 2 non-primary graft function and 5 deaths. The most discriminating threshold between triglyceride level and TH failure was 59.29 and 54.02 nmol/mg hepatic tissue obtained by spectrometry and FTIR, respectively. Quantification of hepatic triglyceride content by GC/MS was significantly associated with patient survival at the end of follow-up (p <0.0001) and failure of transplantation (p <0.0001). Estimating hepatic triglyceride content using FTIR was significantly associated with one-year post-transplant survival (p <0.0001)

La consommation excessive de graisses est aujourd’hui l’une des causes principales de l’augmentation de la prévalence des maladies métaboliques. Après leur hydrolyse, les graisses sont absorbées par les entérocytes sous forme d’acides gras (AG) et de monoglycérides qui sont pris en charge dans la cellule par de petites protéines cytosoliques, les FABPs. L’entérocyte exprime la I- FABP et la L-FABP dont la fonction spécifique dans le trafic intracellulaire des AG est toujours mal connue. Pour appréhender les relations structure-fonction in vivo, la caractérisation immunocytochimique de cellules Cos-1 transfectées exprimant de grandes quantités de FABPs a été réalisée. Ces protéines ciblent l’AG vers des sites de métabolisation (mitochondries ou réticulum endoplasmique / appareil de Golgi). Lorsque chaque protéine est exprimée isolément dans la cellule, elle distribue de façon spécifique un analogue fluorescent d’AG, suggérant une fonction propre pour chacune. Mais lorsqu’elles sont toutes deux présentes, elles coopèrent pour la distribution de l’AG dans des régions comparables à celles ciblées par la seule I-FABP suggérant un rôle de sensor pour cette protéine. Ce travail a été poursuivi en montrant que les régulations de l’expression de la I-FABP et de la L-FABP différaient dans un modèle de syndrome métabolique induit par un régime riche en fructose chez le rat. Dans ce modèle, nous avons aussi analysé les effets de l’apport dans le régime des AG polyinsaturés oméga 3 sur l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme énergétique et l’inflammation. Un rôle spécifique de PPAR delta dans le foie et le cœur a pu être mis en évidence
Excessive consumption of fat has emerged as a major cause of increased prevalence of metabolic diseases. After their hydrolysis in the intestinal lumen, fatty acid (FA) and monoglycerides are absorbed by the enterocytes. Inside these cells FA are bound to small cytosolic proteins, the FABPs, before to be re-esterified into triglycerides then secreted as lipoproteins into the chyle. Enterocytes express I-FABP and L-FABP whose specific role in intracellular FA trafficking is still unknown. To clarify this point we have carried out an in vivo structure-function study by immunocytochemical characterization of transfected Cos-1 cells expressing large amounts of proteins. These proteins target a fluorescent FA to cellular sites of metabolism (mitochondria and endoplasmic reticulum / Golgi apparatus). When each protein is expressed within the cell, the fluorescent bound-FA is specifically distributed, suggesting a specific function. Conversely, when both proteins are present they cooperate for the distribution of the FA in similar areas than those targeted by the I-FABP expressed alone suggesting a sensor role for this protein. Another approach has been to show that the regulation of the expression of I-FABP and L-FABP differed in the rat model of metabolic syndrome induced by a fructose-enriched diet. To enlarge our knowledge of this model, the effects of polyunsaturated omega-3 FA intake on the expression of genes involved in energetic homeostasis and infammatory pathways were described. A specific role of PPAR delta in the liver and the heart was evidenced

Le récepteur LSR est un acteur important du métabolisme hépatique, puisqu'il joue un rôle dans la clairance des lipoprotéines à ApoB/ApoE riches en triglycérides durant la période postprandiale. Dans cette étude, nous avons montré qu'un traitement in vitro par DHA peut augmenter les niveaux de protéine et d'activité LSR dans les cellules d'hépatome de souris Hepa 1-6. En toute cohérence, un régime supplémenté en DHA a conduit à élever les niveaux de protéine LSR hépatique chez la souris. Mais aucune de ces deux études n'a montré de changement au niveau des ARNm. Ceci suggère que l'enrichissement en DHA influe positivement sur le microenvironnement de LSR et son ancrage à la surface de la cellule. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur PPAR[alpha] dans la régulation du gène lsr. Une analyse in silico nous a permis d'identifier des éléments PPRE dans la région 5' régulatrice du gène humain et de ses homologues de souris et de rat. Des traitements pharmacologiques par des agoniste et antagoniste spécifiques de PPAR[alpha] ont montré que ce récepteur est impliqué dans la régulation transcriptionnelle de l'expression du LSR dans les cellules Hepa 1 6. Enfin, une analyse transcriptomique a révélé une diminution de l'expression de PPAR[alpha] et d'autres gènes impliqués dans le métabolisme lipidique hépatique chez la souris LSR+/- sous régime standard ou riche en graisses. En conclusion, toutes ces études indiquent que l'activité LSR hépatique est sous le contrôle de facteurs nutritionnels capables d'activer divers mécanismes de régulation, faisant du LSR une cible d'intérêt potentiel pour des stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques destinées à prévenir ou traiter les dyslipidémies
Lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) plays an important role in the clearance of ApoB/ApoE containing triglyceride-rich lipoproteins during postprandial phase. In this study, we demonstrated that in vitro treatment of mouse hepatoma cells, Hepa 1-6, with docosahexaenoic acid (DHA) led to an increase in LSR protein levels as well as its activity. Furthermore, the mice placed on the diet supplemented with DHA showed an increase in hepatic LSR protein. However, the mRNA levels remained unchanged in both in vitro and in vivo studies, suggesting that DHA enrichment may result in changes in LSR microenvironment that could affect its anchorage at the surface of cell membrane. Specific peroxisome proliferator response elements were identified in the upstream region of human, mouse and rat lsr gene by in silico analysis. We therefore sought to determine the role of the transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR[alpha]), in LSR regulation. In vitro pharmacological studies using PPAR[alpha]-selective agonist and antagonist agents demonstrated that PPAR[alpha] is indeed involved in the transcriptional regulation of LSR expression. Furthermore, qPCR array analysis revealed the downregulation of PPAR[alpha] and various genes involved in hepatic lipid metabolism in LSR+/- mice on standard and high-fat diets. In conclusion, these studies show that the hepatic LSR activity is controlled by dietary factors that can activate various pathways involved in regulating lipid homeostasis, therefore representing LSR as a potential target for either nutritional or therapeutic strategies towards the prevention or treatment of dyslipidemia

Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette thèse illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte dans l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le HCV. Les données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une stéatose, notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus peut avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur pour moduler le degré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront nécessaires pour établir la nature de ces facteurs
The results presented in this thesis illustrate the difficulty of assessing the part related to the virus and that related to host factors in the induction of hepatic steatosis in patients chronically infected with HCV. In vitro data suggest that the virus plays a direct role in the induction of steatosis, due to the properties of its capsid protein, and that the variability of the virus can affect the intensity of the steatosis. Our bio-clinical study suggests that this variability seems to have a much more moderate impact in vivo. Thus, in patients chronically infected with HCV, host factors seem to play a major role to modulate the degree of steatosis associated with the virus. Further studies are needed to establish the nature of these factors

Chez la vache laitière à haut rendement, la période de transition entourant la parturition est généralement accompagnée d’un déficit énergétique, d’un métabolisme des lipides perturbé et d’une augmentation de l’inflammation et du stress oxydatif. Afin d’améliorer la balance énergétique et de diminuer certains effets négatifs associés à la période de transition, il est fréquent que les producteurs administrent des diètes riches en lipides (ex. Mégalac®, riche en acide palmitique) aux vaches laitières à haut rendement. Par exemple, l’ajout de lipides saturés à la ration améliore la balance énergétique et diminue l’accumulation des triglycérides dans le foie. Cependant, plusieurs troubles métaboliques demeurent, tels que l’inflammation et le stress oxydatif, pouvant être observés entre autres au niveau du foie. Comme alternative aux lipides saturés, l’ajout d’acides gras polyinsaturés (AGPIs) pourrait contribuer à améliorer la balance énergétique tout en diminuant certains effets négatifs associés à la période de transition. Toutefois, les AGPIs sont sujets aux phénomènes de peroxydation ce qui pourrait augmenter le stress oxydatif chez l’animal. Pour limiter ces dommages oxydatifs, l’utilisation de la graine de lin entière, riche en acides gras oméga-3 (n-3) et en lignans (antioxydants), en supplément alimentaire apparaît comme une avenue prometteuse. Des travaux antérieurs rapportent qu’une supplémentation en différents dérivés de la graine de lin (ex. AGPIs, lignans) module l’expression de certains gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif et le métabolisme des lipides dans la glande mammaire de la vache laitière. Cependant, il n’existe aucune étude rapportant l’effet de divers composés de la graine de lin sur le métabolisme lipidique et certains marqueurs de stress oxydatif dans le foie de la vache laitière. Ce projet de recherche a été réalisé afin de déterminer les effets de différents ratios d’acides linoléique (LA)/acide alpha-linolénique (ALA) (n-6/n-3, AGPI) en présence ou non d’entérolactone (ENL, lignan mammalien) sur (1) l’expression hépatique de gènes liés au métabolisme des lipides, au processus inflammatoire et au stress oxydatif, (2) les dommages aux lipides et aux protéines et (3) l’activité de l’enzyme superoxyde dismutase (SOD) dans le foie de la vache laitière en début de lactation. Un modèle in vitro de culture de tissu hépatique en tranches minces a été utilisé puisqu’il permet de préserver les interactions cellules-matrice et entre les cellules. Les gènes sélectionnés ont été choisis en se référant à diverses études antérieures et incluent certains gènes différentiellement exprimés dans le foie et la glande mammaire de la vache laitière en période de transition. Des régulateurs de la transcription (ex. MLXIPL et SREBF1), de même que leurs gènes cibles ont été priorisés. Les tissus issus de biopsies hépatiques de vaches Holstein en début de lactation ont été mis en culture et soumis à huit traitements composés de différents ratios d’AGPIs n-6/n-3, d’ENL et d’une combinaison des deux. Suite à ces traitements, les niveaux d’ARNm des gènes sélectionnés ont été mesurés par PCR quantitatif (RT-qPCR). Les dommages aux lipides ont été mesurés par l’essai des « thiobarbituric acid reactive substances » (TBARS) et les dommages aux protéines par une analyse des protéines carbonyles. Finalement, un essai enzymatique a été effectué pour mesurer l’activité de la SOD, une enzyme jouant un rôle dans le système de défense contre les radicaux libres. Les résultats de cette étude démontrent que l’ajout d’AGPIs (LA et ALA) dans le milieu de culture augmente l’expression de certains gènes liés au stress oxydatif (NQO1, PRDX3, PTGS2 et SOD1) et diminue l’expression de plusieurs gènes liés à l’activité lipogénique (ACACA, FASN, SCD et SREBF1). L’addition d’ENL dans le milieu de culture augmente l’abondance de l’ARNm des gènes cibles de MLXIPL, soit FASN et SCD, deux gènes impliqués dans l’activité lipogénique. Cette régulation à la hausse suggère qu’une supplémentation en tourteau ou en farine de lin (riche an lignans) en début de lactation pourrait avoir des effets non désirés et augmenter le risque de stéatose hépatique. Les analyses de peroxydation des lipides ont révélés une augmentation des dommages aux lipides en présence des AGPIs et un retour aux valeurs du traitement contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Une augmentation similaire est observée pour l’activité de la SOD avec l’ajout des AGPIs au milieu de culture, ainsi qu’un retour aux valeurs contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Ces résultats suggèrent qu’une supplémentation en graines de lin entières serait bénéfique en début de lactation puisque les AGPIs pourraient diminuer l’activité lipogénique au niveau du foie, alors que les lignans présents naturellement dans l’écorce de la graine de lin, pourraient réduire le stress oxydatif et les dommages aux lipides provoqués par des niveaux élevés en AGPIs.

