Дисертації з теми "Récepteurs ionotropiques du glutamate"

Les récepteurs présynaptiques, c'est-à-dire localisés sur les terminaisons axoniques, sont idéalement placés pour influer sur la libération synaptique. Les récepteurs présynaptiques perméables au Ca2+, comme certains récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR), jouent potentiellement un rôle capital sur la transmission synaptique, car ils offrent une voie d’entrée au Ca2+ distincte des canaux calciques dépendants du potentiel. Nous avons cherché à mettre en évidence la présence d’iGluR présynaptiques dans les interneurones de la couche moléculaire du cervelet (MLI) en couplant des expériences d’électrophysiologie et d’imagerie calcique. Nous montrons que les MLI portent des récepteurs AMPA (AMPAR) perméables au Ca2+ sur leur axone. Ces récepteurs peuvent être activés de façon physiologique par un spillover de glutamate émanant des fibres parallèles. Leur activation provoque l’augmentation de la fréquence et de l’amplitude des courants miniatures enregistrés dans les MLI et déclenche une vidange des réserves calciques qui amplifie leur réponse. Des résultats préliminaires semblent indiquer l’existence de récepteurs NMDA (NMDAR) présynaptiques

Des récepteurs ionotropiques du glutamate sont déjà exprimés par des cellules immatures du système nerveux en voie de développement. Nous avons étudié les effets des agonistes et antagonistes de ces récepteurs sur des cellules dissociées de néopallium de rat en culture. Le blocage ou la stimulation des récepteurs du NMDA ne rnodifient la survie des cellules que s'ils sont effectués à un stade relativement avancé de la maturation in vitro. En revanche, des antagonistes compétitifs et non-compétitifs des- récepteurs AMPA/kai͏̈nate, appliqués dans un créneau temporel précis correspondant à un stade plus précoce, provoquent la mort de nombreuses cellules, principalement de neurones. La mort cellulaire est en grande partie de type apoptotique. Le nombre de cellules en prolifération est diminué. Ces effets peuvent être bloqués par la co-application d'un agoniste. Lorsque le traitement est administré plus tard, le taux de prolifération est augmenté et la mort cellulaire est diminuée. L'exposition au kai͏̈nate, même à haute dose, n'a aucun effet en termes de nombre de cellules si elle survient pendant les 4 premiers jours en culture. Cependant, ce type de traitement agit sur d'autres paramètres: elle diminue le nombre de cellules détectables par le marquage au cobalt. Contrairement au traitement précoce, I'exposition à un agoniste à des stades plus tardifs provoque une mort cellulaire rapide, plutôt de type nécrotique. Cet effet peut être bloqué parco-application d'un antagoniste. Le taux de prolifération n'est pas affecté. Ces résultats suggèrent que des cellules immatures du futur néocortex ont besoin d'un niveau approprié d'activation de leurs récepteurs AMPA/kai͏̈nate en fonction de leur stade de maturation.

Les récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluRs) sont les principaux médiateurs de la transmission excitatrice dans le système nerveux central (SNC) des Vertébrés. Il a longtemps été considéré que les réponses biologiques provoquées par les iGluRs étaient nécessairement liées au flux d’ions à travers leur canal, d’où l’appellation « ionotropique ». Toutefois de nombreuses données indiquent que plusieurs membres de cette classe de récepteurs peuvent provoquer des signalisations intracellulaires sans ouverture de leur canal. C’est le cas des récepteurs delta, classe comprenant deux membres (GluD1 et GluD2) et qui joue des rôles clé dans la formation des synapses et la régulation de la transmission synaptique par le biais de signalisations non ionotropiques. Toutefois les mécanismes moléculaires de fonctionnement et de signalisation des récepteurs GluD, ainsi que leur pharmacologie, restent mal compris à ce jour, par manque d’outils appropriés pour leur étude. Durant ma thèse, j’ai développé deux méthodes d’étude des récepteurs GluD1: (i) un mutant ouvert de façon constitutive permettant l’étude de GluD1 par électrophysiologie cellulaire classique, et (ii) une technique de fluorescence dite de ‘voltage-clamp fluorometry’ ou VCF pour détecter en temps réel des changements de conformation locaux au sein de GluD1. Ces outils offrent un moyen sans précédent d’étude de la pharmacologie et des mécanismes moléculaires de transduction du signal dans cette classe de récepteurs. J’ai ainsi pu caractériser et quantifier la sensibilité des récepteurs GluD1 à une série de ligands synthétiques et naturels
Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are the main mediators of excitatory transmission in the vertebrate central nervous system (CNS). It has long been considered that the biological responses elicited by iGluRs were necessarily related to the flow of ions through their channel, hence the name "ionotropic". However, many data indicate that several members of this class of receptors can induce intracellular signaling without opening their channel. This is the case of delta receptors, a class comprising two members (GluD1 and GluD2) which plays key roles in synapse formation and the regulation of synaptic transmission through non-ionotropic signaling. However, the molecular mechanisms of GluD receptor function and signaling, as well as their pharmacology, still remain poorly understood, due to a lack of appropriate tools for their study. During my thesis, I developed two methods to study GluD1 receptors: (i) a constitutively open mutant allowing the study of GluD1 by classical cell electrophysiology, and (ii) a fluorescence technique called 'voltage-clamp fluorometry' or VCF to detect in real time local conformational changes within GluD1. These tools offer an unprecedented means to study the pharmacology and molecular mechanisms of signal transduction in this class of receptors. I was thus able to characterize and quantify the sensitivity of GluD1 receptors to a series of synthetic and natural ligands

Dans une etude in vivo, les effets d'antagonistes des recepteurs ampa (nbqx et 2,3-benzodiazepines) ont ete analyses sur les reponses aux acides amines excitateurs (aae) et sur la transmission synaptique, au niveau des motoneurones abducens du rat adulte. Des electrodes a 7 canaux ont permis de combiner les enregistrements electrophysiologiques aux applications micro-ionophoretiques d'aae et d'antagonistes. Les antagonistes n'affectent pas le potentiel de membrane, la resistance d'entree et le potentiel d'action antidromique des motoneurones. Sous anesthesie a la ketamine, les reponses ampa et kainate sont toutes deux affectees par les 2,3-benzodiazepines. En revanche, sous anesthesie au pentobarbital, les 2,3-benzodiazepines inhibent les reponses ampa mais n'affectent pas les reponses kainate. Les reponses ampa et kainate sont inhibees par le nbqx dans les deux conditions d'anesthesie. Les antagonistes appliques par voie intraveineuse bloquent completement le potentiel post synaptique excitateur trigeminal aux doses 2 mg/kg. Ces resultats suggerent que, en presence de pentobarbital, le kainate agit sur des recepteurs insensibles aux 2,3-benzodiazepines. Ces sous-unites de recepteur kainate (glur#6#/#7) ont ete localisees dans le noyau abducens par immunohistochimie. Leur role reste a preciser car seul les recepteurs ampa sont impliques dans la transmission synaptique. Dans une etude in vitro, les effets de la noradrenaline (na) sur la reponse des neurones pyramidaux au nmda et au glutamate ont ete etudies dans le neocortex. Des enregistrements intracellulaires ont ete realises en presence de ttx et en l'absence d'ions mg#2#+. Certains agonistes et antagonistes selectifs des recepteurs noradrenergiques ont ete testes afin de determiner les recepteurs impliques dans la modulation des reponses nmda. La na potentialise ou inhibe les reponses nmda et glutamate, les 2 effets pouvant s'observer dans les memes neurones. Ces effets dependent de la concentration de na perfusee : a faible concentration, la na potentialise les reponses nmda alors qu'a fortes concentrations, l'effet est inhibiteur. Nous montrons que les recepteurs #1-noradrenergiques sont impliques dans la potentialisation des reponses nmda et que les recepteurs #2-noradrenergiques participent a l'inhibition.

Pour comprendre l'organisation synaptique et le fonctionnement du lobe antennaire de l'abeille (Apis mellifera), les récepteurs aux neurotransmetteurs présents au niveau de cette structure ont été caractérisés. En utilisant la technique de patch-clamp en mode cellule entière, sur des cellules en culture de lobe antennaire d'abeille, nous avons mis en évidence des récepteurs nicotiniques (nAChRs), des récepteurs GABA ionotropiques et des récepteurs glutamate ionotropiques perméables au chlore (GluCls). Nous avons comparé ces récepteurs présents sur les cellules de pupe et d'adulte. Un seul type de nAChR a été identifié sur les cellules de pupe et au moins deux types (I et II) sur les cellules d'adulte. Ainsi, nous avons mis en évidence au sein du lobe antennaire un système activateur qui utilise l'acétylcholine et deux systèmes inhibiteurs potentiels qui utiliseraient le GABA et le glutamate.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate ont fait l’objet d’une attention particulière ces dernières années au vu de leur intérêt dans de multiples aspects de la transmission glutamatergique. Leur expression étendue à travers le système nerveux central en fait des cibles thérapeutiques particulièrement prometteuses et de récentes études corroborent l’utilité des mGluR dans des troubles neurologiques ou psychiatriques tels que les maladies d’Alzheimer ou de Parkinson, l’anxiété, la dépression et la schizophrénie. C'est dans ce contexte, que nous nous sommes intéressés à la synthèse d’analogues du glutamate, ligands des mGluR. La première partie de ce travail a été consacrée à la construction du squelette de l’acide glutamique. L'approche développée est basée sur l’addition de b-énaminoesters chiraux sur des accepteurs de Michael a-substitués via une réaction de Michael asymétrique. Dans la deuxième partie, nous avons développé deux voies devant mener aux quatre diastéréoisomères de nos analogues. Les étapes-clés de notre approche font intervenir une cyclisation intramoléculaire puis l’ouverture de ces cycles
Metabotropic glutamate receptors have received considerable attention over the past decade in view of their relevance in multiple aspects of glutamatergic transmission. The widespread expression of mGluRs through the central nervous system makes these receptors particularly attractives drug targets, and recent studies validate the therapeutic utility of mGluR ligands in neurological and psychiatric disorders such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, anxiety, depression and schizophrenia. It is in this context that we were interested in the synthesis of glutamic acid analogues. The first part of this thesis describes the construction of the glutamic acid’s framework. The synthetic approach involves the asymmetric Michael addition of chiral b-enaminoesters to a-substituted Michael acceptors. In the second part, two synthetic pathways to the four diastereomers of our analogues are described. In this approach, the intramolecular cyclization and then the opening of the cycle are the key-steps

Le trafic intracellulaire des récepteurs aux neurotransmetteurs contrôle leur localisation et leur nombre à la surface des cellules, modulant ainsi l'activité neuronale. Le glutamate libéré au niveau des synapses du système nerveux central active entre autres des récepteurs métabotropiques, les mGluRs, couplés aux protéines G hétérométriques impliqués dans la modulation synaptique. Nous étudions le trafic intracellulaire de récepteurs mGluR5 étiquetés, après transfection dans des lignées cellulaires ou des neurones d'hippocampe de rat. Nous avons montré par des techniques de microscopie et de biochimie que 1) mGluR5 peut être exprimé à la membrane des axones et des dendrites 2) mGluR5 est stabilisé par une protéine cytosolique, Homer, dans des sous domaines membranaires 3) mGluR5 est couplé à la dynamine 3 par l'intermédiaire de Homer 4) mGluR5 est endocyté de façon constitutive, par une voie indépendante des puits recouverts de clathrine 5) mGluR5, après son endocytose, semble être recyclé ou dégradé selon le type cellulaire
Intracellular traffic of neurotransmitter's receptors controls their number and localization at the cell surface, thus modulates the neuronal activity. Synaptic glutamate activates, among others, metabotropic receptors coupled to G-proteins, the mGluRs. We study intracellular trafficking of tagged mGluR5, transfected in cell lines in hippocampal neurons. Using microscopy and biochemistry, we have shown that 1) mGluR5 is expressed in axons and dendrites 2) mGluR5 is stabilized by the cytosolic Homer protein in membrane microdomains 3) mGluR5 is indirectly bound to Dynamin 3 through Homer 4) mGluR5 is constitutively endocytosed by a non-clathrin-coated pits pathway 5) mGluR5 is recycled or degraded depending on the cell type

Les récepteurs kaïnates sont des récepteurs ionotropiques du glutamate impliqués dans la régulation de l'activité des réseaux neuronaux. Les récepteurs kaïnates peuvent être pré-synaptiques mais également péri-synaptiques. Les mécanismes qui distribuent ces récepteurs dans les sous-domaines des neurones sont peu documentés. Il existe différents variants d'épissage C-terminaux des sous-unités GluR5-7 des récepteurs kaïnates. Ce domaine cytosolique constitue un site de régulation de la distribution subcellulaire des récepteurs kaïnate. L'étude de la distribution de ces sous-unités par immunocytochimie et imagerie de fluorescence dans des neurones d'hippocampe en culture permet de mettre en évidence qur l'épissage alternatif et la composition en sous-unités déterminent l'adressage membranaire de ces récepteurs. Ces résultats soulignent le rôle essentiel de l'épissage alternatif dans la distribution subcellulaire des récepteurs kaïnate
Glutamate receptors of the kainate type (KA receptors) have recently emerged as key players in the modulation of neuronal network activity. The various roles of KA receptors critically depend on their precise subcellular localization in presynaptic, postsynaptic or extrasynaptic domains. Subcellular localization of KA receptors has been mainly inferred from electrophysiological studies with the help of selective pharmacological tools and KA receptor mutant mice. These studies highlight the diversity of subcellular localization for KA receptors. It is then important to understand the molecular mechanisms underlying the polarized trafficking of KA receptors in distinct neuronal domains. This thesis shed light on the trafficking and membrane delivery of KA receptor subunits isoforms

Chez les mammiferes quadrupedes, la contraction coordonnee des muscles de chacun des membres lors de la locomotion est expliquee par l'interaction entre quatre reseaux generateurs, localises au niveau des elargissements cervico-thoraciques et lombaires de la moelle epiniere. Les etudes realisees recemment sur des preparations isolees de moelle epiniere d'embryon de poulet et de rat nouveau-ne suggerent que les reseaux responsables du mouvement des membres posterieurs soient distribues a chaque niveau segmentaire spinal de la region lombo-sacree, rappelant le modele d'organisation etabli chez la lamproie. Notre travail a pour but de fournir des informations concernant la neuromodulation et l'organisation de ces reseaux a partir d'etudes electrophysiologiques realisees chez le lapin adulte in vivo et sur moelle epiniere isolee in vitro de souriceau. Chez le lapin adulte, les resultats que nous avons obtenus aussi bien par des approches pharmacologiques in vivo que par marquage immunohistochimique des recepteurs confortent l'idee d'une cooperation fonctionnelle des recepteurs nmda et non-nmda au niveau spinal dans le controle de l'activite des generateurs posterieurs de locomotion. Chez cette espece, une zone intermedio-mediane de la substance grise, caudalement situee dans les segments medullaires l7/s1, pourrait etre etroitement impliquee dans la production de l'activite locomotrice. En revanche, chez le souriceau, il semble que la potentialite de genese rythmique soit repartie dans toute la region lombo-sacree. En effet, nous avons mis en evidence la presence, au niveau de chaque hemisegment, de reseaux a neurotransmission excitatrice (nmda et non-nmda) responsables de la genese d'actitives motrices rythmiques. Des connexions bilaterales inhibitrices entre ces reseaux assureraient, a chaque niveau segmentaire, la production de patterns moteurs alternes (cpgs). L'affaiblissement des connexions intersegmentaires au cours du developpement s'accompagnerait d'un renforcement de ces capacites segmentaires de genese de patterns moteurs coordonnes. La poursuite de l'individualisation fonctionnelle des cpgs pourrait sous-tendre la haute variabilite de la locomotion adulte ainsi que les capacites d'apprentissage de la moelle epiniere chez des animaux ou des patients spino-leses.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGlu) du groupe III (mGlu4, 6, 7 et 8) sont des cibles bien validées in vitro pour leur caractère neuroprotecteur. Toutefois, le manque d'outils pharmacologiques spécifiques et performants limite l'exploitation du potentiel thérapeutique de ces récepteurs. La première partie de ce travail a porté sur la validation de ce potentiel dans des modèles animaux de maladies du système nerveux central (par exemple, anxiété et addiction) à l'aide d'un agoniste spécifique des mGlu du groupe III, et sur la démonstration de la capacité de cette molécule à traverser la barrière hémato-encéphalique. Dans un deuxième temps, une librairie de composés, issus d'un travail de chimie médicinale autour de ce ligand, a été créée en vue de rechercher des molécules plus affines et présentant une meilleure sélectivité pour les sous-types des récepteurs du groupe III. Cette librairie a été criblée à l'aide de tests fonctionnels, et c'est ainsi que le composé FP0429, premier agoniste préférentiel du sous-type mGlu4, a pu être identifié. Cette molécule originale permet de différencier les récepteurs mGlu4 et mGlu8, car elle est un agoniste total sur mGlu4 et très partiel sur mGlu8. Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous avons exploité le profil pharmacologique unique de FP0429 afin d'étudier les déterminants moléculaires et structuraux impliqués dans le mécanisme d'agonisme partiel des récepteurs mGlu. Une double approche de mutagenèse dirigée et de modélisation moléculaire a été utilisée, et a permis de proposer l'hypothèse d'un mécanisme d'agonisme partiel reposant sur la régulation de la fermeture du domaine extracellulaire des récepteurs mGlu.

Les recepteurs metabotropiques du glutamate (mglur) sont des recepteurs a sept domaines transmembranaires, couples aux proteines g. Ils sont classes en trois groupes en fonction de leur homologie de sequence, de leur pharmacologie et de leur voie de transduction. Les mglur du groupe i stimulent la phospholipase c (plc) alors que les mglur des groupes ii et iii inhibent l'adenylyl cyclase. Les mglur sont impliques dans de nombreuses pathologies du systeme nerveux central mais les molecules actives sur les mglur n'ont pas encore d'application therapeutique a cause de leur manque d'affinite et de specificite pour un sous type de mglur particulier. Trouver de nouvelles drogues de haute affinite et selectives d'un sous-type de mglur permettrait probablement de traiter certaines maladies neurodegeneratives comme la maladie de parkinson ou la maladie d'alzheimer. Nous avons developpe et optimise un test fonctionnel qui permet de coupler positivement tous les mglur a la plc. Nous avons utilise ce test fonctionnel pour caracteriser l'effet de drogues sur l'ensemble des mglurs clones. Cette caracterisation nous a permis d'emettre des hypotheses de travail pour developper de nouvelles molecules plus selectives des mglurs. Nous avons egalement utilise ce test fonctionnel pour caracteriser le profil pharmacologique du dernier mglur clone, mglur8. Nous montrons que son profil pharmacologique est tres proche d'un autre mglur du groupe iii, mglur4. Enfin, nous nous sommes interesses aux niveaux d'expression de proteines associees aux mglurs, les proteines homer, dans des modeles animaux de douleur.

Nous avons analyse, grace a la technique de patch-clamp, le controle des canaux calciques dependants du potentiel membranaire (vccs) par les recepteurs metabotropiques du glutamate (mglurs) dans les cellules granulaires du cervelet en culture. Dans ces cellules, la majeure partie du courant calcique (ca#2#+) global est due aux canaux de type l, q et r (26% chacun) alors que les canaux de type p et n representent une fraction moins importante. Les recepteurs mglur2/r3 inhibent les vccs de type l et n, alors que mglur1 active selectivement les canaux de type l. L'effet inhibiteur met en jeu une proteine g de type gi/go et le mecanisme de transduction n'implique aucun des seconds messagers classiques mobilises par les mglurs. L'effet activateur met en jeu une proteine g de type non gi/go et un mecanisme original impliquant les canaux ca#2#+ des compartiments calciques internes sensibles a la ryanodine. L'augmentation de la probabilite d'ouverture des canaux l suite a l'activation de mglur1 est maintenue apres excision du patch et inhibee par la ryanodine appliquee sur la face cytoplasmique du canal. La ryanodine n'a aucun effet sur un canal excise qui n'a pas ete prealablement stimule par mglur1. Les * recepteurs a la ryanodine intracellulaires et les canaux ca#2#+ de type l membranaires. Ce couplage pourrait intervenir dans la depression a long terme, un phenomene de plasticite synaptique cerebelleuse qui necessite a la fois l'activation de mglur1 et l'augmentation de ca#2#+ interne. *recepteurs mglur1 induisent une interaction fonctionnelle tres etroite entre les

Le glutamate (glu) est le neurotransmetteur excitateur majeur du systeme nerveux central. Le glu active deux types de recepteurs: des recepteurs-canaux et des recepteurs (mglur) couples a des effecteurs intracellulaires par l'intermediaire de proteines g. Les recepteurs du glu sont responsables de la transmission excitatrice rapide de l'information nerveuse et sont impliques dans nombre de fonctions physiologiques, telles que la plasticite synaptique, le developpement du systeme nerveux ou des processus neurotoxiques et neurodegeneratifs. Depuis 1991, sept mglur ont ete isoles et classes en fonction de leur sensibilite aux agonistes, de leur sequence nucleotidique et de leur modes de couplage aux effecteurs intracellulaires definis dans des lignees cellulaires. Ainsi, mglur1/5 sont couples positivement a la phospholipase c (plc), les autres etant couples negativement a l'adenylyl cyclase (ac). Le but de notre travail etait l'etude de la pharmacologie et des mecanismes de transduction des mglur. Nous avons montre, pour la premiere fois, que le glu activait des recepteurs couples negativement et directement a l'ac dans des neurones. Par des techniques pharmacologiques et par l'analyse de l'expression des arnm codant les mglur, nous avons determine, dans diverses populations neuronales et gliales, l'implication des mglur2/3/4 dans les effets inhibiteurs du glu sur l'activite de l'ac. Nous avons ensuite mis en evidence des differences fonctionnelles entre les variants de mglur1 (couple a la plc) generes par epissage alternatif et dont les domaines c-terminaux sont soit longs (mglur1a) soit courts (mglur1b/c). Nous avons notamment mis en evidence une activite constitutive de mglur1a en absence d'agoniste. L'analyse des differences fonctionnelles des variants de mglur1 et de recepteurs mglur1a tronques de portions plus ou moins longues de leur domaine c-terminal, nous a permis de proposer un modele rendant compte de la relation structure-fonction au sein du long domaine c-terminal de mglur1a

Le récepteur du glutamate de type NMDA (NMDAR) est l'un des deux principaux récepteurs glutamatergiques, et donc un des principaux mediateurs de la neurotransmission excitatrice dans le système nerveux central. Les NMDARs sont impliqués dans la plasticité synaptique, le corrélat cellulaire de l'apprentissage et de la mémoire. Actuellement, la technologie de pointe permettant l'investigation des propriétés des récepteurs synaptiques dans leur environnement natif est la photolyse de composés chimiques cagés, mais cet outil a des limitations concernant sa capacité à stimuler des NMDAR de manière très précise spatiellement et temporellement, à cause de la limite de diffraction de la lumière, qui définit le volume minimal de décageage duquel les molécules diffusent, et à cause de la nature irréversible de la réaction de décageage. En revanche, les molécules photoréversibles peuvent être activées et désactivées rapidement et de manière repétée, ce qui permet d'éviter les limitations de la diffusion afin d'accomplir une stimulation plus précise au niveau spatial et temporel. J'ai établi une collaboration autour du premier composé chimique photoréversible spécifique pour les NMDAR, et de plus, le premier qui est inactif dans son état le plus stable : l'azobenzene triazole glutamate (ATG). J'ai caracterisé ce composé chimique par activation un-photon et bi-photon, par l'application en bain et l'application locale, et dans plusieurs paradigmes expérimentaux. Dans ma thèse, je décris le fonctionnement de ce composé chimique, ses avantages et ses inconvénients, et certaines modifications à considérer pour l'optimisation future des composés chimiques photoréversibles
The NMDA-type glutamate receptor (NMDAR) is one of two principal glutamate receptors, the main mediators of excitatory neurotransmission in the central nervous system. NMDARs are critically implicated in synaptic plasticity, the cellular correlate of learning and memory. Although significant advances have been made in understanding the behavior of this receptor, many questions remain. Currently, the state-of-the-art technology for investigating receptor properties in the native environment is caged compounds, which are restricted in their ability to precisely control the spatial and temporal activation of NMDAR due to the diffraction limit of light, which defines the minimum volume of uncaging from whence uncaging molecules diffuse, and the irreversible nature of uncaging. Photoswitchable molecules, by contrast, can rapidly and repeatedly be switched on and off, circumventing the diffusion limitation to permit fine spatial and temporal control of receptor activation. With this in mind, I formed a collaboration with a team of chemists to characterize a novel compound, azobenzene triazole glutamate (ATG), the first photoswitchable compound specific for NMDAR and biologically inert in its thermally stable state. Such a tool holds great promise for finely probing receptor behavior in its native environment. I characterized this compound using one- and two-photon activation, through bath and local application, and through a variety of different experimental paradigms. I demonstrate in detail the properties of this novel compound, propose potential applications of ATG as a novel tool, and suggest possible modifications to optimize future photoswitchable compound design

Les récepteurs kaïnate (KAR) sont des récepteurs ionotropiques du glutamate impliqués dans la régulation de la transmission synaptique et de l'excitabilité neuronale. Ils sont exprimés au niveau des synapses entre les fibres moussues du gyrus dentelé et les neurones pyramidaux de la région CA3 de l'hippocampe (synapse FM-CA3) dans les domaines pré- et post-synaptiques. En étudiant leurs rôles physiologiques dans le transfert de l'information par ces synapses dans l'hippocampe de souris, nous avons montré que les KAR post-synaptiques agissent de deux manières : par une action ionotropique directe impliquant GluR6 et par un mécanisme indirect métabotropique via un couplage à des protéines G, suite à la liaison du glutamate à KA2. Ceci inhibe transitoirement les courants à l'origine de l'hyperpolarisation lente après activité (IsAHP) et augmente l'excitabilité neuronale. Nous avons aussi pu montrer, en utilisant des souris transgéniques, que les KAR pré- et post-synaptiques agissent de concert pour amplifier les potentiels post-synaptiques excitateurs unitaires, permettant le déclenchement des potentiels d'action (PA) et améliorant leur précision temporelle pour des fréquences entre 3 et 50 Hz. La modulation de IsAHP par KA2 augmente le nombre de PA durant des trains prolongés de stimulations et les KAR permettent l'induction de la potentialisation à long terme des synapses associatives/commissurales. Les rôles des KAR mis en évidence par des stimuli contrôlés sont conservés durant des patrons de décharges physiologiques des fibres moussues afférentes. En conclusion, les KAR agissent comme des amplificateurs de la transmission synaptique FM-CA3
Kainate receptors (KAR) are ionotropic glutamate receptors implicated in the regulation of synaptic transmission and neuronal excitability. At the mossy fiber (Mf) synapse, KARs can be expressed both pre and postsynaptically. In this study, we examined physiological role of KARs in information transfer at the Mf-CA3 pyramidal cell synapse in the mouse hippocampus. We show that KARs can operate in dual mode, by a direct ionotropic action via GluR6, and an indirect G-protein coupled mechanism requiring the binding of glutamate to KA2, to inhibit the slow afterhyperpolarization (IsAHP), hence enhancing neuronal excitability. Using mice deficient for the various KAR subunits, we show that postsynaptic KARs shape the waveform of unitary EPSPs, and pre and postsynaptic KARs act together to amplify unitary EPSPs, triggering spike discharge under conditions of sustained mossy fiber activity. KARs improve timing precision within a frequency range of 3 to 50 Hz and modulation of IsAHP by KA2 facilitates spike discharge in prolonged stimulus trains. KARs are permissive to the induction of LTP at the associative/commissural input. Physiological patterns of afferent input reproduce the output obtained with controlled stimulus inputs. Hence KARs act as amplifiers of synaptic transmission, to enhance the transfer of information at the Mf-CA3 pyramidal cell synapse