Au cours du vieillissement, l’organisme subit de nombreuses altérations, dont une perte de masse et de fonction musculaire appelée sarcopénie. Ses causes sont multifactorielles. Elle est partiellement liée à une altération de la stimulation de la synthèse protéique musculaire post-prandiale, et certains facteurs tels que le stress oxydant, l’inflammation et la résistance à l’insuline, responsables de nombreux dysfonctionnements métaboliques, accélèrent ce phénomène. Or, ces dérégulations peuvent être induites par une alimentation trop riche en sucres ajoutés, caractéristique des habitudes alimentaires actuelles et qui pourrait donc accélérer le vieillissement. Pourtant, à ce jour, peu d'études ont étudié les effets combinés du vieillissement et d'un régime riche en sucres ajoutés, et à notre connaissance, aucune ne s’est intéressée à la sarcopénie. Ainsi, notre objectif au cours de cette thèse a été de déterminer si un régime riche en sucres ajoutés était capable d'accélérer la sarcopénie. Il était également intéressant d'étudier les effets combinés du vieillissement et de ce régime sur d'autres tissus qui semblent particulièrement exposés, le foie, et le cerveau. Enfin, nous avons également voulu analyser les effets préventifs d'un mélange de micronutriments à la fois in vivo et in vitro. Pour cela, des rats âgés de 16 mois ont été nourris durant 5 mois avec un régime contrôle ou un régime composé à 62% de saccharose, supplémenté ou non en rutine, vitamine A, vitamine E, vitamine D, zinc, et sélénium. En outre, nous avons également inclut un groupe de témoins adultes (8 mois), nourris avec un régime contrôle. Par ailleurs, les effets anti-inflammatoires des micronutriments ont été testés in vitro.Nous avons pu constater que le régime riche en saccharose a accéléré la perte de masse musculaire liée à l’âge en altérant la synthèse protéique musculaire post prandiale, vraisemblablement via l’altération de la sensibilité à l’insuline plutôt que par une augmentation du stress oxydant et de l'inflammation, qui ont été peu affectés par le régime. Il a également entraîné un gain de masse grasse et une augmentation marquée des triglycérides hépatiques et plasmatiques, qui pourraient en partie s’expliquer par une modification de l’activité des enzymes du métabolisme lipidique dans le foie. Au niveau cérébral, la surconsommation de fructose a entraîné une diminution de la concentration protéique qui ne semble pas due à un défaut de synthèse protéique. La supplémentation en micronutriments n’a que partiellement contrecarré les effets du saccharose puisqu’elle n’a pas eu d’effet sur la masse maigre mais a permis de limiter la prise de masse grasse, notamment en inhibant la lipogenèse hépatique. Elle a également restauré la synthèse protéique diminuée au cours du vieillissement dans le cerveau. In vitro, elle a permis de réduire l'inflammation induite expérimentalement.Ainsi, cette thèse a permis de montrer qu’un régime riche en sucres ajoutés accélère la sarcopénie chez le rat âgé mais entraîne également des altérations au niveau hépatique et cérébral. La prévention par les micronutriments testés reste malgré tout limitée
With aging, several alterations occur, including a loss of muscle mass and function, called sarcopenia. Many factors are responsible for the development of sarcopenia, but some factors as inflammation, oxidative stress and insulin resistance, which have many deleterious effects during aging, can reduce meal-induced stimulation of muscle protein synthesis which was shown to partly explain age-related muscle mass loss. Those factors can be induced by a diet rich in added sugar, characteristic of current dietary habits. Although this kind of diet could accelerate aging features, little is known about combined effect of aging and high sugar diet, particularly on sarcopenia. Thus, the purpose of this work was to determine whether high chronic intake of added sugars could accelerate sarcopenia. We also interested in the combined effect of added sugars and aging on other exposed tissues: liver and brain. Finally, we assessed the preventive effects of a micronutrient supplementation both in vivo and in vitro.In order to do that, for 5 months, 16 month old rats were starch fed or sucrose fed (62% sucrose), with or without micronutrients supplementation (rutin, vitamin A, vitamin E, vitamin D, selenium and zinc). Additionally, an adult control group of 8 month old rats was included. Besides, anti-inflammatory effects of micronutrients were tested in vitro.We showed that high sucrose diet accelerated age-related muscle mass loss by impairing postprandial protein synthesis, likely through decreased insulin sensitivity since inflammation and oxidative stress were only slightly affected by high sucrose diet. This diet also resulted in fat mass gain and increased plasma and liver triglycerides, by modulating the activity of enzymes involved in liver lipid metabolism. In the brain, high sucrose consumption led to decreased protein concentration independently of protein synthesis alteration. Micronutrients supplementation only partially reversed high sucrose diet effects: it did not act on lean body mass but prevented fat mass gain, by inhibiting hepatic lipogenesis. It also restored brain protein synthesis, which was reduced by aging. In vitro, it reduced experimentally induced inflammation.Thus, this work showed that a high sucrose diet accelerates sarcopenia in old rats but also induces liver and brain alterations. Prevention by micronutrients remained limited

Les arylsulfatases a et b sont des hydrolases lysosomiques intervenant dans la degradation des sulfolipides et des mucopolysaccharides. L'arylsulfatase c est une hydrolase cytosolique hydrolysant les steroides sulfates. Le deficit hereditaire de l'activite des arylsulfatases a, b et c est responsable, respectivement, de la leucodystrophie metachromatique, de la mucopolysaccharidose de type six et de l'ichtyose liee a l'x. Nous avons teste un nouveau modele experimental pour l'etude de ces maladies de surcharge: les lignees lymphoblastoides transformees par le virus d'epstein-barr. Nous avons demontre la validite de ce modele sur le plan enzymatique pour l'ensemble des maladies avec deficit en sulfatases. L'etude du metabolisme des sulfolipides dans les cellules lymphoblastoides intactes nous a permis de mettre en evidence trois compartiments intervenant dans le metabolisme du sulfatide dont un nouveau compartiment d'hydrolyse, non lysosomique. Nous avons egalement montre, sur lignees lymphoblastoides de maladie de krabbe, l'existence d'une voie de degradation non lysosomique du galactosylceramide. Nous avons aussi demontre que la maladie de farber (deficit en ceramidase lysosomique) n'est pas accompagnee d'un bloc complet de la degradation du ceramide et nous avons propose pour le diagnostic de cette affection de nouveaux tests sur cellules vivantes. L'etude du metabolisme du cholesterol sulfate a montre qu'il est capte par voie recepteur-independante et qu'il ne s'accumule pas dans les lignees lymphoblastoides provenant de patients atteints d'ichtyose liee a l'x alors que sa degradation y est totalement deficitaire

La trimétazidine (TMZ) est le principe actif du Vastarel médicament prescrit dans l'insuffisance coronarienne (angor). Cette molécule anti-ischémique n'a pas d'effet hémodynamique et son mode d'action n'est pas connu. Des travaux dans des modèles d'hypoxies et d'ischémie induites expérimentalement ont conduit a imaginer un nouveau mécanisme cardioprotecteur impliquant la cytoprotection directe du myocarde ischemié. Une étude précédente (Fantini et al. 1994) a suggéré que cette cytoprotection pouvait être liée au métabolisme des lipides. Nos résultats montrent qu'in vivo chez le rat un traitement de 4 semaines avec la TMZ à 6 mg/kg/j provoque une perturbation du métabolisme des acides gras spécifique des phospholipides cardiaques. In vitro, sur des cardiomyocytes en culture, la TMZ (500 m) stimule l'incorporation d'acides gras radio marqués (acide arachidonique et linoléique) et des molécules hydrophiles radio marquées (inositol, éthanolamine, et glycérol) dans les phospholipides. Sur un modèle de cœur entier perfusé, la TMZ (1 et 10 m) stimule l'incorporation de 2-#3h-glycerol principalement dans les phosphatidylinositols et les cardiolipides. Ces résultats suggèrent que la TMZ interfère avec le métabolisme des phospholipides en augmentant le renouvellement des phospholipides membranaires. Cet effet stimulateur aurait pour conséquence de mobiliser les acides gras vers les phospholipides membranaires, réduisant leur disponibilité pour la production d'énergie et induisant par conséquent une augmentation de la part glucidique dans cette production.