Les récepteurs de type kaïnate (rKA) appartiennent, avec les récepteurs de type NMDA (rNMDA) et les recepteurs de type AMPA (rAMPA), à la famille des récepteurs canaux glutamatergiques (iGluR). Les propriétés fonctionelles des rKA contenant la sous-unité GluK3 en font des récepteurs tout à fait singuliers. Une étude réalisée dans le laboratoire a montré que la faible sensibilité de ces récepteurs au glutamate est liée à une entrée très rapide dans l’état désensibilisé et que la fonction de ces récepteurs pourrait être amplifiée par des modulateurs endogènes.Parmi les modulateurs potentiels de la fonction des rKA pré-synaptiques, nous avons choisi d’étudier le zinc, en raison de sa concentration importante dans les vésicules des terminaisons des axones des cellules granulaires du gyrus denté (fibres moussues). En dépit du rôle proposé des rKA contenant la sous unité GluK3 dans la régulation pré-synaptique aux synapses MF-CA3, la modulation de ces récepteurs par le zinc n’a jamais été étudiée.Grâce à l’enregistrement électrophysiologique des courants GluK3 exprimés dans les cellules HEK-293, nous avons montré que le zinc facilite les courants des récepteurs contenant la sous-unité GluK3, activés par le glutamate. L’analyse des cinétiques, ainsi que la modélisation, montrent que l’effet facilitateur du zinc est dû à la réduction de l’entrée dans l’état désensibilisé des récepteurs GluK3. Grâce à la mutagénèse dirigée et l’étude cristallographique, nous avons pu déterminer le site de liaison du zinc, constitué de l’aspartate 759, de l’histidine 762 et de l’aspartate 730, et localisé dans l’interface de dimérisation du domaine de liaison de l’agoniste (LBD).Cette étude décrit pour la première fois un nouveau site de modulation positive de la fonction des rKA
Glutamate released at excitatory synapses acts on ligand-gated ionotropic receptors which fall into three classes: NMDA, AMPA and kainate receptors.At hippocampal mossy fiber synapses onto CA3 pyramidal cells, KARs are present both at the pre- and postsynaptic levels. Postsynaptic KARs are composed of the GluK2, GluK4 and GluK5 subunits, whereas presynaptic KARs are thought to comprise the GluK2 and GluK3 subunits. The functional properties of GluK3 (and GluK2/GluK3) receptors set it apart from the other ionotropic glutamate receptors. In particular, its sensitivity to glutamate is the lowest of all known ionotropic glutamate receptors, due in large part to fast desensitization of receptors with one or two bound glutamate molecules. The low agonist sensitivity of this receptor raises questions about its relevance for synaptic function. Therefore, it is possible that endogenous modulators may potentiate its function.Among potential endogenous modulators of KAR function, we chose to address the role of zinc, because of the large amounts contained in mossy fiber terminals. Zinc is thought to be accumulated into synaptic vesicles, and is co-released with glutamate in the extracellular milieu during neuronal activity. Zinc has been reported to inhibit most of native and recombinant KARs. Despite the proposed role of at hippocampal mossy fiber synapses, although modulation of GluK3-containing KARs by zinc has not yet been addressed.In this study, we show that zinc greatly potentiates recombinant GluK3 receptor currents evoked by glutamate. Zinc markedly slows receptor desensitization and increases apparent affinity for glutamate. Crystallographic studies and analysis of chimeric GluK2/GluK3 KARs and of GluK3 bearing selected point mutations, allowed us to identify the zinc binding domain defined by D759, H762, Q756 and D730, and localized in a region forming the interface between two GluK3 subunits in an LBD dimer assembly. Based on these structure-function studies and on modeling of KAR activity, we show that zinc plays a very distinct role on GluK3-KARs by stabilizing the interaction between dimers of LBD thereby reducing desensitization.Given the proposed localization of GluK3 close to zinc containing synaptic vesicles, zinc may be an endogenous allosteric modulator for native GluK3-KARs, and its binding site a new pharmacological target

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Il est responsable de la majorité des transmissions synaptiques. En revanche, cet acide aminé naturel est aussi impliqué dans de nombreuses neuropathologies notamment en cas de surconcentration au niveau des synapses. Les récepteurs métabotropiques du glutamate, capables de moduler la transmission synaptique, constituent des cibles thérapeutiques prometteuses. Ces récepteurs sont divisés en trois groupes et notre laboratoire s’est focalisé sur ceux du groupe III et particulièrement le sous-type 4 qui présente des caractéristiques intéressantes dans le traitement symptomatique de la douleur et de la maladie de Parkinson. Le manque d’outils pharmacologiques de ce récepteur nous a poussé à synthétiser de nouveaux agonistes orthostériques à partir du composé référence, le LSP4-2022. Cette molécule est issue de nombreuses optimisations chimiques du (S)-PCEP provenant lui d’un screening virtuel. Durant ces trois années de doctorat, nous avons pu peaufiner la relation structure-activité autour du LSP4-2022 en synthétisant des nouveaux analogues fluorés et hétérocycliques. En parallèle, une seconde étude nous a permis d’attribuer la configuration des deux diastéréomères constituants tous les composés testés à ce jour
Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system. It is responsible of the majority of synaptic transmissions. In contrast, this natural amino acid is also involved in numerous neuropathologies and particularly in case of glutamate overconcentration in the synapse. Metabotropic glutamate receptors, that can modulate synaptic transmission, thus constitute promising therapeutic targets. These receptors are divided in three groups and our laboratory has been focused in group III and especially subtypes 4 which own interested properties in symptomatic treatment of pain and Parkinson Disease. The lack of pharmacological tools targeting this receptor prompts us to synthesize novel orthosteric agonist from the hit compound LSP4-2022. This molecule was obtained after several chemical optimizations from (S)-PCEP discovered from virtual screening. During my Ph.D., we could refine the structure-activity relationship of LSP4-2022 synthesizing new fluorinated and heterocyclic derivatives. Besides, a second study was carried out to identify the configuration of the two diastereomers which form tested compounds

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui constituent près d'1% du génôme humain. Ils disposent de sept segments transmembranaires, mais définissent aussi une nouvelle famille de RCPG, la famille 3, distincte des familles 1 et 2 des récepteurs de la rhodopsine ou du glucagon. Les mGluR, qui sont au nombre de huit chez l' homme, présentent en effet quelques singularités. Ces protéines possèdent en particulier un large domaine extracellulaire dans lequel se fixe leur ligand, le glutamate. Grâce à de faibles homologies de séquences identifiées entre ce domaine et des protéines périplasmiques bactériennes, LIVBP, LBP (Leucine /Isoleucine /Valine Binding Protein et Leucine Binding Protein), un modèle de ce domaine a donc été construit par modélisation par homologie et une caractérisation plus précise des sites de liaison des mGluR a été réalisée. .
Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) belong to the G-Protein-Coupled-Receptors (GPCR) superfamily that constitute about 1% of human genome. They own seven transmembranar domains, but are distinct from GPCRs of family 1 (rhodopsin-like receptor family) or family 2 (glucagon-like receptor family). In fact, the eight human mGluRs form a new GPCR family , family 3 and display a few singularities. For example, these proteins possess a large extracellular domain, which binds the natural ligand glutamate. According to low sequence homologies detected between this domain and bacterial periplasmic proteins, LIVBP, LBP (Leucine/Isoleucine/Valine Binding Protein and Leucine Binding Protein), a structural model of this domain has been built by homology modeling and the glutamate binding site of mGluRs has been identified. Structurally, this domain folds into two lobes that open and close as a clamshell. Functionnally, this study led us to conclude that the the closure of the two lobes, which is stabilized by glutamate fixation, is necessary for mGluR activity. .

Dans le système nerveux central, les récepteurs de type N-methyl-D-aspartate (NMDARs) joue un rôle majeur dans les processus de plasticité synaptique liés à la mémoire et à l’apprentissage mais aussi dans la mort neuronale observée au cours d’une ischémie cérébrale ou dans les maladies neurodégénératives. Au cours de cette étude, nous nous sommes intéressés aux conséquences de l’activation sélective des populations synaptiques ou extrasynaptique de ces NMDARs sur différentes caractéristiques de l’excitotoxicité. Nos résultas indiquent que si les NMDARs peuvent encore être considérés comme un vecteur de mort neuronale, ce sont seulement les récepteurs localisés à l’extérieur de la synapse qui déclenchent des mécanismes délétères conduisant à la mort neuronale. Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), le dysfonctionnement des synapses est particulièrement corrélé avec les déficits cognitifs qui caractérisent cette maladie. La production anormale de peptide β-amyloïde (Aβ) semble être impliquée au cours de la pathogenèse de la maladie toutefois les effets du peptide Aβ sur la transmission synaptique reste à préciser. Au cours de cette étude, nous avons montré que l’application de faibles concentrations d’oligomères d’Aβ provoquait une altération rapide de la structure des épines dendritiques sur des neurones corticaux. Ces modifications sont associées à une diminution de la réponse neuronale induite par la stimulation de NMDARs synaptiques et une augmentation de la réponse de NMDARs extrasynaptiques. L’ensemble de ces données met en évidence un mécanisme cellulaire pouvant être à l’origine des effets du peptide Aβ sur la transmission synaptique au cours de la MA
In the mature nervous system, N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) are critical for synaptic plasticity that may underlie learning and memory. On another hand, excessive activation of NMDARs has been described as a common source of neuronal damage during stroke or chronic neurodegenerative diseases. In the present study, we investigated the consequence of selective activation of synaptic or extrasynaptic NMDARs on several features of excitotoxicity: calcium overload, mitochondrial function, morphological alteration and neuronal death. The results indicate that if NMDARs can still be consider as a major contributor for excitotoxicity, only those located extrasynaptically do induce the cellular disruption leading to neuronal death. In Alzheimer’s disease (AD), an age-dependent neurodegenerative disease, the loss and/or the dysfunction of synapses strongly correlates with the progressive cognitive decline that characterizes this pathology. Abnormal production of amyloid beta (Aβ) peptides is believed to exert a causative role in the pathophysiolology of the disease but the mechanism by which Aβ affects synaptic plasticity remains unclear. Here, we show that exposure to low concentrations of Aβ oligomers induces a rapid structural modification in the dendritic spines of cortical neurons. These modifications induce functional alterations of the excitatory synapses associated with reduction of the synaptic NMDARs responses and increased extrasynaptic NMDARs responses. Taken together, these results revealed a new molecular mechanism that may underlie early synaptic dysfunction induced by Aβ in AD

Le récepteur du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) est un transducteur clef dans la physiologie du système nerveux et dans nombre de ses pathologies, selon qu’il est localisé à la synapse ou en position extra-synaptique respectivement. Son activité est sous le contrôle étroit du ‘site-glycine’, dont l’activation est gouvernée par la disponibilité en coagoniste. Pourtant, on ignore encore largement les règles qui régissent cette étape limitante de l’activation des NMDARs in situ. Par ailleurs, l’ensemble des onnaissances actuelles suggère que les astrocytes pourraient contrôler les NMDARs dans le contexte des interactions entre cellules gliales et neurones, en particulier via la libération du gliotransmetteur D-sérine. Le principal objectif de ce travail de thèse a été de comprendre les modalités du contrôle endogène des NMDARs par leur site co-agoniste, dans la région CA1 de l’hippocampe. Nous avons porté notre attention, avant tout, sur les acteurs de ce contrôle : la glycine et la D-sérine, qui sont les ligands endogènes du site-co-agoniste. Nous nous sommes intéressés à leur contribution respective dans le contrôle des NMDARs, aux dynamiques de ce contrôle en fonction de l’activité neuronale, à ses variations en fonction de la localisation des NMDARs, ainsi qu’à ses modifications développementales. Nous montrons par des approches d’électrophysiologie que la D-sérine, et non la glycine, est le co-agoniste endogène des NMDARs à la synapse CA3-CA1 chez l’adulte. Elle est délivrée par les prolongements astrocytaires environnants, d’une manière qui est influencée par l’activité synaptique. Sa libération répond à un mécanisme vésiculaire et est dépendante de la signalisation calcique intra-astrocytaire. De cette manière, les astrocytes exercent un contrôle étroit et dynamique des NMDARs à l’état basal et au cours de phénomènes de plasticité synaptique. En contre partie, à l’inverse de leurs homologues localisés à la synapse, les NMDARs extrasynaptiques sont contrôlés par la glycine à l’âge adulte. Cette compartimentation spatiale est dictée par une disponibilité différentielle des deux co-agonistes aux différents sites. Elle est également favorisée par une composition en sous-unités des NMDARs synaptiques et extra-synaptiques différente qui leur confère une affinité distincte pour la glycine et la D-sérine. Enfin, le contrôle des NMDARs par la D-sérine astrocytaire observé à l’âge adulte n’est pas opérationnel à la naissance. En effet, il ne se met en place qu’au cours du premier mois post-natal, de façon concomitante au changement de composition en sous-unités des NMDARs
N-methyl D-aspartate receptors (NMDARs) are central to many aspects of brain physiology and pathology, which they impact differently depending on their synaptic or extrasynaptic location, respectively. In addition to glutamate, they are gated by the necessary binding of a co-agonist on the so-called ‘glycine-binding site’. However, very little is known about the rules that govern the control of NMDARs through this site, in situ. Evidence now suggests that astrocytes could play a critical role in controlling NMDARs activity, in particular through the release of the gliotransmitter D-serine. In the present work, we aimed at understanding how NMDARs are endogenously controlled through their co-agonist binding site, in the CA1 region of rat hippocampus. We primarily focused on the role of two endogenous ligands of this site: glycine and D-serine. We investigated their relative contribution in the control of NMDARs at the different subcellular locations, the dynamics of such control according to synaptic activity, as well as possible changes during post-natal development. Using elecrophysiological approaches, we demonstrate that NMDARs are gated by Dserine, but not glycine, at CA3-CA1 synapses in adults. D-serine is supplied at least in part by surrounding astrocytes in an activity-dependant manner. Its release occurs in response to calcium signalling within the astrocyte and in a vesicular way. Correspondingly, we found astrocytic supply of D-serine to be essential for NMDARs-dependant functions such as synaptic plasticity. In contrast with their synaptic counterparts, extrasynaptic NMDARs are gated by endogenous glycine and not by D-serine. We provide evidence that this compartmentation relies on the differential availability of the two co-agonists at synaptic and extrasynaptic sites. Besides, due to differences in their subunit composition, synaptic and extrasynaptic NMDARs may have preferential affinity for D-serine and glycine respectively. Finally, we show that the control of the NMDAR co-agonist site is developmentally regulated. Early after birth, glycine is the endogenous co-agonist of synaptic NMDARs. The control exerted by D-serine only progressively appears during the first post-natal month, as the switch in NMDARs subunit composition occurs, suggesting a maturation of cellular interactions at the tripartite synapse

Dans certaines aires cérébrales, l’action synergique du glutamate et de la dopamine est nécessaire pour induire et maintenir la plasticité synaptique. Un dialogue fonctionnel entre le récepteur métabotropique du glutamate mGlu5 et le récepteur de la dopamine D1 a été mise en évidence. Par ailleurs, de nombreuses études ont démontré que les récepteurs couplés aux protéines G ont la capacité de former des hétéromères créant ainsi de nouvelles entités fonctionnelles. En s’appuyant sur l’hypothèse d’une hétéromérisation des récepteurs, l’objectif de ce projet de thèse était d’étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent une synergie fonctionnelle entre les récepteurs mGlu5 et D1. Dans la première partie de ce travail, j’ai caractérisé les bénéfices de la Nanoluciférase, une luciférase très lumineuse, pour améliorer la technique de BRET en imagerie (Bioluminescence Resonance Energy Transfer imaging) qui permet d’étudier la dynamique des interactions entre protéines dans les cellules vivantes. Les bénéfices mis en évidence en termes de résolution spatio-temporelle, de stabilité et de sensibilité du signal ont été exploités pour la suite de ce projet. Dans la seconde partie de ce travail, les améliorations techniques mentionnées ci-dessus ont permis de mettre en évidence pour la première fois des hétéromères mGlu5/D1 dans des neurones en culture. En outre, nous avons montré que la co-expression des récepteurs mGlu5 et D1 en système hétérologue favorise la signalisation calcique, d’une part en augmentant l'activité constitutive de mGlu5 et, d’autre part, en créant une voie de libération du calcium intracellulaire atypique induite par l'agoniste D1.Ces résultats apportent de nouveaux éléments de compréhension des bases moléculaires du dialogue fonctionnel glutamate/dopamine dans le contrôle de la communication neuronale en conditions physiologiques et ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de moduler sélectivement la fonction des hétéromères
In some specific brain areas, synergism between glutamate and dopamine transmission is required to induce synaptic plasticity. Metabotropic glutamate receptor mGlu5 and dopamine receptor D1 are both known to control synaptic plasticity. Moreover, multiple lines of evidence converge toward the ability of G-protein coupled receptors to form dynamic heteromers thereby creating new entities with unique properties. Focusing on the hypothesis of receptor heteromerization, my PhD project aimed at investigating the molecular mechanisms underlying a functional interplay between mGlu5 and D1 receptors.To address this issue, a first part of this work consisted in improving single-cell Bioluminescent Resonance Energy Transfer (BRET) imaging, a technology enabling to study real time protein-protein interaction dynamics in living cells. Using the Nanoluciferase, an extremely bright luciferase, we characterized a faster and higher resolution single-cell BRET imaging technique with unprecedented performance in terms of temporal and spatial resolution, duration of signal stability and signal sensitivity. In the second part of this project, we showed that mGlu5 and D1 can form heteromers in heterologous expression system. The above-mentioned improvements of single-cell BRET imaging technique allowed to evidence the occurrence and the dynamics of mGlu5/D1 heteromers in cultured primary neurons. Furthermore, our results showed that the co-expression of mGlu5 and D1 receptors modifies single receptor properties to favor calcium signaling by increasing mGlu5 constitutive activity and creating a D1 agonist-induced activation of Ca2+ release from intracellular stores.These findings advance our knowledge about the molecular basis of the glutamate/dopamine functional dialogue to control neuronal communication in physiological conditions. Further investigation will help the dissection of the mGlu5/D1 heteromer specific signaling pathway with the hope of defining new therapeutics that may selectively modulate heteromer function and thus bypass undesirable side effects

Nous avons mis en evidence et caracterise un agoniste specifique du recepteur metabotropique du glutamate, le t-acpd. Cet outil nous a permis de montrer que l'activation de ce recepteur entraine la formation d'insp3 et la mobilisation du calcium intracellulaire. Il y a activation de la proteine kinase c qui desensibilise en retour le recepteur. Nous avons decouvert et caracterise un second type de recepteur negativement coule a l'adenylate cyclase. Nous avons etudie les interactions complexes entre recepteurs au nmda et un messager intercellulaire produit par l'activation de ce recepteur. Des drogues produisant no ont permis de definir le monoxyde d'azote (no). Deux nouveaux sites de regulation du recepteur nmda: un site sensible aux ions ferrocyanures et un site specifique a no, independant de mecanismes intracellulaires enzymatiques. Le role de telles interactions dans la plasticite synaptique est discute

Le glutamate (Glu) est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Ses analogues peuvent se comporter comme des ligands sélectifs et sont intéressants pour élucider le rôle spécifique des différents types de transporteurs ou de récepteurs du système glutamatergique. Ce travail avait pour objectif de synthétiser de nouveaux analogues fonctionnalisés du Glu en utilisant les aminotransférases en tant que biocatalyseurs de façon à convertir les analogues de l'acide 2-oxoglutarique (KG) en analogues du Glu. La plupart des analogues du KG se sont avéré substrats de l'Aspartate Aminotransférase d'E. Coli (AspAT) permettant la préparation stéréosélective des analogues du Glu correspondants. Une étude de modélisation moléculaire a été réalisée afin d'expliquer la spécificité de substrat de l'AspAt. Quatre analogues se sont comportés comme des ligands sélectifs et offrent des perspectives pour le développement de nouveaux analogues actifs dans le système glutamatergique

Les récepteurs ionotropiques du glutamate sont responsables de la vaste majorité de la neurotransmission excitatrice rapide dans le système nerveux central. Parmi eux, les récepteurs NMDA (rNMDA) sont les médiateurs de la plasticité synaptique, fondement cellulaire des processus d’apprentissage et de mémoire. Leurs dysfonctionnements sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques comme les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, l’épilepsie et la schizophrénie. Les rNMDA forment des complexes hétérotétramériques massifs (>500 kDa) dotés de propriétés allostériques uniques grâce à un ensemble de 8 domaines extracellulaires bilobés organisé en deux strates superposées : la couche de domaines N-terminaux (NTD) et la couche de domaines de liaison de l’agoniste (ABD). Malgré un nombre croissant de structures complètes de rNMDA, le mécanisme de transduction permettant aux interactions entre ces domaines de contrôler l’activité du récepteur restait inconnu. En combinant analyse expérimentale et computationnelle, nous montrons qu’un mouvement de roulis à l’interface entre les deux dimères de la couche d’ABD est un déterminant clé du processus d’activation et de modulation des rNMDA. Cette rotation des deux dimères d’ABD constitue un commutateur conformationnel qui règle l’ouverture du canal en fonction de la conformation des NTD situés à l’opposé. Ce travail révèle comment des changements conformationnels concertés entre couches de domaines gouvernent l’activité des rNMDA. Il illumine notre compréhension d’un récepteur synaptique majeur du système nerveux central et ouvre la voie à la conception de nouveaux agents pharmacologiques ciblant le mécanisme allostérique élucidé
Ionotropic glutamate receptors are responsible for the vast majority of fast excitatory neurotransmission in the central nervous system. Among them, NMDA receptors (NMDARs) are key mediators of synaptic plasticity, which is considered as the cellular basis of learning and memory. NMDAR dysfunction is implicated in numerous neurological and psychiatric brain disorders such as Alzheimer and Parkinson’s disease, epilepsy and schizophrenia. NMDAR form massive hetero tetrameric complexes (>500 kDa) endowed with unique allosteric capacity provided by a cluster of eight extracellular clamshell-like domains arranged as two superimposed layers: the Nterminal domain (NTD) layer and the agonist binding domain (ABD) layer. Despite an increasing number of full-length NMDAR structures, the transduction mechanism by which these domains interact in an intact receptor to control its activity remained poorly understood. Combining experimental and in silico analysis, we identify a rolling motion at an interface between the two constitute dimers in the ABD layer as a key determinant in NMDAR activation and modulation pathways. This rotation of the two ABD dimers acts as a conformational switch that tunes channel opening depending on the conformation of the membrane-distal NTD layer. This work unveils how NMDAR domains move and operate in a concerted manner to transduce conformational changes between layers and command receptor activity. It illuminates our understanding of a major synaptic receptor of the central nervous system and paves the way for the development of new pharmacological tools targeting the elucidated allosteric mechanism

Les récepteurs couplés aux protéines G (ou RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires (plus de 800 gènes chez l'homme) et sont la cible directe de près de 30% des médicaments. Contrairement au grand nombre de récepteurs, le nombre d'effecteurs identifiés à ce jour reste considérablement faible, alors que les réponses biologiques associées s'avèrent multiples et complexes. De nombreuses interactions fonctionnelles ont alors été identifiées et l'intégration du signal semble être l'évènement clé assurant la transduction des nombreux signaux extracellulaires pouvant arriver simultanément. Il a été suggéré que la formation de complexes protéiques et de plateformes de signalisation permettrait de contrôler la localisation et/ou la fonction des récepteurs et plus récemment, il a été proposé que la capacité des RCPG à s'associer en dimères et oligomères d'ordre supérieur à 2 permettrait également de moduler ou réguler leur fonctionnalité. Au cours de ma thèse, je me suis principalement intéressée à l'interaction fonctionnelle ayant lieu entre mGlu1a et GABAB dans les cellules de Purkinje. La co-activation du récepteur GABAB induit la potentialisation des réponses calciques induites par l'activation du récepteur mGlu1a. Des données suggéraient qu'il s'agissait d'une interaction fonctionnelle entre les voies de signalisation impliquées mais certains résultats suggèrent une interaction directe entre les deux récepteurs, soit une oligomérisation. Nous avons pu démontrer qu'une interaction physique entre mGlu1a et GABAB n'était pas nécessaire au « cross talk » fonctionnel observé. Ce dernier résulte d'un mécanisme plus général faisant intervenir les sous-unités βγ issues de l'activation de la protéine Gi/o activée par le récepteur GABAB. Cette interaction fonctionnelle a pu être généralisée à d'autres paires de récepteurs couplés à Gq et à Gi/o et l'intégration du signal dépend essentiellement des délais d'activation des récepteurs. Un tel mécanisme permet d'expliquer pourquoi des récepteurs faiblement couplés à Gq peuvent induire de fortes réponses calciques et peut se révéler un paramètre important dans l'analyse du « ligand trafficking » et de la notion d' « agonisme partiel »
G-protein coupled receptors (GPCRs) form the largest membrane receptor family and play critical roles in numerous physiological functions. In contrast to the large number of GPCRs, the number of effectors is considerably smaller, whereas the cellular biological responses are multiple and complex. So, an increasing number of functional interactions have been described and the integration of the signals might be a key event of the signal transduction. Recently, it has been evidenced that signals were generated and controlled through receptorbased signaling complexes, the components of these multi-protein complexes regulating the localization and function of the receptors but it has also been proposed that the ability of these receptors to form dimers or larger order oligomers may provide a way for signal integration. During my PhD, I have been mainly interested in the study of the functional « cross talk » (or regulation) ocurring between mGlu1a and GABAB in Purkinje cells. The co-activation of the GABAB receptor leads to the potentiation of the mGlu1a activation-induced calcium responses. Some results seem to indicate that this potentiation is due to a functional interaction between the implicated signaling pathways but some other data suggested a direct physical interaction between both receptors, that is to say oligomerization. We could demonstrate that a physical interaction between mGlu1a and GABAB was not necessary to the functional « cross talk » observed. This interaction results from a general mechanism in which the beta-gamma subunits produced by the Gi-coupled GABAB receptor enhance the mGlu receptor mediated Gq-response. Most importantly, this mechanism could be generalized to other Gi-Gq pairs of receptors, and the signal integration varies depending on the time delay between the activation of one and the other receptor. Such a mechanism help explaining specific properties of cell expressing two differents Gi and Gq coupled receptors activated by a single transmitter, as well as properties of GPCRs that are naturally coupled to both types of G-proteins