La stéatose hépatique est une pathologie associée à l'obésité et à l'insulinorésistance. Les mécanismes à l'origine du développement de la stéatose hépatique sont loin d'être élucidés. Cependant, une altération de la fonction mitochondriale pourrait contribuer à l'accumulation de lipides dans le foie. Par conséquent, l'objectif de ce travail est d'évaluer la fonction mitochondriale dans deux modèles animaux de stéatose hépatique ainsi que les effets de deux molécules, le rimonabant et le resvératrol. Dans un modèle génétique d'obésité, le rat Zucker, aucune altération de la phosphorylation oxydative n'est observée. Dans un modèle plus physiologique, le rat alimenté avec un régime riche en lipides pendant différentes durées, dans les premiers temps d'un apport accru en lipides, le métabolisme hépatique est orienté de manière à utiliser ou à stocker l'excès de lipides. Cette première adaptation est ensuite inversée et une diminution de l'oxydation des acides gras mais également une diminution du stockage de triglycérides sont observées. Le traitement avec du rimonabant de rats alimentés avec un régime en gras, a un effet bénéfique sur la fonction mitochondriale hépatique notamment en augmentant l'entrée des acides gras dans la mitochondrie et donc leur oxydation. Enfin, le traitement par du resvératrol de cellules HepG2, entraîne une augmentation de la consommation d'oxygène mitochondriale et une augmentation de l'activité du complexe I mais sans modification de la biogenèse mitochondriale. Même si la mitochondrie semble peu affectée au cours du développement de la stéatose hépatique, la considérer comme une cible thérapeutique reste pertinent.

L'évaluation quantitative de la fonction hépatocellulaire est un concept essentiel dans l'étude de la biotransformation des médicaments. L'influence de la pathologie hépatique a été évaluée en étudiant le métabolisme de la caféine, qui est pluri-enzymatique et sous contrôle polygénique. Des études concernant la cirrhose biliaire primitive, alcoolique, les hépatites virales et médicamenteuses, la transplantation hépatique ont été menées. Elles ont démontré une altération différentielle des voies métaboliques de la caféine en fonction des pathologies. L'exploration de la N-acétyltransférase, réalisée grâce au test à la caféine, a été conduite dans le purpura thrombopénique idiopathique et en comparant des populations khmère et caucasienne. Cette approche a été comparée aux apports du " therapeutic drug monitoring" et la Pharmacogénomique
Quantitative liver function assessment is a major concept in drug biotransformation studies. Caffeine metabolism, which is pluri-enzymatic and under polygenic control, was used to assess the effect of liver disease. Studies concerning primary biliary cirrhosis, alcoholic cirrhosis, hepatitis of viral and drug origin, liver transplantation were conducted. They displayed differential modification of caffeine metabolism pathways according to pathologies. N-acetyltransferase investigation using caffeine test was conducted in chronic autoimmune thrombocytopenic purpura and comparing khmer and caucasian populations. Therapeutic drug monitoring and Pharmacogenomic approach were discussed in comparison

La revue générale est consacrée au métabolisme des triglycérides et esters de cholestérol cellulaires d'origines exogène et endogène ainsi qu'aux divers systèmes enzymatiques impliques dans leur dégradation. Elle fait également le point sur la myopathie a surcharge lipidique multisystemique, (ou neutral lipid storage disease, nlsd) et sur la maladie de wolman, maladies génétiques présentant respectivement un blocage de la dégradation des triglycérides cytoplasmiques et lysosomiques. Les cellules de ces maladies nous servent de modèle pour les études de compartimentation métabolique. La dégradation des triglycérides et des esters de cholestérol apportes par les hdl dans les fibroblastes semble se produire dans des compartiments subcellulaires extra-lysosomiques similaires a ceux impliques dans la dégradation des triglycérides et esters de cholestérol d'origine endogène. Les triglycérides neosynthetises par la cellule ou apportes par les hdl s'accumulent dans les fibroblastes de nlsd, alors que les esters de cholestérol sont dégrades normalement (febs lett. , 1993, 328, 230-234). Les triglycérides lies aux hdl sont captes sélectivement sans internalisation des apoprotéines (biochem. J. , 1994, 297, 467-473). Il existe deux systèmes enzymatiques différents impliques dans la dégradation des triglycérides endogènes en fonction de la longueur de chaîne des acides gras incorpores. Au dessous de 10 atomes de carbone, les enzymes impliques seraient apparentes a des carboxylesterases (non déficitaire dans la nlsd). Au dessus de 10 atomes de carbone, les triglycérides seraient degrades par la lipase neutre cytoplasmique (déficitaire dans la nlsd). La lipase neutre est transférée du cytosol vers les membranes lors de la charge en acide oléique dans les cellules normales alors que dans les cellules de nlsd elle reste cytosolique. Cette translocation peut être bloquée par des inhibiteurs de la synthèse protéique ainsi que par un inhibiteur de la protéine kinase c. Enfin la dernière partie de notre travail expérimental a consiste en une thérapie génique des cellules de nlsd par transsection avec de l'ADN génomique murin puis sélection des cellules corrigées par photosensibilisation