La maladie de Parkinson (MP) résulte de la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta qui innervent les ganglions de la base (GB), ensemble de structures souscorticales impliquées dans le contrôle moteur. Au cours de la MP, la perte des neurones dopaminergiques nigrostriés est associée à une hyperactivité réactionnelle des systèmes glutamatergiques au sein des GB. Cette observation a conduit à étudier des stratégies thérapeutiques alternatives au traitement classique à la L-DOPA, visant à réguler l’action du glutamate au sein des GB. Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluRs) appartenant au groupe III (sous-types mGlu4, mGlu6, mGlu7 et mGlu8) sont responsables d’effets inhibiteurs présynaptiques à la fois sur la transmission glutamatergique et GABAergique, mais leur implication fonctionnelle dans la régulation de l’activité des GB est encore peu connue. Nous avons donc étudié les effets comportementaux d’injections locales d’agonistes des récepteurs du groupe III, dans différentes structures des GB, sur les déficits induits par des lésions bilatérales des neurones dopaminergiques nigrostriés chez le rat. Afin de mesurer les déficits moteurs (relatifs à l’initiation du mouvement ou akinésie) et cognitifs (relatifs aux processus de préparation motrice) produits par les lésions dopaminergiques, nous avons utilisé une tâche conditionnée de temps de réaction simple, développée chez l’homme et adaptée aux rongeurs. Nos résultats montrent que l’activation préférentielle des mGlu4 dans le globus pallidus (GP), mais pas des autres sous-types de récepteurs, annule les déficits moteurs induits par la lésion des neurones dopaminergiques. Au contraire, l’activation des mGlu4/mGlu8 dans la substance noire pars réticulata (SNr) les aggrave et induit une akinésie chez les animaux témoins. Le blocage des récepteurs GABA-A dans ces deux structures produit des effets similaires suggérant une action préférentielle des agonistes mGlu4 sur la transmission GABAergique. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que l’administration chronique, par voie systémique, d’un agoniste non-sélectif des 4 soustypes de récepteurs, l’ACPT-I, réduit l’akinésie induite par la déplétion dopaminergique. Il induit, par ailleurs, une akinésie chez les animaux témoins. L’analyse des effets cellulaires induits par ce traitement révèle que ce composé réduit l’hyperactivité métabolique neuronale, observée dans le noyau sous-thalamique et la SNr après lésion dopaminergique. Au contraire, chez les animaux témoins, l’ACPT-I induit une augmentation d’activité métabolique au niveau de la SNr, suggérant que le niveau d’activité dopaminergique est déterminant dans les effets induits par l’activation des mGluRs du groupe III. Enfin, dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié l’interaction fonctionnelle entre les récepteurs mGlu et les récepteurs A2A de l’adénosine. En effet, le blocage pharmacologique des récepteurs A2A réduit les déficits moteurs observés dans différents modèles de la MP. Nos résultats montrent que la co-administration aiguë et chronique de doses sous-liminaires d’ACPT-I et de différents antagonistes des récepteurs A2A, réduit l’état cataleptique induit par l’halopéridol, antagoniste des récepteurs dopaminergiques. L’ensemble de ces résultats met donc en évidence l’implication des mGluRs du groupe III dans la régulation des processus moteurs impliquant les GB, et suggèrent que leurs interactions multiples avec d’autres systèmes conditionnent leur fonction
Parkinson’s disease (PD) results from the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta that innervate the basal ganglia (BG), a set of subcortical nuclei involved in motor control. In PD, the loss of nigrostriatal dopaminergic neurons is associated with glutamatergic overactivity in the BG. This led to propose therapeutic strategies alternative to L-DOPA treatment, that regulate glutamate action within the BG. Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) belonging to group III (mGlu4, mGlu6, mGlu7 et mGlu8) exert presynaptic inhibitory effects on glutamatergic and GABAergic neurotransmission, but the functional involvement of these receptors in regulating BG function is not well defined. We thus have studied the behavioural effects produced by group III receptors agonists, injected in various structures of the BG, to counteract the motor deficits induced by bilateral lesions of dopaminergic nigrostriatal neurons in rats. The motor (related to movement initiation or akinesia) and cognitive deficits (related to motor preparatory processes) induced by dopaminergic lesions were measured in a simple reaction time task developed for rodents and is similar to human tasks. Results show that preferential activation of mGlu4 into the globus pallidus, but not the other group III mGuRs subtypes, reverses the lesion-induced motor deficits. In contrast, activation of mGlu4/8 into the substantia nigra pars reticulata (SNr) enhances lesion-induced motor deficits and produces akinesia in control animals. Moreover, pharmacological blockade of GABA-A receptors into both structures produced similar effects than those observed after group III mGluRs activation, suggesting that a preferential action of these mGlu receptor ligands on GABAergic neurotransmission. In a second part of this work, we show that systemic chronic, but not acute, treatment with a non-subtype selective agonist of group III receptors, ACPT-I, alleviates motor deficits induced by dopaminergic lesions, and produces akinesia in control animals. Analysis of the cellular effects produced by this treatment show that ACPT-I reduces lesion-induced neuronal metabolic hyperactivity in the subthalamic nucleus and SNr. In contrast, in control animals, the same treatment increases metabolic activity in the SNr, thus suggesting that dopaminergic activity triggers group III mGluRs-induced effects. In the last part of this work, we have evaluated the functional interactions between these mGlu and adenosine A2A receptors. Indeed, pharmacological blockade of A2A receptors reduces motor deficits in various PD models. Results show that acute and chronic co-treatment with sub-threshold doses of ACPT-I and various A2A receptor antagonists counteract the cataleptic state induced by the dopaminergic receptor antagonist haloperidol. Altogether, these results demonstrate the involvement of group III mGluRs in regulating motor processes in BG, and suggest that these receptors interact with multiple systems that control their function

Les noyaux supraoptiques (NSO) de l’hypothalamus sont composés de neurones magnocellulaires (NMCs) synthétisant et sécrétant l’ocytocine (OT) ou la vasopressine (VP). L’OT est impliquée dans des fonctions de reproduction comme la parturition et la lactation, la VP quant à elle participe à l’homéostasie hydrominérale et vasculaire. La libération de VP et d’OT dans la neurohypophyse est contrôlée par l’activité électrique des NMCs, elle-même régulée par les principales afférences glutamatergiques et GABAergiques qu’ils reçoivent. Les récepteurs kaïnate (rKA) pré-synaptiques exercent une action modulatrice sur la libération de neurotransmetteur dans le système nerveux central (SNC). Cet effet peut basculer de facilitateur à inhibiteur en augmentant la concentration d’agonistes des rKA. Ils peuvent également être présents sur le compartiment post-synaptique et participer à la réponse synaptique. Nous avons démontré, pour la première fois que des rKA fonctionnels sont présents dans le NSO, à la fois sur les afférences GABAergiques et glutamatergiques mais également sur les NMCs eux-mêmes. Les rKA contenant la sous-unité GluR5 régulent différemment la transmission glutamatergique sur les neurones à OT et à VP. En effet, l’application d’agonistes exogènes pour ces récepteurs induit un effet diamétralement opposé sur ces neurones, un effet facilitateur sur les neurones à OT et inhibiteur sur les neurones à VP, dû à la présence de GluR5 uniquement sur ces derniers. En effet, l’activation de ce récepteur post-synaptique induit la libération d’un messager rétrograde, vraisemblablement la dynorphine, responsable de l’inhibition de la transmission glutamatergique. En ce qui concerne la régulation de la transmission GABAergique, nous avons pu démontrer que l’augmentation de glutamate ambiant générée par la rétraction des processus gliaux se produisant dans le NSO de rate allaitante était suffisante pour inverser l’effet des rKA de facilitateur à inhibiteur sur la libération de GABA. Cette inversion de l’effet des rKA est causée par une modification du mode d’action de ces récepteurs du type ionotropique au type métabotropique. Les résultats obtenus au cours de mes travaux de thèse montrent donc que les récepteurs kaïnate sont présents sur l’ensemble des sites de la synapse dans le NSO de l’hypothalamus de rats adultes. De plus, ces rKA régulent différemment les neurones à OT et les neurones à VP, ce qui suggère qu’ils pourraient jouer des rôles importants dans la régulation de leur activité et des processus physiologiques les impliquant
Magnocellular neuroendocrine cells (MNCs) from the supraoptic nucleus (SON) of the hypothalamus synthesize and release the hormones oxytocin (OT) and vasopressin (VP). OT is involved principally in reproductive functions such as parturition and lactation, whereas VP plays a key role in body fluid and cardiovascular homeostasis. The release of OT and VP from the neurohypophysis is controlled by the electrical activity of hypothalamic MNCs, which is itself regulated by GABAergic and glutamatergic synaptic inputs. Presynaptic kainate receptors (KARs) exert a modulatory action on transmitter release in different structures of the central nervous system. This effect can be switched from facilitation to inhibition by an increased concentration of KAR agonists. KAR can also be present postsynaptically where they were shown to participate to the synaptic response in some brain regions. We have demonstrated for the first time that functional KARs were present on GABAergic and glutamatergic inputs as well as on SON neurons. GluR5-containing KARs differentially regulate glutamatergic transmission on OT and VP neurons. Indeed, applications of exogenous agonists of GluR5 induced opposite effects, a facilitatory effect on OT neurons and an inhibitory effect on VP neurons, the latter resulting from an indirect action mediated by postsynaptic GluR5-containing KARs on VP neurons. Thus, activation of these receptors induced the release of a retrograde messenger, probably dynorphin, which in turn act presynaptically to inhibit glutamate release. Regarding the modulation of GABAergic transmission in the SON, we here showed that the increased levels of ambient glutamate associated with the physiological withdrawal of astrocytic processes occuring during lactation could modify the activity of presynaptic KARs. We demonstrated for the first time that a physiological astrocytic plasticity modifies the mode of action of presynaptic KARs from ionotropic to metabotropic, thereby inversing their coupling with GABA release from facilitation into inhibition. The results obtained during my PhD have thus showed that KARs are present both pre-and post-synaptically on adult MNCs. Moreover, KARs differentially regulate OT and VP neurons, which suggest that KARs could play key roles in the regulation of their activity and in physiological processes in which MNCs are involved

Les récepteurs NMDA (rNMDAs) sont des récepteurs-canaux membranaires activés par le glutamate, neurotransmetteur excitateur, et impliqués dans diverses formes de plasticité synaptique et pathologies. Ces hétérotétramères obligatoires opèrent en dimère-de-dimères, associant généralement deux sous-unités GluN1 et deux GluN2A-D. Déterminer l'arrangement spatial des sous-unités d'un rNMDA est essentiel à la compréhension des mécanismes régissant son fonctionnement et du rôle joué par les interfaces entre sous-unités et entre domaines, notamment N-terminal (NTD) et de liaison des agonistes (ABD). En combinant modélisation moléculaire, mutagenèse dirigée, biochimie sur cystéines et électrophysiologie, nous montrons que ces sous-unités s'arrangent selon un ordre alterné, avec les sous-unités identiques diamétralement opposées, et révélons l'existence d'une interface inter-dimère entre les ABDs GluN1. Nous avons aussi implémenté dans les ovocytes de Xénope une technique innovante consistant à incorporer un acide-aminé non-naturel photo-réactif (UAA) dans un rNMDA. Cette approche, basée sur l'expansion du code génétique, a permis de créer un rNMDA sensible à la lumière. L'introduction d'UAAs aux interfaces entre sous-unités GluN1 et GluN2, révèle le rôle joué par deux de ces interfaces: (1) entre les lobes supérieurs des NTDs, dans le contrôle "sous-unité spécifique" de l'activité et (2) entre les lobes inférieurs des ABDs, dans l'inhibition allostérique par le zinc. Ces travaux apportent des informations sur l'architecture moléculaire des rNMDAs et révèlent l'importance des réarrangements structuraux aux interfaces entre sous-unités voisines dans les fonctions du récepteur.

Chez les mammifères, le glutamate est un neuromédiateur bien connu au niveau du système nerveux central et plus récemment un rôle immunomodulateur lui a été reconnu. Le glutamate est le ligand de récepteurs ionotopiques (iGluRs) qui sont des récepteurs-canaux perméables à divers cations dont le calcium (non-selective cation channels, NSCC). Chez Arabidopsis thaliana, une famille de 20 gènes de iGluRs homologues des iGluRs de mammifères a été identifiée et leur implication dans divers processus biologiques est suggérée. Dans ce travail où nous utilisons des suspensions de cellules de tabac (Nicotiana tabacum var Xanthi), divers arguments suggèrent que ces iGluR sont fonctionnels dans le tabac : influx de calcium et élévation rapide et transitoire de la concentration en calcium cytosolic libre en réponse à l’addition de glutamate, inhibition de ces effets par 4 antagonistes de iGluRs animaux (compétitifs ou non compétitifs), désensibilisation, et pH dépendance des effets. Pour la première fois chez les plantes nous montrons que le glutamate induit la production de NO très vraisemblablement via l’activation de iGluRs. De plus, nous démontrons que ce(s) iGluRs sont impliqués dans le mode d’action, via les flux de calcium, de la cryptogéine une protéine de 10 kDa de Phytophthora cryptogea, éliciteur des réactions de défense chez le tabac. Néanmoins, à ce niveau, les iGluRs ne sont pas impliqués dans la plupart des événements calcium-dépendants induits par la cryptogéine dont l’activation des MAPKs et de canaux anioniques, la production de H2O2 (activation de la NADPH-oxydase) et la réponse hypersensible. En revanche, ils sont tout ou partiellement responsables de la production de NO décrite pour la première fois par le passé en réponse à la cryptogéine. Ces résultats suggèrent que différents types de canaux calciques activés par divers médiateurs, génèrent, via le calcium, des messages spécifiques décodés par des protéines associées à chacun de ces types de canaux et impliquées dans des réponses biologiques différentes. Dans le mode d’action de la cryptogéine, nous démontrons que l’activation des iGluRs est possible grâce à l’exocytose de glutamate dans l’apoplaste, induite par la cryptogéine. Ainsi, ce travail est la première démonstration du rôle de iGluRs potentiels dans la défense chez les plantes et de leur implication dans la production de NO. Nos résultats sont un argument supplémentaire à la conservation des mécanismes de la défense dans le monde vivant et posent le problème du rôle du glutamate dans la signalisation chez les plantes
Glutamate is recognized as the primary excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system (CNS) but recent studies have shown that glutamate has an important additional immunomodulator role. Glutamate is the ligand of ionotropic glutamate receptors (iGluRs), which are non-selective cation channels (NSCC), permeable to calcium. In plants, animal iGluR homologs were found that were involved in many developmental processes. Here we demonstrate the involvement of putative iGluRs in calcium signalling in response to cryptogein which is a 10 kDa protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea and is an elicitor of defence in tobacco. Using transformed tobacco cell suspensions expressing aequorin in the cytosol or in the nucleus, our results have shown that glutamate induces a strong and transient [Ca2+]cyt elevation without [Ca2+]nuc changes. Glutamate-induced [Ca2+]cyt elevation was a result of calcium influx from the extracellular medium and was inhibited by different GluR inhibitors. This data suggest the presence of functional calcium channels of GluRs-type in tobacco. Nevertheless, glutamate does not induce some of the calcium-dependent characteristic events of the defence pathways, which are H2O2 production, MAPK activation and hypersensitive response, but promoted NO production. Further, Ca2+ influx,[Ca2+]cyt elevation and NO production induced by cryptogein were shown to be partially inhibited by the glutamate receptor inhibitors, suggesting that cryptogein treatment could activate a calcium channel of the GluR-type leading to plant defense signalling through NO production. We have also demonstrated that cryptogein induces an efflux of glutamate in the apoplast by the process of exocytosis thus activating the GluRs in tobacco. This is the first demonstration for a potential GluR(s) involvement in plant defense signalling, furthermore by mechanisms that showed homology with glutamate effect on neuronal cells

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur dans le noyau du tractus solitaire (NTS), une structure sensorielle qui reçoit des afférences d'origine viscérale. Nous avons identifié dans le NTS du rat une sous-population de terminaisons glutamatergiques qui co-expriment les deux transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluT1 et VGluT2) et montré que cette population correspond à des terminaisons d'origine viscérale. Dans le NTS, la première phase de synaptogenèse se produit avant la naissance. Nous avons identifié deux autres périodes de production synaptique en période postnatale et montré qu'une partie de ces synapses formées après la naissance correspond à des synapses glutamatergiques. Nous avons ensuite étudié l'expression de la sous-unité GluR2 du récepteur AMPA et de la sous-unité NR1 du récepteur NMDA dans le NTS au cours du développement pré et postnatal. Les deux sous-unités sont présentes dans les synapses glutamatergiques au début de la synaptogenèse. La localisation de la sous-unité GluR2 ne change pas au cours de développement. Par contre, chez l'adulte la sous-unité NR1 est principalement extrasynaptique
Glutamate is the main excitatory transmitter in the nucleus tractus solitarii (NTS), a sensory relay nucleus which receives visceral afferents. We describe a subpopulation of glutamatergic axon terminals that co-express both vesicular glutamate transporters (VGluT1 and VGluT2) in the rat NTS. We show that this sub-population of terminals originate from visceral afferent fibers. Synaptogenesis in the rat NTS begins before birth. We describe two other periods of synapse formation that take place during the first postnatal month. We show that a proportion of the synapses formed after birth correspond to glutamatergic synapses. We next demonstrate that the GluR2 subunit of the AMPA receptor and the NR1 subunit of the NMDA receptor are both localized within synapses at the onset of synaptogenesis in the rat NTS. No change in localization of the GluR2 subunit occurs with development whereas, in adults, the NR1 subunit is mainly found at extrasynaptic locations

Cette thèse examine les mécanismes moléculaires et cellulaires de la dépendance à la cocaïne. Notre équipe a montré précédemment le développement du comportement induit par la cocaïne chez la souris dépend de co-activation des récepteurs du glutamate NMDA (NMDAR) et la dopamine-1 récepteurs (D1R), et la voie de signalisation ERK. Mon hypothèse était que l'interaction physique entre le D1R et NMDAR serait critique dans les adaptations induite par la cocaïne. Cette hypothèse a été confirmée, en tant qu’une co-stimulation de la D1R et NMDAR a favorisé leurs interactions physiques dans des neurones en culture. Ensuite, j'ai développé un peptide (TAT-GluN1C1) qui obstrue spécifiquement l'association des récepteurs, et j'ai trouvé que un traitement de neurones avec TAT-GluN1C1 a inhibé l'activation de la voie ERK spécifiquement en aval d’une co-stimulation de la D1R et NMDAR, mais pas lorsque l'récepteur a été stimulée individuellement. En outre, cette interaction physique a des conséquences fonctionnelles, car la dissociation des récepteurs empêché le D1R de potentialiser la transmission synaptique médiée par NMDAR dans des tranches de cerveau. In vivo, le peptide empêché sensibilisation locomotrice, l'augmentation progressive et durable des effets stimulants de la cocaïne observables comme l'activité motrice accrue, chez la souris. Au total, ces résultats démontrent pour la première fois un nouveau rôle pour les interactions physiques D1R/NMDAR dans la signalisation induite par la cocaïne, de la plasticité et adaptations comportementales à long terme que je propose sont également nécessaires à la persistance d'autres comportements associés aux drogues d’abus
This presented dissertation addresses the molecular and cellular mechanisms of cocaine addiction. Our team previously showed the development of addiction-like behaviour in mice depends on co-activation of glutamate NMDA receptors (NMDAR) and dopamine-1 receptors (D1R), and the ERK signalling pathway. My hypothesis was that the physical interaction between the D1R and NMDAR would be critical in cocaine-induced adaptations. This hypothesis was supported, as co-stimulation of the D1R and NMDAR favoured their physical interactions in cultured neurons. After I developed a peptide (TAT-GluN1C1) that specifically obstructs the association of the receptors, I found treating neurons with TAT-GluN1C1 inhibited the activation of the ERK pathway specifically downstream of co-stimulation of the D1R and NMDAR, but not when either receptor was individually stimulated. Furthermore, this physical interaction has functional consequences, as dissociation of the receptors prevented the D1R from potentiating NMDAR mediated synaptic transmission in brain slices. In vivo, the peptide prevented locomotor sensitisation, the progressive and long-lasting augmentation of cocaine’s stimulant effects observable as increased motor activity, in mice. Altogether, these results demonstrate for the first time a novel role for D1R/NMDAR physical interactions in cocaine-induced signalling, plasticity and long term behavioural adaptations that may also be necessary for the persistence of other drug-associated behaviours

Le noyau accumbens est souvent considéré comme une interface des systèmes moteurs et limbiques. Les neurones moyens épineux de ce noyau reçoivent une afférentation glutamatergique dense dont ils dépendent pour la genèse de potentiels d'action. Bien qu'un nombre croissant d'études impliquant l'activité du noyau accumbens dans les processus attentionnels, motivationnels ou les processus de récompense, les conditions physiologiques de régulation des afférences glutamatergiques sur les neurones efférents de ce noyau restent mal connues. Les autorécepteurs et le patron temporel d'activité afférent sont des acteurs essentiels de la régulation synaptique glutamatergique. L'étude de la transmission synaptique glutamatermique cortico-accumbens, par la technique du patch-clamp sur tranches aigues de cerveau de souris, nous a permis de mettre en évidence de nouveaux phénomènes de régulation de ces afférences : (1) les récepteurs kaïnate localisés au niveau présynaptique sur les afférences corticales modulent négativement la transmission glutamatergique, (2) l'augmentation tonique de l'activité de décharge synaptique facilite ou déprime la transmission glutamatergique dépendamment de la probabilité de libération initiale de la synapse, (3) l'activation des afférences corticales par des décharges en bouffées induit une augmentation cumulative de la transmission glutamatergique résultant d'une augmentation de la fiabilité de la propagation axonale des potentiels d'action, et (4) la stimulation prolongée (2 min) à 14 Hz des afférences corticales induit une potentialisation à long terme induite par l'activation de récepteurs ionotropiques du glutamate. L'ensemble de ces résultats met en évidence des phénomènes originaux permettant une régulation fine des entrées exitatrices corticales sur les neurones efférents du noyau accumbens
The nucleus accumbens forms the ventral part of the striatum. It has been proposed to serve as an interface between the limbic system and the motor system. Medium spiny neurons of the nucleus accumbens, that depend on excitatory afferents to generate action potentials, receive a dense glutamatergic innervation from the prefrontal cortex and form various limbic structures, including the hippocampal formation, the basolateral amygdala and the thalamus. Despite growing evidence that the nucleus accumbens is involved in important brain functions such as motivation, attention or reward, physiological regulation of the glutamatergic input in medium spiny neurons is still largely unknown. The efficacy of excitatory glutamatergic synaptic transmission is highly dependent on the activation of presynaptic autoreceptors and on the temporal pattern of activity of afferents. Using patch-clamp whole-cell recordings in acute slices of the mouse nucleus accumbens, we have highlighted new forms of synaptic modulation of the cortico-accumbens pathway : (1) functional presynaptic kainate receptors on cortical afferrents fibers inhibited glutamatergic synaptic transmission, (2) increase in tonic frequency stimulation of the cortical input to the nucleus accumbens induced a presynaptic facilitation or depression of the synaptic transmission depending on the initial release probability, (3) burst stimulation of cortical afferent fibers lead to a cumulative increase of the glutamatergic synaptic input through presynaptic increase in axonal reliability of action potentials propagation, and (4) sustained stimulation (14 Hz, 2 min) of cortical afferent fibers, induced long-term potentiation of glutamatergic synaptic transmission through presynaptic mechanisms and activation of ionotropic glutamate receptors. These results demonstrtate new original phenomenons that modulate cortico-accumbens glutamatergic synaptic strength in nucleus accumbens efferent neurons

Cette thèse a été réalisée sur des tranches fines de cervelet de rat ou souris, maintenues en survie in vitro, en utilisant la technique de patch clamp ainsi que des mesures de calcium par fluorométrie. Nous avons tout d'abord démontré la modulation par des facteurs purement pré-synaptiques de la dépression synaptique à long terme (DLT) entre fibres parallèles (FPs) et cellules de Purkinje (CPs) dans le cervelet de rongeur, phénomène jusqu'alors considéré comme essentiellement post-synaptique. Nous avons en effet montré que l'activation des récepteurs cannabinoides CB1, situés sur les terminaisons des FPs, entraîne une diminution de la probabilité de libération du glutamate (PR) par ces fibres ainsi qu'une diminution de l'amplitude de la DLT aux synapses FPs/CPs. Cette réduction d'amplitude de la DLT est également observée en présence d'autre facteurs qui diminuent eux aussi Pr aux terminaisons des FPs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons étudié les mécanismes mis en jeu lors de l'activation des récepteurs métabotropiques du glutamate de type I (mGluR1) qui sont impliqués dans l'induction de la DLT. Bien qu'ils soient post-synaptiques, l'activation de ces récepteurs entraîne paradoxalement des modifications pré-synaptiques. Nous avons démontré que l'activation des récepteurs mGluR1 sur les CPs provoque des augmentations de calcium pré-synaptique au niveau des fibres parallèles. Le profil pharmacologique de ces augmentations de calcium pré-synaptiques, ainsi que les effets des agonistes de mGluR1 sur les courants excitateurs enregistrés dans les CPs indiquent que ces cellules libèrent du glutamate quand les récepteurs mGluR1 qu'elles expriment sont activés. Ce glutamate active alors de façon rétrograde des récepteurs ionotropiques situés sur les FPs. Cet effet rétrograde pré-synaptique est à l'origine de la dépression des réponses synaptiques entre CPs et FPs qui est observée lors de l'activation de mGluR1. Enfin, au cours de cette thèse, une souris transgénique déficient en récepteurs mGluR1 a été utilisée, nous discutons avec l'exemple des deux dernières publications présentées dans ce manuscrit, les limites de l'utilisation de la technique de transgénèse à l'étude des fonctions d'un récepteur
Résumé anglais (idem)

Chez la drosophile, le glutamate est un neurotransmetteur à la jonction neuromusculaire (JNM) et dans le système nerveux central (SNC). Nous avons étudié les homologues des transporteurs de recapture (EAAT) et des transporteurs vésiculaires (VGLUT) du glutamate chez cet insecte. DEAAT1 est un transporteur de glutamate de la famille EAAT. Dans le SNC et à la JNM, il est exprimé par des cellules gliales associées aux synapses. L'inactivation de dEAAT1 induit un allongement de la durée du potentiel de muscle, une baisse de la durée de vie, une sensibilité accrue au stress oxydant, une dégénérescence des neurites. DEAAT1 intervient donc dans l'élimination du neurotransmetteur et la prévention de la neurotoxicité du glutamate. DVGLUT code pour un VGLUT. Il est présent à la JNM et dans les neuropiles du SNC. DVGLUT constitue un marqueur des synapses glutamatergiques du SNC de drosophile. L'étendue de son expression suggère que le glutamate est un neurotransmetteur majeur chez la drosophile
In Drosophila, glutamate is the neurotransmitter at neuromuscular junctions (NMJ) and in the central nervous system (CNS). We studied Drosophila homologues of genes coding for re-uptake glutamate transporters (EAAT) and vesicular glutamate transporters (VGLUT). DEAAT1, the only EAAT Drosophila glutamate transporter, is expressed in glial extensions that project in the neuropil. Inactivation of dEAAT1 by RNA interference led to increased duration of muscle potential, behavior deficits, shortened life span, increased sensitivity to oxidative stress and neuropil degeneration. These results demonstrate that dEAAT1 participates to the removal of glutamate at synapses, and prevent glutamate-induced neurotoxicity. We isolated DVGLUT a VGLUT gene. DVGLUT represented the first available marker of central glutamatergic synapses. Surprisingly, DVGLUT positive glutamatergic synapses were found in high abundance in the CNS. This suggests that glutamate is a major neurotransmitter in the Drosophila