Le foie, véritable carrefour métabolique, pourrait participer aux mécanismes adaptatifs que développent les endothermes lors d'exposition prolongée au froid soit directement comme site thermogène soit indirectement en favorisant la fourniture de substrats énergétiques aux tissus thermogènes. Ce travail a étudié les adaptations du métabolisme hépatique chez les canetons de Barbarie en croissance au froid qui développent des capacités de thermogenèse sans frisson (NST, nonshivering thermogenesis) originale en l'absence de tissu adipeux brun, le site majeur de la NST chez les petits mammifères. Deux lots de canetons âgés de 4-5 semaines ont été comparés: des canetons témoins élevés à thermoneutralité (25ʿC, TN) et des canetons acclimatés au froid (4ʿC, AF) pendant 4 semaines. Avec un modèle de foie perfusé, il a été montré que le foie pourrait participer à la thermogenèse de régulation en raison d'une augmentation du métabolisme oxydatif hépatique (+29% à +65%) et de la néoglucogenèse sous contrôle du glucagon (2,2 fois). Avec des hépatocytes isolés, des mécanismes spécifiquement thermogènes n'ont pas été mis en évidence, mais après incubation, les hépatocytes isolés de canetons AF pouvaient montrer une plus forte activité de néoglucogenèse et de cétogenèse. La capacité de lipogenèse hépatique, mesurée par la synthèse de novo des acides gras (AG) et reliée aux activités hépatiques des enzymes clefs de la lipogenèse, était fortement accrue au froid. La lipogenèse hépatique accrue pourrait fournir des substrats lipidiques aux tissus, comme le muscle squelettique, dont le potentiel d'oxydation des AG est accru au froid (+29%). Le foie contribuerait ainsi au maintien de l'équilibre énergétique pendant l'acclimatation au froid en synthétisant des substrats énergétiques indispensables aux tissus thermogènes, cet anabolisme pouvant être générateur de chaleur et participer à la thermogenèse de régulation. La plasticité du métabolisme hépatique après acclimatation au froid pourrait être un élément clef de l'adaptation métabolique au froid de jeunes oiseaux et pourrait contribuer au développement de la NST aviaire. Les particularités du métabolisme hépatique des canetons de Barbarie pourraient contribuer à leur capacité de stéatose bien connue.