La circulation des récepteurs au glutamate entre les trois compartiments cellulaires, que sont les membranes synaptiques, extra-synaptiques, et le cytoplasme, joue un rôle crucial dans l'activité synaptique. Récemment encore, les études s'intéressaient seulement aux processus d'endocytose, d'exocytose, et à la diffusion latérale des récepteurs extra-synaptiques. La microscopie de fluorescence de molécules uniques permet de suivre les récepteurs sur toute la surface des neurones. Le suivi des GluR2, sous unité des récepteurs au glutamate de type AMPA, à la surface de neurones vivants, a montré que la structure synaptique est dynamique, et que les phénomènes de plasticité post-synaptique sont corrélés avec des modifications de l'état diffusif des récepteurs synaptiques. Afin d'accéder à la stoechiométrie du nombre de récepteurs assemblés, dans des zones telles que la synapse ou les vésicules, une méthode de quantification robuste et applicable à des assemblées de protéines de taille quelconque est mise au point. La durée de suivi des biomolécules, en microscopie de molécules uniques, est limitée par la photoblanchiment rapide de fluorophores. Pour y remédier, une nouvelle technique de visualisation, basée sur l'effet photothermique, a été développée et appliquée à l'imagerie de systèmes biologiques.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central (SNC). Les transmissions glutamatergiques jouent un rôle majeur dans certains aspects du développement du SNC, en particulier la migration, la différenciation et la plasticité des circuits neuronaux. L’activation physiologique du récepteur sensible au N-Méthyl-D-Aspartate (R-NMDA) est particulièrement impliquée dans les effets développementaux du glutamate. De ce fait, un blocage ou une activation excessive de ce récepteur peut conduire à des dommages cellulaires. Le R-NMDA est un récepteur ionotrope hétérotétramérique perméable aux cations largement exprimé dans le SNC et constitué de différentes sous-unités (GluN1, GluN2A-D et GluN3A-B). Dans le cortex, il est composé de deux sous-unités GluN1 obligatoires liant le co-agoniste, glycine ou D-sérine, associées majoritairement à des sous-unités GluN2A et/ou GluN2B, liant le glutamate. La composition en sous-unités GluN2 du R-NMDA, donne au récepteur des propriétés pharmacologiques et électrophysiologiques distinctes. De plus, les R-NMDA contenant la sous-unité GluN2A seraient impliqués dans la survie cellulaire et ceux comportant la sous-unité GluN2B seraient impliqués dans la mort cellulaire. Les protéines PDZ, appartenant à la famille des MAGUK (membrane-associated guanylate kinase), notamment PSD95 (postsynaptic density 95) et SAP102 (synapse associated protein 102) interagissent avec les R-NMDA et jouent un rôle dans leur stabilisation membranaire. Récemment, il a été montré que l’interaction GluN2A/PSD95 jouait un rôle dans la maturation synaptique. Des agents pharmacologiques utilisés en anesthésie, comme la kétamine, sont des antagonistes du R-NMDA. Cet anesthésique présentant de nombreux avantages cliniques (faible impact sur les fonctions respiratoires et cardiaques), est utilisé en pédiatrie dans le but de sédater lors de gestes médicaux de courte durée. Cependant, plusieurs études expérimentales mettent en cause l’innocuité de l’utilisation de la kétamine. En effet, l’administration de kétamine entraîne une augmentation de la mort cellulaire apoptotique dans le cortex cérébral de souris nouveau-née. Par ailleurs, une étude récente du laboratoire a montré ex vivo dans le cortex de souris âgée de 2 jours, que la kétamine induit des effets différents sur la survie cellulaire selon les couches corticales considérées. Dans le cadre de cette thèse, dans une première partie, nous avons réalisé une étude comparative des conséquences de l’administration de kétamine in vivo, chez la souris nouveau-née (40 mg/kg s. C), en fonction de l’âge auquel celle-ci est injectée (jours postnataux 2, 5 ou 10). - A court terme, nous avons mesuré l’effet sur le développement cortical post-natal du R-NMDA et sur son association aux MAGUK. - A long terme, nous avons évalué l’impact de la kétamine administrée à différents âges postnataux, sur l’activité motrice mesurée à l’âge adulte dans deux contextes différents. Vingt-quatre heures après l’injection de kétamine, l’expression des protéines GluN2A et GluN2B est diminuée lorsque le traitement est réalisé respectivement à P5 ou P10. Après immunoprécipitation de la protéine d’adressage membranaire PSD95, la révélation par western blot indique que quelque soit l’âge du traitement, la kétamine entraîne une diminution de l’association de la sous-unité GluN2A à PSD95, tandis que le complexe GluN2B/PSD95 est augmenté uniquement lorsque le traitement est réalisé à P5. A ce stade, cette perturbation de l’expression des sous-unités GluN2A et GluN2B est associée à une diminution de la phosphorylation de ERK1/2 et une augmentation de la protéine nNOS liée à PSD95 et GluN2B. L’ensemble de ces résultats indique donc que la kétamine altère le profil développemental des sous-unités du R-NMDA, suggérant un retard dans la maturation synaptique. De plus, à P5, le traitement a des répercussions fonctionnelles sur les cascades de signalisation intracellulaire. La microdissection laser réalisée sur le cortex de souris contrôles, révèle une hétérogénéité de répartition des sous-unités du R-NMDA entre les couches corticales superficielles immatures (I-IV) et les couches corticales profondes matures (V-VI). La kétamine perturbe ce profil, en diminuant la sous-unité GluN2A dans les couches superficielles chez la souris traitée à P5 et en augmentant les sous-unités GluN1, GluN2A et GluN2B dans les couches profondes lorsque le traitement est réalisé à P10. A plus long terme, l’administration de kétamine à P2 ou P10 entraîne une hyperlocomotion en open-field, chez les souris mâles devenues adultes, sans aucun effet chez les femelles. La mesure de l’activité motrice volontaire durant 72 h dans une roue d’activité placée dans une cage de vie, révèle des altérations induites à l’âge adulte par la kétamine administrée en période périnatale, dépendantes de l’âge et du sexe. En conclusion, de cette première partie de thèse, une seule injection de kétamine quelque que soit l’âge de traitement en période périnatale, entraîne des modifications du profil développemental du R-NMDA à court terme et des altérations de l’activité motrice persistant à l’âge adulte. En dépit des progrès réalisés en obstétrique et en néonatologie, les lésions cérébrales du nouveau-né restent fréquentes (2 à 2,5 enfants pour 1000 naissances). Elles constituent la principale cause de décès et de handicaps moteurs acquis en période périnatale. De nombreux facteurs de risque sont identifiés, tels que la prématurité, les accidents hypoxo-ischémiques, les infections foeto-placentaires, les déficits hormonaux et les facteurs toxiques (alcool, drogues). Une activation excessive de la transmission glutamatergique est souvent à l’origine de lésions acquises en période périnatale. L’excès de glutamate entraîne une suractivation de ses récepteurs dont le R-NMDA, aboutissant in fine à la mort cellulaire par apoptose et/ou nécrose. La proximité des microvaisseaux cérébraux avec les cellules neurales et la présence de R-NMDA fonctionnels sur les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (CEMC) suggèrent une influence particulière des CEMC sur les neurones corticaux lors de phénomènes excitotoxiques. Les concentrations synaptiques de glutamate sont régulées grâce à des transporteurs ATP-dépendants, présents à la membrane des cellules gliales et des neurones. Cinq types de transporteurs sont connus (excitatory amino acid transporters ; EAAT) : les EAAT-1 et -2 sont principalement exprimés par les astrocytes et les EAAT-3 et -4 sont préférentiellement exprimés par les neurones. Récemment, il a été démontré que les EAAT-1, -2 et -3 étaient également exprimés par les cellules endothéliales vasculaires adultes, suggérant ainsi un rôle de l’endothélium dans le contrôle des concentrations extracellulaires de glutamate. Cependant, une étude récente effectuée dans notre laboratoire, montre des différences de sensibilité au glutamate entre les CEMC murines néonatales et adultes. Ainsi, dans le cadre de cette thèse, dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l’expression des EAAT-1, -2 et -3 au sein des microvaisseaux corticaux de souris nouveau-nées et adultes, ainsi qu’à la capacité de recapture du glutamate par les CEMC. Nous avons montré que l’expression des EAAT-1, -2 et -3 au sein de l’endothélium cérébral était plus importante chez l’adulte que chez le nouveau-né et que la capacité de recapture du glutamate par les CEMC était plus efficace chez l’adulte que chez le nouveau-né. Cette étude indique donc qu’il existe une régulation du glutamate extracellulaire par les cellules endothéliales et que cette régulation dépend de l’âge
Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system (CNS). Glutamatergic transmission plays an important role in CNS development, including migration, differentiation and synaptic plasticity. Physiological activation of N-Methyl-D-Aspartate receptor (NMDA-R) is particularly involved in the developmental effects of glutamate. Therefore, a blocking or excessive activation of NMDA-R affects the cerebral development and particularly leads to cell death in neonate cortex. NMDA-R is a heterotetrameric ionotropic receptor, permeable to cations, widely expressed in the CNS and composed of different subunits (GluN1, GluN2A-D, GluN3A-B). In the cortex, it is composed of two obligatory GluN1 subunits which link the co-agonist, glycine or D -serine, mainly associated with GluN2A and/or GluN2B subunits which bind glutamate. GluN2 subunit composition of NMDA-R gives distinct pharmacological and electrophysiological properties. Moreover, GluN2A-containing NMDA-R are involved in cell survival and those containing GluN2B are involved in cell death. PDZ proteins, member of membrane-associated guanylate kinase family (MAGUK), including PSD95 (postsynaptic density 95) and SAP102 (synapse associated protein 102) interact with NMDA-R and play an important role in their membrane stabilization. Recently, it has been shown that GluN2A/PSD95 association played a role in synaptic maturation. Pharmacological agents used for anesthesia, such as ketamine, act as NMDA-R antagonists. This anesthetic with many clinical advantages (low impact on respiratory and cardiac functions) is used in pediatrics in order to sedate during short duration medical procedures. However, several experimental studies discussed the safety of the use of ketamine. Indeed, ketamine administration causes an increase in apoptotic cell death in the cerebral cortex of newborn mice. Moreover, a recent laboratory study showed, ex vivo, in the cortex of mice aged 2 days, that ketamine induced different effects on cell survival depending on cortical layers considered. In a first study, we conducted a comparative study of the effects of ketamine administration in vivo, in newborn mice (40 mg / kg sc), depending on the age at which this anesthetic was injected (postnatal days 2, 5 or 10). In the short term, we measured the ketamine effect on the cortical NMDA-R postnatal development and its association with MAGUK. In the long term, we evaluated the impact of ketamine administered at different postnatal ages, on motor activity measured in adulthood in two different contexts. Twenty-four hours after ketamine injection, GluN2B and GluN2A protein expression was decreased when the treatment was carried out at P5 and P10 respectively. After immunoprecipitation of scaffolding PSD95 protein, western blot revelation indicated that regardless of the age treatment, ketamine caused a reduction of the association of GluN2A subunit to PSD95, while the complex GluN2B/PSD95 was increased only when the treatment was performed at P5. At this stage, the disruption of GluN2A and GluN2B subunits expression was associated with a decrease in ERK1/2 phosphorylation and an increase in nNOS association with GluN2B/PSD95 protein complex. All these results therefore indicate that ketamine alter the developmental profile of NMDA-R subunits, suggesting a delay in synaptic maturation. In addition, at P5, ketamine treatment has functional impacts on intracellular signaling cascades. Laser microdissection on control mice cortex revealed a heterogeneous distribution of NMDA-R subunits between immature superficial cortical layers (I-IV ) and the mature deep cortical layers (V-VI). Ketamine disrupted this profile by decreasing GluN2A subunit expression in the superficial layers in P5-treated mice and increasing GluN1, GluN2A and GluN2B subunits in the deep layers when the treatment was performed at P10. In the long term, ketamine administration at P2 or P10 caused hyperlocomotion in an open field in adult males, with no effect in adult females. The measurement of voluntary motor activity during 72 h in a running-wheel placed in a life cage, revealed alterations in adulthood induced by ketamine administered in the perinatal period, dependent on age and sex. In conclusion of this first part of the thesis, a single injection of ketamine, whatever the age of treatment in the perinatal period, resulted in changes in the NMDA-R developmental profile in the short-term and alterations in motor activity persisting in adulthood. Despite the progress of obstetrics and neonatal reanimation, brain injury in newborns remain frequent (2 to 2. 5 children per 1000 births). They form the first cause of death or disability acquired in the perinatal period. Many risk factors are identified, such as prematurity, hypoxo-ischemic injuries, fetal-placental infections, hormonal deficiencies and toxic factors (alcohol, drugs). Excessive activation of glutamatergic transmission is frequently the cause of perinatally acquired lesions. Excess of glutamate leads to overactivation of its receptors including NMDA-R, leading to cell death by apoptosis and/or necrosis. The proximity of brain microvessels with neural cells and the presence of functional NMDA-R on brain microvascular endothelial cells (BMEC) suggest a particular influence of BMEC on cortical neurons during excitotoxic stress. Synaptic glutamate concentrations are regulated by ATP-dependent transporters, present in the membrane of glial cells and neurons. Five transporters subtypes are known (excitatory amino acid transporters; EAAT): EAAT1 and -2 are primarily expressed by astrocytes and EAAT3 and -4 are preferentialy expressed by neurons. Recently, it has been shown that EAAT1, -2 and -3 were also expressed by adult vascular endothelial cells, suggesting a role of endothelium in the control of extracellular glutamate concentrations. However, a recent laboratory study showed differences in glutamate sensibility between neonatal and adult murine BMEC. In a second study, we studied the expression of EAAT1, -2 and -3 in cortical microvessels of newborn and adult mice, as well as efficiency of glutamate uptake by BMEC. We showed that EAAT1, -2 and -3 expression in brain endothelium was greater in adults than in neonates, as well as the efficiency of glutamate uptake by BEMC. In conclusion of this second part of the thesis, this study indicates that there is a regulation of extracellular glutamate by endothelial cells and this control depends on the age. Low expression of EAAT in immature vascular endothelium could contribute to a particular sensitivity of newborn brain during excitotoxic stress in mice. In conclusion, this thesis contributed to characterize the specificity of glutamatergic transmission in the immature brain. Our results play in favor of special consideration of molecules interacting with glutamatergic transmission such as anesthetics in the perinatal period

Les substances addictives détournent les apprentissages par la récompense en augmentant la dopamine (DA) dans le système mésolimbique, en particulier dans le striatum, où elle module durablement la transmission glutamatergique excitatrice et contribue à la mise en place d’altérations comportementales persistantes. L’intégration des signaux dopaminergique et glutamatergique au sein du striatum est réalisée par les neurones moyen épineux du striatum (MSN), qui forment deux populations majoritairement distinctes : les MSN de la « voie directe » exprimant les récepteurs D1 de la DA (D1R-MSN) et ceux de la « voie indirecte » qui expriment les récepteurs D2 de la DA (D2R-MSN). Une hypothèse qui prévaut à l’heure actuelle est que la libération de DA induite par les drogues active les D1R-MSN, ce qui promeut le renforcement, alors qu’elle inhibe les D2R-MSN, diminuant ainsi leurs fonctions « anti-renforcement ». Les travaux du laboratoire ont montré que l’interaction physique (i.e. hétéromérisation) entre le D1R et le récepteur NMDA (NMDAR) du glutamate était nécessaire à la facilitation de la transmission glutamatergique par la DA dans les D1R-MSN. À l'inverse, d'autres travaux ont montré que l'interaction D2R / NMDAR sous-tend l'effet inhibiteur de DA sur la signalisation NMDAR dans les D2R-MSN. Toutefois, la modulation et la fonction de ces hétéromères in vivo dans les réponses induites par la cocaïne sont encore inconnues. À l'aide du test de « proximity ligation assay », nous avons montré que la sensibilisation locomotrice induite par des expositions répétées à la cocaïne est associée à la formation d'hétéromères D1R/NMDAR dans le Noyau Accumbens (NAc) et le Striatum Dorsal, tandis que l'hétéromérisation D2R/GluN2B est majoritairement observée au sein du NAc. Pour identifier les rôles des hétéromères DAR / NMDAR dans les différentes phases des adaptations moléculaires, morphologiques et comportementales induites par la cocaïne in vivo, nous avons conçu une approche virale pour perturber les hétéromères DAR / NMDAR de manière contrôlée dans le temps grâce à un promoteur dépendant de la doxycycline. Nous avons constaté que la perturbation de l'interaction D1R / NMDAR dans le NAc bloque la mise en place des altérations synaptiques induites par la cocaïne dans les D1R-MSN ainsi que le développement de la sensibilisation locomotrice et de la préférence de lieu conditionné par la cocaïne (CPP). A l’inverse, le blocage de l'interaction D2R / NMDAR interfère avec le maintien de la sensibilisation psychomotrice et de la CPP à la cocaïne. L’observation d’un rôle préférentiel des hétéromères D2R/GluN2B dans la maintenance des réponses comportementales à la cocaïne et leur absence d’effet dans le cas d’une récompense naturelle suggèrent que ce sous-type d’hétéromère pourrait être une cible thérapeutique à envisager. J’ai donc mis au point la détection des complexes D2R / NMDAR à partir des tissus striataux humains post-mortem issus d’individus avec un historique de dépendance aux psychostimulants ou des sujets sains. Ceci m’a permis de montrer, qu’en dépit d’une forte baisse de l’expression du D2R, la proportion de D2R formant des hétéromères avec les NMDAR est trois fois supérieure chez les sujets dépendants par rapport au sujets sains. Ce travail renforce donc les évidences en faveur d’un rôle central des interactions entre les systèmes dopaminergique et glutamatergiques dans les réponses aux drogues et identifie les hétéromères DAR / NMDAR comme des cibles moléculaires avec un potentiel thérapeutique non seulement dans la dépendance aux drogues mais également pour les nombreux troubles psychiatriques associés à un déséquilibre entre les transmissions dopaminergiques et du glutamatergiques
Addictive substances hijack reward-dependent learning by increasing dopamine (DA) in the mesolimbic system, in particular in the striatum, where it modulates durably excitatory glutamatergic transmission and contributes to the establishment of persistent behavioral alterations. The integration of dopaminergic and glutamatergic signals within the striatum is achieved by the medium-size spiny neurons of the striatum (MSN), which form two mostly segregated populations: the MSN of the "direct pathway" expressing DA D1 receptors (D1R-MSN) and those of the "indirect pathway" which express the DA D2 receptors (D2R-MSN). A prevailing hypothesis is that the surge of DA evoked by drugs of abuse facilitates D1R-MSN activation through the stimulation of D1R, which promotes reinforcement, whereas the D2R-mediated inhibition of D2R-MSN prevent their so-called anti-reward action. Our laboratory has previously shown that the physical interaction (i.e. heteromerization) between D1R and the NMDA glutamate receptor (NMDAR) was necessary for the facilitation of glutamatergic transmission by DA in D1R-MSN. Conversely, others have shown that the D2R/NMDAR interaction underlies the inhibitory effect of DA on NMDAR signaling in D2R-MSN.However, the modulation and function of these heteromers in vivo in responses to cocaine are still unknown. Using the “proximity ligation assay” technique, we found that locomotor sensitization induced by repeated exposure to cocaine is associated with the formation of D1R/NMDAR heteromers in the Nucleus Accumbens (NAc) and the Dorsal Striatum, while the D2R/GluN2B heteromerization is mainly observed within the NAc. To identify the roles of the DAR/NMDAR heteromers in the different phases of the molecular, morphological and behavioral adaptations induced by cocaine in vivo, we designed a viral-based approach to disrupt the DAR/NMDAR heteromers in a controlled manner over time owing to a doxycycline-dependent promoter. We found that the disruption of the D1R/NMDAR interaction in the NAc blocks cocaine-evoked long-term synaptic plasticity in D1R-MSN and the development of both psychomotor sensitization and conditioned place preference (CPP). By contrast, blocking the D2R/NMDAR interaction interferes with the maintenance of cocaine psychomotor sensitization and CPP. The observation of a preferential involvement of the D2R/GluN2B heteromers in the maintenance of behavioral responses to cocaine and their lack of effect in natural reward suggests that this subtype of heteromers could be a promising therapeutic target. Based on this hypothesis, we developed the detection of D2R/NMDAR complexes from human post-mortem striatal tissues prepared from individuals with a history of psychostimulants dependence or healthy subjects. This allowed us to show that, despite a sharp decrease in D2R expression, the proportion of D2R forming heteromers with NMDAR is three-fold higher in addict subjects compared to healthy controls. This work therefore reinforces the evidence of the central role of interactions between the dopaminergic and glutamatergic systems in drug responses and identifies the DAR/NMDAR heteromers as molecular targets with therapeutic potential not only in addiction but also for the numerous psychiatric disorders associated with an imbalance between dopaminergic and glutamatergic transmissions

Les astrocytes ont un rôle crucial dans la modulation de l'activité neuronale contrôlant la concentration extracellulaire de glutamate grâce à des transporteurs à haute affinité et secondairement dépendants de l'ATP. Dans des conditions de crise énergétique majeure comme dans l'hypoxie/ischémie (HI), la recapture de glutamate est stoppée voire même inversée, induisant une élévation de la concentration extracellulaire de glutamate. Mes travaux de thèse montrent que l'inversion de la recapture astrocytaire de glutamate induite pas le PDC dans des cultures mixtes corticales murines de neurones et d'astrocytes conduit à une mort neuronale massive, impliquant les récepteurs NMDA extrasynaptiques, une altération du potentiel membranaire mitochondrial et l'extinction de la voie de signalisation ERK 1&2. Parallélement, une privation en oxygène et en glucose (OGD, modèle HI) de 3 heures induit la mort oxydative et apoptotique s'astrocytes striataux différenciés murins ne leur permettant plus de synthétiser le glutathion, antioxydant majeur du SNC des Mammifères. Au contraire, des astrocytes indifférenciés résistent à 3h d'OGD mais présentent transitoirement un phénotype Alzheimer type II observé dans le cerveau humain périnatal ischémié. Des neurones stratiaux naïfs en coculture pendant 3 jours avec les astrocytes différenciés soumis à 3h d'OGD semblent paradoxalement plus viables qu'en coculture avec les indifférenciés. Ceci pourrait s'expliquer par une libération de glutamate par les astrocytes indifférenciés pouvant activer les R. NMDA extrasynaptiques neuronaux et déclencher la mort neuronale. Ces résultats illustrent que les astrocytes peuvent répondre différemment à une HI, modulant de façon différentielle la viabilité des neurones
Astrocytes have a crucial function in modulating neuronal activity especially in glutamatergic synapse where they tightly control transmission through sodium and secondarily ATP dependent-high affinity glutamate transporters. In hypoxic/ischemic (HI) conditions a major energetic crisis takes place and glutamate uptake has been shown to be stopped and aven reversed leading to extracellular glutamate concentration increase. My thesis results show that reverse glial glutamate uptake pharmacologically induced by PDC triggers neuronal death through extrasynaptic NMDA receptor induced calcium entry, neuronal mitochondrial membrane potential impairment and a shut off of the neurotrophic ERK 1/2 signaling pathway. This neuronal death wa rapid and necrotic. Using an oxygen and glucose deprivation model (OGD, HI model in vitro) we evidenced the oxidative and apoptotic death of differentiated (quiescent) murine striatal astrocytes 3 days after 3h-OGD. This death war correlated with a decreased capacity to synthetise glutathione the main antioxidant of the mamml CNS. By the same time, undifferentiated striatal astrocytes were resistant to 3h-OGD but changed transiently their morphology to Alzheimer type II astrocytes, a phenotype commonly observed in perinatal ischemic humain brain. Viability of striatal naïve neurons in coculture with differentiated astrocytes seemed to be higher than in coculture with undifferentiated ones. This could be explained by glutathione release from apoptotic astrocytes during the coculture, which can be neuroprotective. On the other hand a presumed glutamate release from undifferentiated astrocytes may activate extrasynaptic NMDA receptors and tigger neuronal death. These data illustrate that astrocytes may display different responses to HI insult thus conditioning neuronal

Les récepteurs métabotropiques au glutamate (mGluR), qui appartiennent à la classe C des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont bien connus pour leurs rôles importants dans les troubles neurologiques et psychiatriques. La compréhension de leur mécanisme d’activation est essentielle pour la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques. Récemment, le nombre de structures de RCPG cristallisées a augmenté de façon exponentielle grâce à l'application des méthodes de stabilisation de la protéine. Cependant, certaines ambiguïtés et incohérences ont été révélées au cours des études cristallographiques. En outre, des études en molécules uniques, y compris par transfert d'énergie d’excitation électronique de Förster (smFRET), ont montré la nature très dynamique des RCPG en général, et du domaine d’activation de mGluR en particulier. Ici, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'activation des mGluR entiers en utilisant des techniques de FRET d’ensemble et sur molécules uniques. Les techniques de HTRF ont permis l’optimisation de la préparation des échantillons. Un protocole a été mis au point, permettant d'extraire les mGlu2 entiers dans du détergent, à partir de cellules HEK293T, sans affecter de manière importante la pharmacologie et de la stabilité des récepteurs. Les expériences de FRET en molécules uniques ont été effectuées avec la technique MFD-PIE. Une analyse poussée de ces données, par mesure de l'efficacité de FRET ratiométrique, de durée de vie des fluorophores dans l’état excité, et d’analyse en corrélation (FCS), ont permis de montrer un changement conformationel rapide (sub-milliseconde) des récepteurs mGlu2 entiers. Par ailleurs, le rôle de stabilisation du domaine transmembranaire en faveur de l’état actif a été prouvé
Metabotropic glutamate receptors (mGluR), which belong to class C of G protein-coupled receptors (GPCR), are well-known for their important roles in neurological and psychiatric disorders. Understanding of receptor activation is essential to decipher the receptor functioning, and thus orientate drugs design for targeted therapeutics. Recently, the number of GPCR crystal structures has increased exponentially thanks to the application of protein stabilization methods. However, these crystallography studies have revealed certain ambiguities and discrepancies, and these approaches do not take into account the dynamic nature of GPCR activation. Indeed, single-molecule studies, including single-molecule FRET (smFRET), have revealed the highly dynamic nature of GPCR in general, and fast conformational changes of mGluR domains in particular. Here, we study the activation mechanism of the full-length mGluR by FRET techniques at ensemble and single-molecule level. Homogenous time-resolved fluorescence (HTRF) was applied for optimizing the sample preparation. An appropriate protocol was established, allowing to extract mGlu2 full-length in detergent from the HEK293T cells without significantly affecting its pharmacology and stability. smFRET experiments were performed using the combination of multiparameter fluorescence detection (MFD) with pulsed interleaved excitation (PIE). Advanced data analysis such as ratiometric FRET efficiency, lifetime-based FRET measurement, and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) revealed that the fast dynamic oscillation in sub-millisecond timescale of the full-length mGlu2, and prove the stabilization role of the transmembrane domain of the full-length receptor in favor of the active state

La synapse glutamatergique est formée par une présynapse axonale et une postsynapse dont le support est l'épine dendritique. L'épine présente des récepteurs membranaires du glutamate liés à des protéines d'échafaudage sous-membranaires. Ces protéines de la densité postsynaptique (PSD) permettent de relier les récepteurs à leurs voies de signalisation. Les récepteurs NMDA sont reliés aux récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR1/5) via le complexe PSD95/GKAP/Shank/Homer. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé la dynamique d'interactions protéiques au sein de ce complexe et étudié les conséquences fonctionnelles sur l'activité des récepteurs.Homer est une protéine multimérique reliant mGluR5 au complexe PSD95/GKAP/Shank. La forme monomérique Homer1a est incapable de relier mGluR5 à Shank. Nous avons montré que la rupture du complexe par l'expression de Homer1a permet une interaction directe entre les récepteurs NMDA et mGluR5 et une inhibition des courants NMDA. Nous avons validé que ce processus intervient lors de la potentialisation synaptique. J'ai également étudié le rôle de l'interaction entre GKAP et DLC2, une chaîne légère de transporteurs moléculaires. Après avoir caractérisé l'occurrence et la dynamique de l'interaction GKAP-DLC2, j'ai montré que l'activité neuronale entraîne une augmentation de cette interaction et une accumulation synaptique de GKAP. De plus, cette interaction permet d'acheminer PSD95 dans les épines et d'augmenter les courants NMDA. L'ensemble de ces résultats montre que les protéines d'échafaudage participent à la signalisation des récepteurs, modulent la transmission synaptique et sous-tendent les mécanismes de plasticité à long terme
The glutamatergic synapse is composed by an axonal presynapse and a postsynapse which is supported by a dendritic spine. The spine contains membrane glutamatergic receptors connected to sub-membrane scaffolding proteins. These postsynaptic density (PSD) proteins allow to link receptors to their signaling pathways. NMDA receptors are associated to metabotropic glutamate receptors (mGluR1/5) through the PSD95/GKAP/Shank/Homer protein complex. During my PhD, I have characterized protein-protein interactions dynamic in this complex and studied functional consequences on receptor activity.Homer is a multimeric protein linking mGluR5 to the PSD95/GKAP/Shank complex. The monomeric form Homer1a is unable to connect mGluR5 to Shank. We have shown that complex disruption by Homer1a expression induces a direct interaction between NMDA and mGluR5 and subsequent inhibition of NMDA currents. We have shown that this process occurs during synaptic potentiation.I have also studied the interaction between GKAP and DLC2, a light chain shared by molecular transporters. I have characterized the occurrence and dynamic of GKAP-DLC2 interaction and shown that neuronal activity increases this interaction leading to synaptic accumulation of GKAP. Moreover, this interaction allows PSD95 targeting into dendritic spines and NMDA currents increase. Together, these results show that scaffolding proteins participate to receptor signaling, modulate synaptic transmission and underlie long-term synaptic plasticity mechanisms