Des études épidémiologiques ont montré que l’exposition à certains xénobiotiques est associée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques. L’Homme est exposé à des mélanges de xénobiotiques de manière chronique et inévitable. Nous avons étudié les effets de l’interaction de deux xénobiotiques sur le métabolisme du foie, organe majeur de détoxification de l’organisme. Nous avons choisi deux perturbateurs endocriniens et polluants organiques persistants, qui activent des voies de signalisation différentes: la 2, 3, 7, 8 tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD), agissant via le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR), et l’α-endosulfan, un pesticide organochloré, qui peut agir via la voie du récepteur aux oestrogènes (ER) ou du récepteur X aux pregnanes (PXR). Notre objectif est de déterminer l’effet du mélange de ces polluants par rapport à chaque polluant isolé sur la régulation de certaines voies du métabolisme hépatique in vitro dans la lignée hépatocytaire humaine, HepaRG. Dans une première publication, une étude du transcriptome de cellules HepaRG différenciées a été effectuée. Ces cellules ont été exposées pendant 30 heures à 25nM de TCDD, 10μM d’α-endosulfan, ou au mélange. Nous avons observé que le mélange inhibe fortement l’expression de certains gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et dans celui des alcools. Dans une seconde étude, nous avons donc étudié le mécanisme d’action du mélange sur le métabolisme glucidique. L’expression de deux gènes de la néoglucogenèse hépatique, le transporteur de glucose 2 (Glut2) et la glucose 6 phosphatase (G6Pc), est réduite de plus de 80% par le mélange. L’expression d’autres gènes du métabolisme glucidique (pyruvate kinase, glycogène synthase, glycogène phosphorylase, pyruvate déhydrogénase 2) est aussi diminuée, suggérant que le mélange peut affecter ce métabolisme de manière significative. De plus, la production de glucose diminue de 80% avec le mélange dans des conditions néoglucogéniques. En condition glycolytique, l’oxydation du glucose en CO2 diminue de 30% après 72 heures d’exposition au mélange. Un traitement à plus long terme (8 jours) avec des doses plus faibles des polluants (0.2 à 5nM de TCDD, 3μM d’α-endosulfan) diminue aussi l’expression de la G6Pc et de Glut2. Nous avons montré que la TCDD active bien la voie du AhR, et que le ER est impliqué dans l’action de l’α-endosulfan. Dans la troisième partie de cette thèse, nous avons étudié la régulation de plusieurs enzymes impliquées dans le métabolisme de l’alcool (alcool déshydrogénases, ADHs, cytochrome P450 2E1, CYP2E1) après l’activation du AhR. Les agonistes du AhR entrainent la diminution de l’expression des ARNm des ADH1, 4, 6 et du CYP2E1 et des protéines correspondantes. Nous avons montré que cette régulation utilise la voie génomique du AhR. De plus, cet effet est également observé après traitement de 8 jours par de faibles doses de TCDD. L’exposition chronique de l’Homme à de faibles doses de xénobiotiques en mélange pourrait affecter le métabolisme glucidique hépatique et contribuer, en partie, au développement du syndrome métabolique
Epidemiological studies have shown that exposure to certain xenobiotics is associated with an increased prevalence of metabolic diseases. Humans are exposed to mixtures of xenobiotics in a chronic and inevitable way. We studied the effects of the interaction of two xenobiotics on metabolism in the liver, the major organ for detoxification in the body. We chose two endocrine disruptors and persistent organic pollutants which activate different signaling pathways: 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), which uses the AhR (Aryl hydrocarbon receptor) pathway, and α-endosulfan, an organochlorine pesticide, which acts via the PXR (pregnane X receptor) and/or the ER (estrogen receptor) pathway. Our aim was to determine the effects of this pollutant mixture, as compared to each pollutant alone, on the regulation in vitro of some hepatic metabolism pathways in the human hepatic cell line, HepaRG. In the first publication, a transcriptomic study of differentiated HepaRG cells was performed. The cells were exposed for 30h to 25nM TCDD, to 10 µM α-endosulfan or to the mixture. We observed that the mixture strongly inhibited the expression of some genes involved in the metabolism of glucose and alcohol. In the second study, we studied the mechanism of action of the mixture of pollutants on the metabolism of glucose. The expression of two genes involved in hepatic gluconeogenesis, glucose transporter 2 (GLUT2) and glucose-6-phosphatase (G6Pc), were reduced 80% by the mixture. The expression of other glucose metabolism genes (pyruvate kinase, glycogen synthase, glycogen phosphorylase, pyruvate dehydrogenase 2) also was decreased suggesting that the mixture might impact markedly carbohydrate metabolism. Furthermore, glucose production decreased 40% with the mixture under gluconeogenic conditions. Under glycolytic conditions, the oxidation of glucose into CO2 decreased 30% after 72h of exposure of the cells to the mixture. Long-term treatment (8 days) with lower doses (0.2 to 5 nM TCDD, 3 µM α-endosulfan) similarly decreased G6Pc and GLUT2 expression. We showed that TCDD activated the AhR pathway, and that ER was partly involved in the α-endosulfan effect. In the third part of this thesis, we studied the regulation of several enzymes involved in the metabolism of alcohol (alcohol dehydrogenase, ADH, cytochrome P450 2E1, CYP2E1) after activation of AhR. AhR agonists led to a decrease in the amounts of mRNAs for ADH1, 4, 6 and CYP2E1 and the corresponding proteins. We showed that this regulation uses the AhR genomic pathway. Furthermore, this effect was also observed after 8 days of treatment with lower doses of TCDD. Chronic exposure of individuals to low doses of xenobiotics in mixtures might significantly affect hepatic carbohydrate metabolism and be a contributing factor for the development of the metabolic syndrome

Les liaisons proteiques plasmatiques de la pipequaline sont etudiees par dialyse a l'equilibre. In vitro, son pourcentage de fixation dans le plasma est d'environ 95%, il est constant aux concentrations therapeutiques. Cette molecule se fixe avec une grande affinite a un site de l'aga et a deux sites specifiques sur la sah. Les lipoproteines presentent un profil de fixation saturable avec un nombre de sites eleve. La membrane erythrocytaire lie de maniere non saturable la piquequaline. Sur l'aga, la pipequaline partage son site avec la plupart des medicaments basiques mais egalement avec l'ans, molecule acide. Cette sonde de fluorescence a permis d'etudier les interactions ans-medicaments sur le site de l'aga par quenching de fluorescence. Chez le rat in vivo, les techniques d'oldendorf et du foie isole perfuse, ont montre que les liaisons sanguines de la pipequaline ont peu d'influence sur son transfert tissulaire. Ainsi, on constate que dans le cerveau comme dans le foie, une fraction importante de la forme liee sanguine peut diffuser. La vitesse de dissociation du complexe pipequaline-proteine par rapport a sa vitesse de transfert a travers la paroi capillaire et a son temps de transit capillaire est le parametre important dont depend la quantite de medicament extraite a partir de sa fraction initialement liee. De meme, l'effet de la fixation proteique sur l'extraction tissulaire de la pipequaline depend essentiellement de sa fraction initialement libre dans le sang arteriel. Le medicament s'incorpore dans l'hepatocyte selon un mecanisme de transport passif. En revanche, son metabolisme est dose-dependant et son elimination essentiellement biliaire

Etude in vitro des synthèses de lipides neutres et de phospholipides des ovocytes et des coelomocytes de 2 espèces de Néreidiens. La suppression du facteur endocrine d'origine cérébrale entraîne une diminution de taux de synthèse de lipides neutres effectuées par les coelomocytes

Thèse en cotutelle : Université Laval, Québec, Canada et Università Studi Cagliari, Cagliari, Italie
Les facteurs environnementaux jouent un rôle clé dans le développement du syndrome métabolique et de l'obésité, qui sont maintenant de véritables épidémies soulevant des problèmes de santé publique. Les excès de graisse corporelle dans l'obésité et la perte de masse grasse et maigre dans les conditions de dénutrition ou d'anorexie mentale sont le résultat d'un déséquilibre énergétique. Par conséquent, le maintien de l'équilibre énergétique est crucial à la fois pour la prévention de l'obésité et pour le traitement de l'anorexie mentale et d'autres formes de dénutrition. Les signaux lipidiques tels que ceux médiés par les médiateurs des endocannabinoidomes sont profondément impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Dans cette thèse, au sein de deux projets différents, nous avons étudié comment différents facteurs environnementaux, y compris la restriction calorique, l'activité physique, la supplémentation en vitamine D et les médicaments antipsychotiques, peuvent conduire à une modification du métabolisme énergétique par la modulation de la signalisation des endocannabinoïdomes. Les résultats des travaux expérimentaux montrent comment les différentes conditions étudiées provoquent des changements dans les niveaux tissulaires du médiateur lipidique endocannabinoïdome ainsi que dans l'expression de leurs récepteurs et enzymes métaboliques, ce qui peut contribuer aux changements observés de la masse grasse corporelle et du métabolisme énergétique au sein des modèles. Nous concluons que les conditions étudiées peuvent provoquer des changements dans le bilan énergétique par altération de l'endocannabinoidome.
Environmental factors play a key role in the development of obesity-induced metabolic syndrome and obesity, which are now true epidemics raising public health concerns. Both excess body fat in obesity, and fat and lean mass loss in undernutrition conditions or anorexia nervosa, are the result of energy imbalance. Therefore, maintaining energy balance is crucial for both the prevention of obesity and the treatment of anorexia nervosa and other forms of undernutrition. Lipid signals such as those mediated by endocannabinoidome mediators are deeply involved in the control of energy metabolism. In this thesis, within two different projects, we studied how different environmental factors including calorie restriction, physical activity, vitamin D supplementation and antipsychotic drugs, may lead to energy metabolism modification through modulation of the endocannabinoidome signaling. The results of the experimental work show how the different studied conditions cause changes in the tissue levels of endocannabinoidome lipid mediator as well as in the expression of their receptors and metabolic enzymes, which may contribute to the observed changes in body fat mass and energy metabolism within the models. We conclude that the investigated conditions may cause changes in energy balance through alteration of the endocannabinoidome.

L'hydrolyse in vitro par la triglyceride lipase hepatique (tgl-h) des phosphatidylethanolamines (pe), des phosphatidylcholines (pc) et des triglycerides (tg) radiomarques portes par differentes sous-fractions de lipoproteines de haute densite (hdl) montre une meilleure reactivite des hdl2 par rapport aux hdl3 avec les trois substrats. Pour une meme sous-fraction, les tg et les pe sont de meilleurs substrats que les pc. Un enrichissement en cholesterol libre (cl) augmente la reactivite des hdl envers la tgl-h. Sur foie de rat perfuse, avec la tgl-h a la surface endotheliale, l'hydrolyse et la captation des tg sont superieures a celles des pe, qui sont superieures a celles des pc. Pour une meme classe de phospholipides, un acide gras insature en position 2 du glycerol augmente les taux d'hydrolyse comparativement aux especes disaturees. Les taux d'hydrolyse et de captation sont independants pour tous les phospholipides. La depletion de la tgl-h du foie diminue l'hydrolyse de tous les composes et la captation des tg, mais pas celle des phospholipides. Le role de l'activite phospholipase a1 de la tgl-h dans la captation hepatique du cholesterol hdl a ete etudiee par des hdl reconstituees avec des pc substrats ou non substrats de l'enzyme. Ces hdl reconstituees sont comparables aux hdl natives pour la taille, mobilite electrophoretique, composition chimique et immunoreactivite des apoproteines. La captation du cholesterol esterifie (ce) est 3 fois plus grande pour les particules substrats que pour les autres, alors que la captation du cholesterol libre est inchangee. La depletion en tgl-h diminue du tiers la captation du ce issu de particules substrats comparativement aux controles

La détermination des valeurs usuelles des constituants lipidiques chez 465 chèvres a permis de montrer que les concentrations des différents constituants sont davantage affectées par les conditions d'alimentation que par l'âge ou le sexe, sauf chez les nouveaux-nés qui sont en fait des monogastriques. Les lipoprotéines ont un profil voisin de celui des autres ruminants avec prédominance des HDL sur les autres fractions. Elles peuvent être fractionnées par électrophorèse, ultracentrifugation, et précipitation par le sulfate de dextran. Le fractionnement des apolipoprotéines par électrophorèse en milieu SDS a révélé des apolipoprotéines similaires à celles qui sont observées chez l'homme. Lors de la restriction hydrique ou alimentaire, les triglycérides restent inchangés alors que le cholestérol total et les phospholipides sont fortement abaissés. Parallèlement, les meilleurs indicateurs de ces restrictions ont été les corps cétoniques et le glucose plasmatiques dont les variations on été intenses, précoces et durables. Chez les chèvres de la zone d'endémie de fluorose au Maros, il y avait de même une légère diminution du cholestérol total et des phospholipides parallèle à une diminution des HDL.